分子標記物1p/19q熒光原位雜交圖像中細胞自動計數和標記方法*

楊雙

(桂林航天工業學院 電子信息與自動化學院,廣西 桂林 541004)

近年來,分子標志物在膠質瘤診斷中的應用越來越廣泛。常用于腦膠質瘤診斷的分子標記物主要包括IDH1/2、TERT、1p/19q等[1]。其中1p/19q共缺失狀態實際上是對一種染色體變異的描述,具體是指1號染色體短臂和19號染色體長臂同時缺失。1p/19q共缺失最早發現于少突膠質細胞瘤樣本中,在少突膠質細胞瘤中的發生率為80%～90%。2016年WHO最新分布的中樞神經系統腫瘤分類中,把少突膠質細胞瘤分為少突膠質細胞瘤(WHO-II級)及間變性少突膠質細胞瘤(WHO-Ⅲ級),又根據有無IDH1/2基因突變和1p/19q的缺失,把少突膠質細胞瘤和間變性少突膠質細胞瘤分為IDH突變型、1p/19q缺失型及未另行說明型[2-3]。同時,中國膠質瘤診療共識和NCCN指南中都已經明確納入了1p/19q共缺失指標。因此,檢測1p/19q是否共缺失在診斷少突膠質細胞瘤及判斷患者預后方面有著重要意義[4-6]。

目前實驗室檢測1p/19q共缺失狀態的方法主要有熒光原位雜交(fluorescent in situhybridization,FISH)[7]、基于雜合性缺失分析的聚合酶鏈式反應(PCR)[8]、陣列比較基因組雜交(CGH)和二代測序(NGS)[9]。其中使用熒光原位雜交(FISH)方法進行檢測的方法檢測成本較低,在臨床診療中易于實現,是大多數醫療機構所采用的檢測方式。該方法具體的主要檢測原理是:1p/19q 缺失探針采用橘紅色染料標記1號染色體短臂p36區域,采用綠色染料標記1號染色體長臂q25區域;采用橘紅色染料標記19號染色體長臂q13區域,采用綠色染料標記19號染色體短臂p13區域[10],所獲得的熒光原位雜交圖像如圖1所示。

在臨床診療中,對于1p/19q熒光原位染色圖進行細胞計數及細胞上紅、綠點進行計數,并統計一定量細胞中紅綠點的比例,再根據1p/19q的判定準則獲取1p/19q共缺失的狀態[11]。這一過程主要由病理科醫生人工計數和統計,由于計數量較大,FISH圖像的成像質量參差不一,細胞粘連情況普遍發生,因而這項工作的人工成本較大,工作效率不高。

近年來,由于計算機輔助診療的應用,對于臨床醫療中復雜度較高,識別難度較大的工作希望能借助計算機的計算能力和數字圖像處理能力來實現,以期在提高醫生工作效率的同時,提升疾病的診斷效率和正確率。鑒于此,利用數字圖像處理對1p/19q熒光原位染色圖像進行細胞的自動計數工作具有較高的臨床醫療輔助意義。

圖1 1p/19q原位熒光染色圖示例

由于大多數的熒光染色圖像中,藍色通道的圖像是細胞圖像結果,現有的針對熒光染色圖像中細胞的計數工作通常將圖像中細胞分割后再進行聚類統計的方法來進行計數。這類操作主要采取的步驟是:首先分離熒光染色圖像的藍色通道,即RGB通道中的B通道。對藍色通道的圖像進行二值化處理和形態學處理(例如:孔填充、偽影去除等操作),再利用聚類算法進行聚類,得到初步的細胞區域,最后通過相應的非橢圓形和邊界區域抑制操作后進行細胞核計數[12]。

但是,根據圖1中的1p/19q 圖像示例,可以獲知,細胞常常存在團簇粘連現象,單獨分離的細胞并不多見,由于多個細胞粘連在一起,通過上述操作后往往存在團簇細胞無法分離的現象,這就導致了細胞自動計數的誤判率較高,間接導致了最終的1p/19q共缺失狀態診斷誤差。這種粘連的情況如圖2所示,其中 圖2(a)圖展示了1p FISH 原始圖像,圖2(b)圖則展示了該圖像的B通道所對應的經過二值化、形態學處理后的圖像,圖中矩形框標注區域可以發現多處細胞粘連情況,難以獲得準確的細胞數量[13]。

圖2 1p FISH圖像經二值化、形態學處理后圖像示例

為了解決這一問題,本文提出了一種基于1p/19q熒光原位雜交染色圖像自身特點的細胞自動計數方法。該方法不再使用傳統的細胞統計思路,而是利用1p/19q FISH圖像中紅色通道的圖像特點,即同一細胞中的紅點距離較近,不同細胞中的紅點距離較遠的特點,提取出各紅點,并分析紅點間距離,根據給定閾值來判斷是否處于同一細胞,最終則根據紅點的細胞歸類結果來獲取細胞數量。該方法可以免于分割粘連的細胞圖像,并能獲得較高的細胞自動計數結果。

1 方法原理及實現步驟

由于判斷1p/19q共缺失的依據是根據其熒光原位雜交圖像中選擇100個細胞,并分別統計這100個細胞中紅點和綠點的數量,再計算兩者的比值,根據比值大小來判斷分子標記物1p/19q是否共缺失,因此,準確獲知細胞數量將變得尤為關鍵。通過觀察得知,屬于同一個細胞的紅點間距離較小,反之,則距離較大。本文提出的算法利用此特點,不再利用RGB圖像的藍色通道(B通道)進行細胞計數,而是利用紅色通道(R通道)圖像來進行處理。這一處理過程主要包括二值化處理,尋找連通域并計算其面積,以及兩點間歐氏距離的計算。

1.1 圖像的二值化處理

數字圖像的二值化處理過程實際是針對灰度圖像所進行的處理。首先將彩色圖像轉化為灰度圖像,此時圖像中的像素點將具有范圍從0～255的256個亮度等級。為了簡化操作,并保留圖像中的局部圖像特征,再將灰度圖像中各像素點的不同亮度值根據是否大于指定的閾值對應轉化到亮度值為0或者為255。假設設置的二值化閾值為T1,G(m,n)為二維灰度圖中坐標為m,n的像素點亮度值,B(m,n)表示該像素點二值化后新的亮度值,則有如式1所示的圖像二值化操作:

(1)

經過二值化操作后的圖像即成為黑白圖像,可以起到簡化后續操作的作用。圖像的二值化操作除了上述的簡單閾值法外,還有平均閾值法、雙峰閾值法、大津法(Otsu’s method)等[14-15],但本文中考慮到1p/19q熒光原位雜交圖像成像質量的高度差異性,在方法實現過程中僅采用了簡單閾值法,并設置了GUI界面,供醫生即時根據計數和標記結果進行閾值調節。

1.2 圖像連通域

將圖像經過二值化處理后,將會在圖像中出現多個具有相同亮度的區域。在本文提出的方法中,二值化處理后將在圖像中出現多個白色區域。這些區域大多數是細胞中的紅點區域,但也有因為成像過程中雜質的存在所造成的干擾區域。但通常細胞中的紅點區域面積較小,因此尋找并統計這些白色區域的像素點個數是本文方法非常重要的步驟。而這一過程則是數字圖像處理的尋找圖像連通域的操作。像素點亮度相同且相鄰是劃歸到一個連通域的兩個重要條件,不可或缺,而尋找二值圖像的各連通域并標記的方法主要有種子填充法和兩次掃描法[16]。種子填充法的主要思路為首先選出所有亮度值為非0 的像素點,將其放到一個集合中,接著在集合中選出任意一個像素點作為種子像素點,然后根據圖像中的領域關系進行該種子像素點的連通域擴充,被選中的屬于擴充范圍的像素點從集合中刪除,直到所選中的種子點像素的鄰域無法再擴充則停止此次連通域尋找過程。然后選擇集合中的其他像素點作為下次鄰域擴充的種子像素點,重復上述操作,直至集合中不再有可作為種子的像素點。而兩遍掃描法的圖像連通域操作細節則是進行兩輪圖像遍歷過程。在第一輪圖像遍歷過程中,如果各非0像素點的8鄰域(已經掃描的點)都有相同的標簽,則給該像素點標記一個數字標簽。如果該像素點8鄰域內的非0像素點已有數字標簽時,進行標簽數值比較,將兩者中的較小值賦予當前像素點作為其數字標簽,反之則賦予當前像素點新的數字標簽,該方法需要兩次遍歷圖像,因此在算法復雜度上較種子填充法高,本文算法中選用第一種方法。

1.3 兩點間距離計算原理

本文方法的主要思想是利用每個細胞核上,紅色熒光點的絕對距離來區分細胞核。由圖1所示的熒光原位雜交圖像中可以看出,絕對距離較近的紅點應當是屬于同一個細胞核,反之則屬于另一個細胞核。因此,衡量點間的絕對距離則是非常重要的區分細胞核的過程。然而在圖像處理過程中,衡量像素點間的絕對距離常采用計算兩者間的歐氏距離。算法實現過程中,將計算兩個獨立紅點間的中心像素點間的歐氏距離放在了連通域統計和干擾去除操作之后。其歐氏距離D計算原理如式(2)所示。

(2)

其中,xi,yi為第i個紅點中心像素點坐標,xj,yj為第j個紅點的中心像素點坐標。

1.4 方法和數據

如上所述,本文方法是利用1p/19q熒光原位雜交圖像的成像特點來進行的細胞自動計數和標記,其具體的實現步驟為:

1)輸入原始圖像,并將該圖像的RGB通道的紅色通道(R通道)取出。

2)輸入二值化閾值T1,對紅色通道的圖像進行二值化處理。

3)尋找二值化后圖像中各連通域,并統計各連通域面積(像素點個數)。由于紅點的連通域相對于背景干擾的非零區域面積較小,因此輸入連通域閾值T2,將小于該閾值的區域去掉。此操作的目的是保留該通道內的干擾信息,用于后續干擾部分的去除操作。

4) 將步驟2所獲得的二值化圖像與步驟3中所獲得的保留了干擾區域的圖像進行異或操作,即可消除兩者相同部分,保留具有有效紅點的圖像。

5) 對各紅點的中心像素點間的歐氏距離進行計算。

6) 輸入紅點距離判別閾值T3,將紅點間絕對距離小于該閾值的點歸為同一個細胞上的紅點,反之則認為是另一細胞的紅點。

7) 統計細胞個數,即可獲得本文方法的自動細胞計數數值,并將其輸出。同時對各細胞區域進行標記,輸出標記好細胞的圖像,醫生可根據標記結果進行相應閾值調整,直至滿意結果輸出。

為了更為直觀地說明本文方法,在圖3中給出了本文算法的具體實現流程框圖。

2 實驗結果與分析

2.1 數據

本文所研究的圖像取自于武漢大學人民醫院腦膠質瘤病人的1p/19q共23張圖像,相關的數據已通過倫理審核。本文中用于實驗驗證的1p/19q熒光免疫圖像的原始尺寸為1 360×1 024,在進行處理前未進行裁剪等操作。

2.2 實驗結果

利用上述的細胞自動計數算法,基于Python 語言實現了該方法,并利用臨床收集的1p/19q 熒光原位雜交熒光圖像進行了實驗結果的驗證,獲得了該方法的實驗評估效果?；谏鲜鏊惴?為了便于專業醫師獲得直觀的細胞計數結果,本文設計相應的GUI界面,相應的實驗結果如圖4-6所示,圖中使用圓圈將識別出的細胞進行標注。

圖3 1p/19q 熒光原位雜交免疫熒光染色圖像中細胞自動計數和標記方法流程圖

圖4 1p熒光原位雜交圖像細胞自動計數及標記結果示例1

圖5 19q熒光原位雜交圖像細胞自動計數及標記結果示例2

圖6 1p熒光原位雜交圖像細胞自動計數及標記結果示例3

圖4和圖5中所示的分別是1p和19q的熒光原位雜交圖像,圖中細胞核的相對位置較為獨立,細胞的粘連、團簇情況較輕,但仍然存在亮度不均的問題,經本文方法處理后獲得了較好的細胞計數結果。圖6呈現的是細胞核團簇情況嚴重的1p熒光原位雜交圖像,經過本文方法處理后,從圖中標記的細胞結果可以看出,在細胞團簇的區域,本文的方法可以標注出正確的細胞,獲得較為精確的細胞數量,說明本文方法可以在細胞團簇較多,成像質量較差的1p/19q原位雜交熒光圖像中實現較為準確的細胞自動計數和標記。

為了進一步地說明本文方法的正確率,將該方法應用于收集整理的23張1p/19q免疫熒光原位雜交免疫熒光圖像,并將自動識別的細胞數與由醫生識別的細胞數進行了對比。由于目前在臨床中進行計算機輔助理療的過程中,專業醫生的判斷結果仍然具有權威性,因此本文中將醫生識別的細胞數作為金標準,在此基礎上進行了本文方法自動識別細胞數正確率的定量評估和分析。本文方法細胞自動識別計數與醫生識別計數結果的對比分析如圖7所示,其中深色柱狀條表示本文算法的計數結果,淺色柱狀條表示醫生計數結果。從圖7中可以獲知,大多數的算法識別結果都接近或等于醫生識別結果,但是由于背景干擾的影響,也存在有算法識別結果大于醫生識別結果(過識別)的情況。

從基于誤差分析的角度出發,將細胞識別誤差定義為算法自動識別細胞數與醫生識別細胞數的誤差的絕對值,具體的評估自動識別細胞數準確率的統計原理由式(3)給出:

識別準確率=

(3)

圖8中展示了本文方法在每張圖像上的細胞自動計數準確率統計結果,其中橫坐標表示圖像編號,縱坐標表示本文方法在每張圖像上所獲得的細胞自動計數準確率?？梢垣@知,本文方法可以獲得單張圖片高于80%以上的細胞自動計數準確率,在成像質量較好、背景噪聲干擾較小的情況下,所獲得的細胞自動計數準確率可以達到100%。將各圖像的細胞自動計數準確率進行疊加并除以總的1p/19q FISH圖像數量,則可獲得其平均準確率為92.53%。以上結果說明了在復雜的背景條件和細胞團簇情況嚴重的成像情況下,本文方法可獲得較高的細胞自動計數結果。

圖7 本文算法細胞自動計數與醫生計數結果對比圖

圖8 本文方法細胞自動計數正確率統計結果

3 結論

分子標記物1p/19q共缺失狀態的確定是腦膠質瘤分級分類診斷的重要的指標之一。臨床中多采用熒光原位雜交(FISH)方式獲取的熒光圖像來判斷共缺失狀態。這一過程中需要病理科醫生計數定量的細胞數值后計算紅、綠點的數量比值來判定1p/19q是否共缺失,由于細胞統計的數量較大,其成像質量不穩定,背景噪聲干擾較多,且細胞團簇現象頻頻發生,此項工作對人力的消耗較大,大大降低了醫生的工作效率。因此,本文提出了一種新1p/19q熒光原位雜交免疫熒光圖像中的細胞自動計數和標記方法,解決了傳統的使用藍色通道圖像(細胞熒光反應為藍色,即RGB通道的B通道)因細胞團簇無法準確衡量細胞數量的問題,利用1p/19q熒光原位雜交圖像自身的成像特點,使用R通道圖像實現細胞自動計數。將該方法用于臨床采集的23張1p/19q FISH圖像,經過直觀的展示和準確率的統計分析,可知本文提出的方法可以獲得90%以上的平均細胞自動計數準確率,具有較好的臨床使用意義。

值得注意的是,由于背景中亮度較高的紅色區域影響以及成像過程中不同細胞中的紅點亮度的差異,本文方法仍無法獲得與醫生完全一致的識別準確率,但目前所取得的結果仍然令人鼓舞,如何進一步提高此方法的準確率將是今后繼續進行研究的方向。