薜荔葉化學成分及其活性研究

蔡 月， 賴宣丞， 石 慧， 王 越， 韓長日2,*

（1.海南省疾病預防控制中心，海南 ?？?570203；2.海南科技職業大學 海南省藥食同源重點實驗室，海南 ?？?571126；3.海南師范大學 化學與化工學院，熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室，海南 ?？?571127）

薜荔（Ficus pumilaL.）屬?？崎艑?，為攀援或匍匐灌木植物，又名木蓮、涼粉樹、爬墻虎等，在我國主要分布在湖南、四川、海南和臺灣等省[1]。薜荔是一種藥食兩用的植物，瘦果可作涼粉，是中國南方民間傳統的消暑佳品；根、莖和葉均可藥用，在我國民間有著清熱解毒、舒筋活絡、通利乳汁的功效，葉可用于祛風化濕，治腰腿痛、乳痛等疾病[2-3]。毛彩霓等[4]發現薜荔莖葉的水提取物和乙醇提取物對急性、早期炎癥具有很好的抗炎作用。唐煌等[5]發現小葉薜荔莖葉的醇提物具有較強的抗氧化能力，其粗提物的DPPH和羥基自由基清除能力均超過標準對照品BHT。本課題組前期從薜荔莖中分離得到系列紫羅蘭酮類衍生物，其中包括一個新的紫羅蘭酮，抗菌活性篩選結果表明，部分紫羅蘭酮類化合物對大腸桿菌表現出較強的抑制活性，其MIC值均為1.25 μg/mL[6]；此外，本課題組從薜荔葉中分離得到紫羅蘭酮類、甾體、三萜類等化合物，并分離鑒定出一個新的降碳倍半萜類化合物[7-8]?；谝陨锨捌谘芯炕A，為進一步從薛荔中挖掘結構新穎、活性顯著的化合物，本課題組繼續對薜荔葉的80%乙醇提取物用乙酸乙酯萃取多次，制成浸膏，采用正相硅膠柱層析、半制備HPLC等色譜分離，并運用NMR以及質譜鑒定技術鑒定化合物的結構，從中分離得到7個化合物（化合物結構如圖1 所示）。對化合物1～7 進行抗腫瘤活性測試，化合物1 對A549 細胞顯示出一定的抑制活性，IC50值為32.21 μg/mL。

圖1 化合物1～7的化學結構Figure 1 Strcture of compound 1～7

1 儀器與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-400 MHz超導核磁共振儀，瑞士Bruker公司；Agilent 1200 型半制備高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；薄層硅膠GF254和柱色譜硅膠，青島海洋化工廠；ODS柱色譜材料C18，10～40 μm，Merck公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠，Amersham Blosclences公司；YOKO-ZX紫外分析暗箱，武漢藥科新技術開發有限公司；所用試劑，分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 植物來源

薜荔葉于2013年9月采自于海南省儋州市蘭洋縣，經海南師范大學生命科學學院鐘瓊芯教授鑒定為?？崎艑僦参镛道驠icus pumila的葉。

1.3 提取與分離

將采集得到的薜荔葉風干粉碎得到12 kg，使用80%乙醇在室溫下浸泡提取3次，每次5 d，減壓濃縮后得到乙醇總浸膏70 g，將浸膏進行正相硅膠柱層析(100 ～ 200目)梯度洗脫，使用石油醚-乙酸乙酯(體積比，100∶0 ～ 0∶100) 和乙酸乙酯-甲醇(體積比，20∶1 ～ 0∶100)進行洗脫，經TCL檢測合并得到8個組分(Fr.1 ～ Fr.8)。Fr.3采用硅膠柱層析進行分離，以石油醚-氯仿(體積比，4∶1 ～ 0∶100) 進行梯度洗脫，得到兩個組分。Fr.3.2經制備型HPLC液相色譜[V（甲醇）∶V（水）=70∶30，3 mL/min)]，得到化合物2 (15.7 mg)和3 (12.9 mg)。Fr.4用硅膠柱層析進行分離，以石油醚-乙酸乙酯(體積比，5∶1 ～ 0∶100)進行梯度洗脫，得到2個組分。Fr.4.2經制備型HPLC液相色譜[V（甲醇）∶V（水）=55∶45，3 mL/min]，得到化合物4 (5.7 mg)。Fr.5用硅膠柱層析進行分離，以石油醚-丙酮(體積比，4∶1 ～ 0∶100)進行梯度洗脫，得到2 個組分。Fr.5.1 過純甲醇Sephadex LH-20 凝膠柱，經制備型HPLC液相色譜[V（甲醇）∶V（水）=45∶55，3 mL/min]，得到化合物5 (4.0 mg) 和7 (3.4 mg)。Fr.6用硅膠柱層析進行分離，以氯仿-甲醇(體積比，20∶1 ～ 0∶100)進行梯度洗脫，得到2 個組分。Fr.6.1 經制備型HPLC液相色譜[V（乙腈）∶V（水）=30∶70，3 mL/min]，得到化合物1 (5.5 mg)。Fr.7用硅膠柱層析進行分離，以氯仿-甲醇(體積比，15∶1 ～ 0∶100)進行梯度洗脫，得到2個組分，Fr.7.2過純甲醇Sephadex LH-20凝膠柱，經制備型HPLC液相色譜[V（乙腈）∶V（水）=15∶85，3 mL/min]得到化合物6 (17.0 mg)。

1.4 抗菌活性測試

采用微量稀釋法[9]測試化合物1～7 對4 株人致病菌[金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）]和2 株海洋弧菌[溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）]的抗菌活性。二甲基亞砜DMSO 為陰性對照，環丙沙星為陽性對照。

1.5 抗腫瘤活性測試

采用MTT比色法[10-11]對化合物1～7進行抗腫瘤活性測試。測試細胞為Hela (宮頸癌細胞)、MCF-7(乳腺癌細胞)和A-549(肺腺癌細胞)，細胞培養液為含10%胎牛血清DMEM，陽性對照為阿霉素。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1：無色油狀，易溶于氯仿。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δH: 6.68 (1H, dq,J= 15.2, 7.2 Hz, H-9),6.13 (1H, dd,J= 16.0, 1.2 Hz, H-8), 4.08 (1H, m, H-3), 2.33 (1H, dd,J= 17.6, 7.6 Hz, H-4a), 2.00 (1H, dd,J=16.8, 7.6 Hz, H-4b), 1.92 (3H, dd,J= 7.2, 1.2 Hz, H-10), 1.77 (1H, m, H-2a), 1.55 (3H, s, H-13), 1.50 (1H, t,J=12.0 Hz, H-2b), 1.16 (3H, s, H-11), 0.99 (3H, s, H-12)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δC: 201.8 (C-7), 146.1 (C-9), 140.3 (C-6), 134.6 (C-8), 128.2 (C-5), 65.1 (C-3), 48.1 (C-2), 41.1 (C-4), 36.5 (C-1), 29.8 (C-12), 29.2 (C-11), 21.2 (C-13), 18.5 (C-10)。以上數據與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物1為3-hydroxy-damascone。

化合物2：無色油狀，易溶于氯仿，根據低分辨質譜ESI-MSm/z: 251.3 [M+Na]+，結合1H和13C NMR 波譜數據，推斷其化合物分子式為C14H28O2，不飽和度為1。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δH: 4.11 (2H, q, H-1′), 2.27(2H, m, H-2), 1.59 (2H, m, H-3), 1.25 (3H, m, H-2′), 0.86 (3H, m, H-12)。13C-NMR(CDCl3, 100 MHz)δC: 174.1(C-1), 60.3 (C-1′), 34.5 (C-2), 32.0 (C-10), 29.8 (C-4), 29.7 (C-5), 29.6 (C-6), 29.5 (C-7), 29.4 (C-8), 29.3 (C-9), 25.0 (C-3), 22.8 (C-11), 14.4 (C-12), 14.4 (C-2′)。以上數據與文獻報道一致[13]，故鑒定化合物2 為月桂酸乙酯。

化合物3：黃色油狀，易溶于氯仿、甲醇，根據低分辨質譜ESI-MSm/z: 319.1 [M+Na]+，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其化合物分子式為C18H32O3，不飽和度為3。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δH: 6.49 (1H, dd,J=15.2, 11.2 Hz, H-11),5.98 (1H, t,J= 10.8 Hz, H-10), 5.66 (1H, dd,J= 15.2, 6.8 Hz, H-12), 5.45 (1H, m, H-9),4.18 (2H, dd,J= 12.8, 6.0 Hz, H-13), 2.33 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-2), 2.16 (2H, m, H-8), 1.61 (2H, t,J= 6.4 Hz, H-3), 0.87 (3H, m, H-18)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δC: 179.4 (C-1), 135.8 (C-12), 132.9 (C-9), 128.0 (C-10),126.0 (C-11), 73.1 (C-13), 37.3 (C-14), 34.1 (C-2), 31.9 (C-16), 29.4 (C-7), 29.0 (C-4), 29.0(C-5), 29.0 (C-6),27.7 (C-8), 25.2 (C-15), 24.7 (C-3), 22.7 (C-17), 14.1 (C-18)。以上數據與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物3為馬桑酸。

化合物4：黃色油狀，易溶于氯仿、甲醇，根據低分辨質譜ESI-MSm/z: 317.0 [M+Na]+，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其化合物分子式為C18H30O3，不飽和度為4。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δH: 6.49 (1H, dd,J=14.4, 11.2 Hz, H-11), 5.95 (1H, dd,J= 11.2, 10.7 Hz, H-10), 5.65 (1H, dd,J= 15.2, 6.4 Hz, H-12), 5.59 (1H, m,H-15), 5.47 (1H, m, H-9), 5.35 (1H, m, H-14), 4.19 (1H, dt,J= 6.4, 6.0 Hz, H-13), 0.93 (3H, m,J= 7.6 Hz, H-18)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δC: 178.8 (C-1), 134.8 (C-9), 134.9 (C-16), 132.8 (C-12), 127.9 (C-11), 125.9(C-10), 123.9 (C-15), 72.3 (C-13), 35.1 (C-2), 34.1 (C-14), 29.4 (C-4), 29.0(C-5), 29.0 (C-6), 28.9 (C-7), 27.6(C-8), 24.7 (C-3), 20.7 (C-17), 14.2 (C-18)。以上數據與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物4為13-hydroxy-(9Z,11E, 15E)-octadecatrienoic acid。

化合物5：黃色油狀，易溶于甲醇。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δH:4.29 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-1), 3.97 (2H,m, H-1′), 3.88 (1H, m, H-6b), 3.65 (1H, m, H-6a), 3.40 (1H, m, H-5), 3.35 (1H, m, H-3), 3.28 (1H, m, H-4),3.19 (1H, q,J= 8.8, 8.2 Hz, H-2), 1.25 (3H, m, H-2′)。13C-NMR(CD3OD, 100 MHz)δC: 104.0 (C-1), 78.0 (C-3),77.8 (C-5), 75.0 (C-2), 71.5 (C-4), 66.2 (C-1′), 62.7 (C-6), 15.4 (C-2′)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物5為乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：無色針晶，易溶于氯仿、甲醇。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δH: 7.43 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2, 6),7.35 (2H, m, H-3), 7.33 (2H, m, H-5), 7.29 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-4), 4.95 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-7a), 4.68 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-7b), 4.36 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-1′)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δC: 139.0 (C-1), 129.3 (C-3, 5),129.2 (C-2, 6), 128.7 (C-4), 103.2 (C-1′), 78.1 (C-3′), 78.0 (C-5′), 75.1 (C-2′), 71.8 (C-7), 71.7 (C-4′), 62.8 (C-6′)。以上數據與文獻報道一致[16]，故鑒定化合物6為芐醇-β-D-葡萄糖苷。

化合物7：白色針晶，易溶于甲醇。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δH: 7.00 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6′), 6.86(1H, d,J= 1.5 Hz, H-3′), 6.75 (1H, d,J= 8.4, 1.5 Hz, H-5′), 4.16 (1H, q, H-2), 3.84 (3H, s, 2′-OCH3), 3.75 (2H,d,J= 3.6 Hz, H-1, 3), 3.58 (2H, t,J= 6.4 Hz, H-9′), 2.65 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-7′), 1.84 (2H, m, H-8′)。13CNMR (CD3OD, 100 MHz)δC: 151.9 (C-2′), 146.8 (C-1′), 138.3 (C-4′), 121.9 (C-5′), 119.4 (C-6′), 114.1 (C-3′),83.3 (C-2), 62.1 (C-1), 62.1 (C-3), 62.0 (C-9′), 56.4 (2′-OCH3), 35.6 (C-8′), 32.7 (C-7′)。以上數據與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物7為2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-propane-1, 3-diol。

2.2 抗菌活性測試結果

對化合物1～7 進行了S.aureus、E.coli、B.cereus、P.aeruginosa、V.alginolyticus、V.parahaemolyticus6 株菌的抗菌活性測試，結果表明化合物1～7對以上菌株均無明顯抗菌活性，陽性對照環丙沙星對以上菌株的MIC值在0.156～0.625 μg/mL之間。

2.3 抗腫瘤活性測試結果

對化合物1～7 進行抗腫瘤活性測試，其中，化合物1 對A549 細胞顯示出一定的抑制活性，IC50值為32.21μg/mL（表1）。

表1 化合物1抗腫瘤活性測試結果Table 1 Test results of antitumor activity of compound 1

3 結論

對薜荔葉化學成分進行了分離鑒定，從中分離得到7個化合物，分別為：3-hydroxy-damascone (1), 月桂酸乙酯(2),馬桑酸(3), 13-hydroxy-(9Z,11E, 5E)-octadecatri-enoic acid (4),乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),芐醇-β-D-葡萄糖苷(6)和2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-diol (7)，其中化合物7 為首次從該屬植物中分離得到，化合物1首次從該植物中分離得到?；衔?對A549 細胞顯示出一定的抑制活性，IC50值為32.21 μg/mL。