miR-34a靶向調控前列腺癌發生相關基因SIRT 1的表達*

沙仁高娃,張 軍

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院超聲科,呼和浩特 010110;2.內蒙古醫科大學附屬醫院泌尿外科,呼和浩特 010110)

前列腺癌在中國的發病率逐年升高,已成為男性第二類常見的癌癥,這與人口老齡化、高動物脂肪飲食等密切相關[1]。據世界衛生組織國際癌癥研究機構統計,2020年中國前列腺癌發病率約為1.56×10—4,新發病例超11萬人,死亡人數超5萬人,而在一線城市中前列腺癌發病率則更高[2]。前列腺癌干細胞是一類具有自我更新及多向分化潛能的前列腺癌細胞亞群,因此具有很高的耐藥性[3]。在癌癥發現早期,80%以上的前列腺癌患者可通過雄激素剝奪治療(Androgen deprivation therapy,ADT)得到緩解,但經過1～2年的ADT 治療后,多數患者逐漸發展為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)[4-5]。Güler等報道極少數的表型為CD44+的前列腺癌細胞可以在裸鼠體內成瘤,并且克隆能力和轉移能力也強于其他表型的前列腺癌細胞[6]。Tatar等從Du145細胞中篩選出CD44+細胞和CD44—細胞,研究顯示CD44+細胞自我更新相關的干細胞標志物(SOX2、OCT4、Nanog等)呈現高表達,分化程度低,表明CD44基因是一種前列腺癌的干細胞標志物,并且已應用于腫瘤干細胞分選技術[7]。此外,NAD 依賴性去乙?；窼IRT1與CD44等腫瘤相關蛋白具有復雜調控作用,在前列腺癌的發生發展和轉移中發揮功能[8]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種高度保守的短鏈非編碼RNA,長度為17～25 nt。miRNA通常與信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3'非編碼區(Untranslated region,UTR)結合來抑制翻譯或促進mRNA 的降解,從而在轉錄后水平上負調控基因表達[9-10]。據報道,miRNA 廣泛參與腫瘤發展及癌細胞的轉移,其差異表達與化療耐藥及不良預后等也密切相關[11]。在前列腺癌細胞株中超過70種的miRNAs異常表達。miR-34a已證實在多種腫瘤細胞中異常表達,如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結腸癌以及白血病等。雖然目前報道了miR-34a的一些靶標基因,但是直接實驗驗證和確認的少之又少。因此,miR-34a靶標基因的確定顯得尤為重要。本研究中,我們基于此前研究基礎重點驗證了miR-34a對SIRT1的轉錄后調控作用。

1 材料和方法

1.1 載體

p GL3-promoter載體含有猿猴病毒SV40強啟動子下游的螢火蟲螢光素酶基因(Firefly Luciferase,以下簡稱F-Luc)表達盒,通過F-Luc基因開放閱讀框(Open reading frame,ORF)后面的XbaI位點可以克隆調控序列片段。p RL-TK 載體提供HSV-胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase,TK)啟動子下游組成型表達的海腎螢光素酶(Renilla Luciferase,以下簡稱R-Luc),可與pGL3-promoter載體聯合共轉染哺乳動物細胞。R-Luc的表達可為實驗組的F-Luc表達的定量分析提供內參對照。

1.2 細胞株系及培養基

所用的細胞系從ATCC(American type culture collection)資源庫獲得。CWR22Rv1細胞培養基:RPMI 1640,10%的FBS,10 mmol HEPES,4.5 g/L葡萄糖(Glucose,C6H12O6),1.0 mmol丙酮酸鈉(C3H3NaO3)。LNCap細胞培養基:RPMI-1640(PM150110),10%的FBS(164210-50),1%的P/S(PB180120)。PC3細胞培養基:Ham's F-12K(PM150910),10%的FBS(164210-50),1%的P/S(PB180120)。DU145細胞培養基:89%的MEM 基礎培養基,10%的特級胎牛血清,1%的P/S青霉素-鏈霉素。

1.3 載體構建

從培養的CWR22Rv1細胞中提取基因組DNA,所用的試劑盒為QIAGEN 公司的Blood Cell-Culture Mini Kit。針對SIRT1基因3'-UTR 區域1797 bp片段序列設計擴增引物,引物設計的時候在引物的5'-端加上XbaI的酶切位點序列。通過上述引物從將基因組DNA 上擴增SIRT1 基因3'-UTR序列,PCR 產物純化回收,XbaI消化,克隆到p GL3-promoter載體,測序驗證。為了構建3'-UTR截斷載體,將SIRT1基因3'-UTR 區域分成4段,即1-350 nt,351-900 nt,901-1300 nt,1301-1797 nt,其長度分別為350 nt,650 nt,400 nt,497 nt。設計合成擴增引物,從上述重組載體上擴增出來,分別克隆到p GL3-promoter載體的XbaI位點中。

1.4 細胞轉染和蛋白表達檢測實驗

將構建好的p GL3-promoter重組載體(500 ng)與p RL-TK 載體(10 ng)共轉染到生長到90%密度的24孔板培養的CWR22RV1細胞,共轉染p GL3-promoter和p RL-TK 載體作為對照實驗。在Thermo Forma 371 高溫滅菌CO2細胞培養箱上培養24 小時后收集細胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)在Glo Max 96 Microplate Luminometer上進行F-Luc蛋白質水平的測定。

1.5 靶標位點的突變

miRNA 的靶標位點較短,只有22 bp左右,因此很容易化學合成。設計合成靶標位點對應的寡核苷酸片段,將其克隆到pGL3-promoter載體。設計合成將靶標位點3次串聯重復的寡核苷酸片段,將其克隆到p GL3-promoter載體。設計合成將靶標位點中的與對應miRNA 互補區域突變的寡核苷酸片段,將其克隆到p GL3-promoter載體。

1.6 miRNA的過表達及抑制試驗

合成miRNA 靶標位點對應的miRNA 的類似物(Mimic)及抑制劑(Inhibitor),將其分別與報告基因重組載體共轉染到CWR22RV1細胞中,檢驗其對相應靶標位點的作用,檢測過表達和抑制相關miRNA 后的雄激素受體激活水平。

1.7 培養細胞中miRNA及靶標SIRT1基因表達水平的分析

將原始獲得的LNCap、PC3、DU145和CWR22RV1細胞分別在相應培養基上培養不同代數,收集細胞。利用Invitrogen公司的TRIzol試劑和PureLink純化試劑盒提取總RNA,通過Invitrogen SuperScript反轉錄酶合成cDNA,利用RT-qPCR 實驗檢測miR-34a及SIRT1基因的表達水平。

2 研究結果

2.1 SIRT1基因的3'-UTR區域中存在轉錄后沉默元件

將SIRT1基因3'-UTR 區域1797bp 片段PCR 擴增產物利用5'-端的XbaI酶切位點克隆到pGL3-promoter載體,獲得重組載體p GL3-FLuc-SIRT1,酶切結果表明成功獲得了表達載體。在RPMI 1640培養基上培養CWR22RV1細胞,細胞密度達到90%的時候利用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000共轉染p GL3-SV40-FLuc-X 載體與p RL-TK 載體,培養24 小時后收集細胞檢測F-Luc蛋白質的表達水平。結果表明,相比對照組p GL3-promoter,實驗組p GL3-FLuc-SIRT1 的F-Luc基因m RNA 水平沒有顯著變化,而F-Luc蛋白水平降低了52%(圖1),說明SIRT1基因的3'-UTR區域中存在轉錄后沉默元件。

2.2 截斷研究顯示901-1300 nt片段里存在調控SIRT1基因表達的miRNA

miRbase(microRNA database)是一種提供miRNA 序列數據、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數據庫。利用miRbase數據庫進行SIRT1基因3'-UTR 區域中可能的miRNA 靶標位點,發現共有19 個可能的靶標位點(圖2-A)。依據這些miRNA 靶標位點的分布構建了4 個截斷體(圖2-B),分別將這些片段構建到p GL3-promoter載體F-Luc下游XbaI處,獲得重組載體p GL3-FLuc-UTR1,p GL3-FLuc-UTR2,p GL3-FLuc-UTR3,p GL3-FLuc-UTR4,測序表明正確。

圖2 SIRT 1基因3'-UTR 區域中可能的miRNA 靶標位點及截斷實驗Fig.2 Illustration of putative miRNA binding sites in the 3'-UTR of SIRT 1 and truncation constructs

分別將上述4個截斷重組載體與p RL-TK 載體共轉染到90%密度的CWR22RV1細胞,培養24小時后收集細胞檢測F-Luc蛋白質的表達水平。結果表明,實驗組p GL3-FLuc-UTR1,p GL3-FLuc-UTR2,p GL3-FLuc-UTR3,p GL3-FLuc-UTR4的F-Luc蛋白水平是分別為對照組p GL3-promoter的116%,108%,49%,94%(圖3)。綜合分析圖2和圖3結果,結果表明SIRT1基因3'-UTR區域中的轉錄后沉默元件存在于其901-1300 nt片段里,而這個區域的miR-34a和miR-124是潛在的靶位點。

圖3 SIRT 1基因3'-UTR 中轉錄后沉默區域的鑒定Fig.3 Identification of post-transcriptional regulatory region in the 3'-UTR of SIRT 1

2.3 突變和串聯研究顯示SIRT1是調控SIRT1基因表達的miRNA

由于miR-34a和miR-124是潛在的調控miRNA,我們對這兩個miRNA 進行了進一步研究。設計合成了miR-34a靶標位點(以下簡稱34a)和miR-124靶標位點(以下簡稱124)對應的寡核苷酸片段,將其克隆到p GL3-promoter載體,分別獲得了重組載體p GL3-FLuc-34a和p GL3-FLuc-124。分別將上述2個重組載體與p RL-TK 載體共轉染到90%密度的CWR22RV1細胞,培養24小時后收集細胞檢測F-Luc蛋白質的表達水平。結果表明,相比對照組p GL3-promoter,實驗組p GL3-FLuc-34a和的F-Luc蛋白水平降低了43%,而p GL3-FLuc-124中沒有顯著變化(圖4)。結果表明,miR-34a是SIRT1基因轉錄后水平的miRNA。

圖4 F-Luc蛋白水平的檢測Fig.4 Protein test of F-Luc

人類miR-34a的序列如圖5所示。為了進一步證明miR-34a對SIRT1基因的調控作用,我們設計合成了靶標位點上與miR-34a互補區域突變(以下簡稱34am)的寡核苷酸片段,獲得了重組載體p GL3-FLuc-34am,克隆了將miR-34a靶標位點3次串聯重復(以下簡稱34a3)的寡核苷酸片段,獲得了重組載體p GL3-FLuc-34a3。結果表明,相比對照組p GL3-promoter,p GL3-FLuc-34am 的F-Luc蛋白水平沒有顯著變化,表明這種突變喪失了調控能力(圖4)。相比p GL3-FLuc-34a組,p GL3-FLuc-34a3的F-Luc蛋白水平又降低了34%(圖4)。結果表明,SIRT1 基因3'-UTR 區域中存在的miR-34a靶標位點以劑量依賴性方式抑制SIRT1基因的表達,而這個位點的突變導致這種抑制作用的喪失。這個結果證實了miR-34a的確是SIRT1基因轉錄后水平的miRNA。

圖5 miR-34a調控作用的確定Fig.5 Confirmation of regulatory role of miR-34a

2.4 miR-34a的過表達及抑制試驗證明了其調控作用

上述實驗從SIRT1 基因3'-UTR 區域中存在的miR-34a靶標位點的角度證明了miR-34a對SIRT1 基因的調控作用。為了進一步從miRNA 角度驗證這種調控作用,我們設計合成了miR-34a的類似物(34a-mimic)及抑制劑(34a-inhibitor),將其分別與p GL3-FLuc-34a和p RL-TK 載體共轉染到90% 密度的CWR22RV1細胞,培養24小時后收集細胞檢測F-Luc蛋白質的表達水平。結果表明,在pGL3-FLuc-34a轉染組,相比對照組,實驗組34a-mimic的F-Luc蛋白水平降低了31%,而34a-inhibitor的F-Luc蛋白水平提高了32%(圖6)。在pGL3-promoter轉染組,34a-mimic和34a-inhibitor 并不影響F-Luc 蛋白水平(圖6)。這些結果進一步證實了miR-34a 對SIRT1基因的調控作用。

圖6 miR-34a的類似物及抑制劑的作用鑒定Fig.6 Identification of the roles of miR-34a mimic and inhibitor

2.5 miR-34a及靶標SIRT 1基因的表達呈現負相關

我們收集了培養代數不同的前列腺癌細胞LNCap、PC3、DU145和CWR22RV1,利用RT-qPCR技術檢測上述實驗鑒定到的調控miR-34a及靶標SIRT1基因的表達水平,分析了它們之間的相關性。結果表明,在DU145和CWR22RV1中miR-34a及靶標SIRT1基因的表達呈現負相關,而在LNCap和PC3細胞中無相關性(圖7)。這說明在有些前列腺癌細胞(DU145和CWR22RV1)中的確存在miR-34a對靶標SIRT1基因的轉錄后抑制作用,進一步證實了圖1—6的結果。

圖7 培養細胞中成熟miR-34a和SIRT 1 m RNA 水平的檢測Fig.7 Detection of m RNA level of SIRT 1 and mature miR-34a in cultured cells

3 討論

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性中常見的惡性腫瘤,前列腺癌自2008年起成為我國男性泌尿生殖系統中發病率最高的腫瘤,年均增長率已達到12.07%,列男性惡性腫瘤發病率的第6位。探討前列腺癌尤其是去勢抵抗性前列腺癌轉移發生的分子機制,對降低前列腺癌的患者死亡率具有重大意義[12]。microRNA(miRNA)是重要的調控RNA,具有高度的保守性,由非編碼蛋白核基因轉錄而來。編碼miRNA 的基因轉錄后產生一個長的pri-miRNA 分子,這種原初轉錄物被剪切成約70-90 nt大小、具發夾結構的單鏈RNA 前體(pre-miRNA),pre-miRNA 由輸出蛋白5(Exportin-5)從細胞核轉運入胞液,接著在核糖核酸酶III Dicer的作用下剪切為雙鏈的dsRNA,最終dsRNA 在解旋酶的作用下分解為miRNA 和miRNA*。miRNA 結合到Argonaute2(AGO2)形成miRNA 介導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。

RISC中的miRNA 被激活,通過種子序列與m RNA 的3'-UTR 結合,抑制m RNA 的轉錄或造成m RNA 的分解,從而調控基因的表達[13]。藥物耐受是前列腺癌患者治療最為棘手的環節,而小RNA 分子由于其無免疫原性等特點被認為是具有臨床治療應用前景的分子,結合新型如超聲微泡造影劑等靶向基因遞送系統可為前列腺癌的基因靶向治療提供新型手段和藥物來源[14]。研究表明,miR-34a在前列腺癌形成中具有重要調節作用,如戈舍瑞林聯合比卡魯胺可上調晚期前列腺癌患者血清miR-34a水平,而手術去勢、電切術聯合間斷性內分泌治療,可上調晚期前列腺癌患者血清miR-34a水平[15]。通過制備miRNA-34a靶向納米復合物可以抑制一些癌細胞的增殖,表明可能發揮著腫瘤抑制作用[16]。miR-34a在微小RNA 的臨床轉化研究中具有較強的臨床應用前景,脂質體制劑的miR-34a具有重要臨床意義[17]。通過對miR-34a在前列腺癌中的系列研究發現,miR-34a可以通過靶向作用前列腺癌干細胞表面的CD44 以殺傷腫瘤干細胞,進而抑制腫瘤的耐藥性[18]。此外,miR-34a也可以同時直接或者間接作用于周期相關蛋白Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4及其CDK6從而影響細胞的生長周期甚至誘導凋亡,也可以通過直接或者間接作用于Myc、Notch、JAG1和SIRT1來影響細胞的自我更新能力[19]。雖然上述研究在生物信息學分析、細胞表型等方面證實了miR-34a的作用,但對于其直接靶標基因的實驗驗證方面缺乏依據。因此,鑒于目前miR-34a的靶標基因不明確問題,本研究中重點分析了癌基因SIRT1和miR-34a間的調控關系,闡明了miR-34a在SIRT1上的靶位點。SIRT1作為一種去乙?；?Histone deacetylase,HDAC)具有廣泛的調控作用,并參與包括前列腺癌在內的多種腫瘤的發生[20-22]。本研究直接聯系了前列腺癌轉移中重要的兩個分子miR-34a和SIRT1之間的調控作用。研究結果顯示,成熟miR-34a的水平與前列腺癌的發展具有正相關,而SIRT1的m RNA 水平呈現負相關,這表明miR-34a對SIRT1的調控是復雜的轉錄后調控,而不是簡單的翻譯抑制。這些表明,微小RNA 的調控具有多種模式,值得進一步探究,因此本研究具有重要研究意義和應用價值。結合miR-34a研究為基礎的RNA 疫苗等的研發將為利用RNA 分子進行腫瘤靶向治療提供廣闊的應用前景[23]。