新型Argonaute蛋白的挖掘及體外活性表征

方蒙君， 司振軍， 沈培杰， 黃 迪， 徐志南

（浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州 310000）

Argonaute 蛋白（Agos）廣泛存在于原核和真核生物中[1]，可以通過短核苷酸的介導來結合或切割與其序列互補的核酸分子[2]。真核生物來源的Agos（eukaryotic Agos，eAgos）是RNA 干擾途徑（RNA interference，RNAi）中的主要組成部分，用于調控基因的表達和抵抗病毒的入侵[3-5]。而原核生物來源的Agos（prokaryotic Agos，pAgos）也有免疫功能，可以降解入侵的遺傳元件，如質粒和噬菌體核酸等[6-7]。

eAgos主要通過RNA的介導特異性切割RNA分子，而pAgos則更偏好以單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）為導向切割DNA 靶標[8-9]。然而隨著研究的深入，越來越多具有多樣功能的pAgos 引起了人們的注意。例如，來自Kurthia massiliensis的KmAgo[10-11]和Marinitoga piezophila的MpAgo[12]可以通過ssDNA 或RNA的介導切割DNA和RNA底物。除了導向核酸類型之外，pAgos的核酸酶活性還受導向的5末端修飾基團的影響。大多數pAgos偏好具有5末端磷酸基團的導向核酸，此時切割位點位于導向的第10-11位堿基對應的磷酸二酯鍵[13]。而某些pAgos也可利用5′末端為羥基的核酸為導向，此時切割位點會發生遷移，位于第11-12位堿基之間[10]。

pAgos的可編碼核酸內切酶活性使得它在核酸操作領域，例如基因組編輯[14-15]、人工限制性核酸內切酶開發[16]和核酸檢測[17]等，具有廣闊的應用前景。然而，目前只有少數幾種pAgos的酶學性質、催化機理和結構進行了研究分析。因此，對于新型pAgos的挖掘和研究不僅可以深化我們對Agos的了解，還可以為核酸操作領域提供更多的工具蛋白。本研究通過在NCBI中比對已報道的、具有核酸酶活性的pAgos序列，獲得了一些同源性較高的新型pAgos，并對其進行了表達純化和體外活性驗證，為后續的pAgos研究工作提供了新的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基LB培養基：10 g/L氯化鈉、5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨（固體培養基再添加1.5%的瓊脂粉）；TB培養基：24 g/L酵母提取物、12 g/L蛋白胨、12.5 g/L磷酸氫二鉀、2.3 g/L磷酸二氫鉀、4 g/L甘油。

1.1.2 商品化試劑

Bradford 蛋白濃度測定試劑盒，翌圣生物，貨號20202ES86；2 × SSCP去離子甲酰胺凝膠上樣緩沖液，上海生工，貨號B548；4 × Protein SDS-PAGE Loading Buffer，TaKaRa，貨號9173；Acryl/Bis 40% Solution，37.5∶1，上海生工，貨號B54601；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，上海生工，貨號B528419-0005。

1.1.3 SDS-PAGE試劑

15%分離膠：3.867 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、2.533 mL Tris-HCl（1.5 mol/L，pH8.8）、100 μL 10% APS、100 μL 10% SDS、10 μL TEMED，去離子水補充至10 mL；5%濃縮膠：0.62 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、0.62 mL Tris-HCl（1 mol/L，pH6.8）、50 μL 10% APS、50 μL 10% SDS、4 μL TEMED，去離子水補充至5 mL；5×SDS-PAGE 電泳緩沖液：0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L glycine、0.5% SDS；染色液：80 mL 去離子水、100 mL甲醇、20 mL乙酸、0.5 g考馬斯R-250；脫色液：600 mL去離子水、300 mL甲醇、100 mL乙酸。

1.1.4 尿素-PAGE試劑

10×TBE：108 g/L Tris、55 g/L 硼酸、7.44 g/L 二水合Na2EDTA；14%尿素-PAGE 配方：4.2 g 尿素、3.5 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、1 mL 10×TBE、100 μL 10% APS、10 μL TEMED，去離子水補充至10 mL。

1.1.5 親和純化試劑破胞緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑，pH7.5；洗脫緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH7.5；蛋白保存緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L KCl，pH7.5。

1.1.6 寡核苷酸序列

FAM-tDNA：FAM-aaaataatttaatatactatacaacctactacctcttata；

FAM-tRNA：FAM-aaaauaauuuaauauacuauacaaccuacuaccucuuaua；

P/OH-gDNA：P/OH-tgaggtagtaggttgtata；

P/OH-gRNA：P/OH-gagguaguagguuguaua。

1.1.7 氨基酸序列

TtrAgo（Thermococcus thioreducens）：MLMKVLTNMVKLNQDIIPNEIYLYKIFNKPEDGMNIYKIAYRNHGIVI DPQNRIIATPSELEYSGKFAIEDEISFNELPENYQNRLVLRILRDNGISDHALSRTLQKYRKPKPFGDFEVIPEIRSS VIKHGGDFYLVLHLSHQIRSKKTLWELVGRNKDALRDFLKEHRGTILLRDIASEHKVVYKPIFKRYNGDPDLIED NSNDVEHWYDYHLERYWNTPELKKEFYKKFGPVDLNQPIILAKPLRQHNRGDLVHLLPQFVVPVYNAEQLNDI LASEILEYLKLTSNQRISLLSRLINDIKTNTNIIVSSLTELEANTFDVDLNDMLQVRNADNVKVTLSELEISKTRLFTW MKSRKYPVILPYDIPQKLKKIEKIPVFIIVDSALSRDIQTFAKDEFRYLISSLQKSLSNWVDFPILDIRDKYIFTIDLTS DKDIVNLSIKLVNLMKNAELGLALIATRTKLPNETFDEVKKRLFSVNIISQVVNEATLYKRDKYNESRLNLYVQH NLLFQILSKLGIKYYVLRHKFSYDYIVGIDVTPMKLSHGYIGGSAVMFDSQGYIRKIIPVEIGEQMGESIDMKEFFK DMVVQFGKFGIDLEGKSILILRDGKITKDEEEGLAYISKVFGIKITTFNIVKRHLLRIFANRKLYLRLANSVYLLPH RIKQSVGTPVPLKLSEKRLILDGTITSQEITYNDIFEILLLSELNYGSISADMKLPAPVHYAHKFVRALRKGWRIRE ELLAEGFLYFV；

TeAgo（Thermococcus eurythermalis）：MNIDEYQTNMYKIKSSIVKEAFSDLVSVEILLGQKLNHREIYRIVQGK FGGLVYKHDEMLGKVVAVIKEEYISELENEPEIQVLSIQAFDVSSLDKNKREKLLLNILKKKGHLFQILRHKQVIG KIENRTIRRTFRVSIESEGKEYYIVVLPRHEIIEDSTIMDLLIKGELTIEDLKINLIEKGTWKITSFRKDIDVSPNAVE EIILKVEDPSRYNAELKRINEYFITRTSLEPIDDSKYPDKYNMILITKGKRYSYHPSRAMLIRPVEGELQKKIHHSG EFLKALNIAAEYIKDIIETSKRATFEGVQIPSQDIYYKATFLENGRIIRKKIAPYYNIKNTFNWLFKNEPFEKTYSLI VPTKTPKFIKDKKIAIYLLYPKEFSKERTTLVSDVKSALDRVSEYFAYLRTISMTSSLSLPVEITTPLIAVDYTNLAQ RLTKIFEKYENYDYHLAITFVPSMSREQFDRIKKFFFERGIIHKAINIDNLNSKFGKNKQRIIESVILQALYAFGIYF YSLDNLPYDIIIGIDVTREKDKNGKYYGISGAAVVQNKNGEIIKIVPITQPQSSSETVDVEKIFESLQPELDQIVETKS NVDILILRDGRIPSREIEQLKRLSLRRPYTFTLVGIIKRPLVRFFKGTDRHLFGPKPNYYFRIGDTYYLTSHFLEHYL KVPLKLERKYVISRGKLATSPLNHEDILAITKLTKLNYSQPKNPDRMKLPAPVHLSHRLINYERRGLRFARPEFLQ EGALYFL；

DeAgo（Domibacillus enclensis）：MEPYITEATAIGLASDIHLHVYEFPVDNPLKKYEGVSDICREWKRANGYM AVAYNQSTIATLEPVVNYAGFEPLSYQEKPIDPDNPFERSLLERLLKEGLLTAGQQKLKLKRVGADLQEWEPKRV GRILIYPALSFHVNVLNNRVHIGFAMTHKFEYEVTLQQMLEQGEVVEEGLKVVHSDVWNNYTYEVEQIAPYSVM DMCPKLKKPIHQYYVDKGNQKMADTLHENVKVIYAKPLHGDSLSYAASVLKPLCSFETMKPFEAKKIMDVLKLK PDERMRKQLEQAKKLLSVFSYLQFEKRPFLLQANQYELMTLSEPAVFTNKRFNKPIYGLKNGPLFKGGTVTLSIFF DEAIESSLGLSKKLVFQFVKVLQKIAEQNGVIMKISHETKHIKGKLNESFFQHFSWEIRELENVFTDTTVLALMTEE HLTKLPNKLYNEFKRQFGGKWDISSQIITEKVLKTFQYALTRHQLTDFNVNDEKECERVADIVKNDSLSYPVFNIL LGIYVKSGMQPWVLAERAHSDCFIGLDVSHEDGKSAAGIMNVIGSNGHLIKQSALNGVLAGEKIDEPTLNEIITEV LYSYQKQFGHFPKHVTIHRDGKWRESSELVGRLFKDRNVAYDIVEVIKKPNRRMAFYNNETGKFETKQGVCYV RNQEAFLCSTNPRETIGMAQPVKIVQLTNTLPFKQIIQDCYDLSFMHIHAVNKMRLPATIHYADLSSTAYQRGQVA PRTTNGTHLPFV；

MhAgo（Marinitoga hydrogenitolerans）：MYLNLYEIKIPYRVKRLYYFNKENDPKEFARNLSRVNNIRFNDSKD LVWLEIPDIDFKITPQQAEKYKIEKNEIIGEKEDSDLFVKTIYRYIKKKFIDNNFYYKRGNNYISINDKFPLDSNTNV NAHLTYKIKLYKINERYYISVLPKFTFLSDKPALESPIKSTYLFNIKSGKTFPYISGLNGVLKIDLGENGIKEVLFPEN YYFNFTSKEAEKFGFSKEIHNIYKEKIFSGYKKIKQSLYFLEDIININNYNLTMDKKIYVNIEYEFKKGISRNIKDVF KYSFYKNDQKIKIAFFFSSKKQIYEIQRSLKMLFQNKNSIFYQTIYEMGFSKVIFLREPKTNSSAFMYNPETFEISNK DFFENLEGNIMAIIILDKFLGNIDSLIQKFPENLILQPILKEKLEKIQPYIIKSYVYKMGNFIPECQPYVIRNLKDKNK TLYIGIDLSHDNYLKKSNLAISAVNNFGDIIYLNKYKNLELNEKMNLDIVEKEYIQILNEYYERNKNYPENIIVLRD GRYLEDIEIIKNILNIENIKYSLIEVNKSVNINSCEDLKEWIIKLSDNNFIYYPKTYFNQKGVEIKIIENNTDYNNEKIL EQVYSLTRVVHPTPYVNYRLPYPLQVVNKVALTELEWKLYIPYMK。

1.2 方法

1.2.1 新型pAgos的篩選

分別使用PfAgo（NCBI 序列號：WP_011011654.1）、MpAgo（NCBI 序列號：WP_014295921.1）或KmAgo（NCBI序列號：WP_010289662.1）的氨基酸序列在NCBI中進行序列比對。

1.2.2 系統發育樹構建

使用MEGA7.0軟件比對和分析了4個候選蛋白以及已報道的活性pAgos的氨基酸序列，并以此構建了系統發育樹，其中序列比對采取MUSCLE算法，進化樹構建則選擇Neighbor-Joining方法。

1.2.3 pAgos表達載體的構建

以大腸桿菌為表達系統，對候選pAgos的基因進行密碼子優化。蛋白純化采取親和層析，因此在目的蛋白的N 端添加6 個組氨酸，委托金斯瑞公司合成設計好的基因。表達載體選擇pET28a，基因插入位點為NcoI 和EcoRI。4 個pAgos 表達質粒分別命名為pET28a-TtrAgo、pET28a-TeAgo、pET28a-MhAgo、pET28a-DeAgo。

1.2.4 質粒的轉化

從-80 ℃冰箱中取出4 支大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，將其放置于冰上5 min；分別加入100 ng 的pAgos質粒，用槍頭輕輕攪動后放置于冰上30 min；將細胞轉移到42 ℃水浴鍋中進行90 s熱擊；將細胞轉移到冰上，靜置3 min后加入900 μL新鮮的LB培養基，轉移至37 ℃、220 r/min 搖床復蘇1 h；取100 μL復蘇后的細胞，涂布在含有50 ng/μL卡那霉素的LB固體平板上，在37 ℃下倒置培養12～16 h。轉化后的菌株分別命名為BL21（DE3）/pET28a-TtrAgo、BL21（DE3）/pET28a-TeAgo、BL21（DE3）/pET28a-MhAgo、BL21（DE3）/pET28a-DeAgo。

1.2.5 pAgos的表達

使用牙簽挑取上一步質粒轉化所得的單菌落，放入5 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min培養12 h；取2 mL 種子液，接種于200 mL TB 液體培養基中，37 ℃、220 r/min 培養至OD600為2.0 ～ 3.0；加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 溶液，25 ℃、220 r/min 培養12 h；將菌液轉移至50 mL 離心管中，5000 r/min 條件下離心10 min，倒掉上清液，收集的菌體可用于后續純化或保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 SDS-PAGE驗證pAgos的表達

取1 mL發酵菌液，12 000 r/min條件下離心1 min，倒掉上清液；加入1 mL去離子水重懸菌體，12 000 r/min離心1 min，倒掉上清液；加入適量體積的破胞緩沖液，調整菌液的OD600約為5；取0.5 mL上一步驟的菌液放入2 mL EP管中，冰浴條件下進行超聲破胞（3 s工作，7 s間隙，20次循環，工作功率為250 W）；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取15 μL上清液與5 μL 4 × loading buffer混合，作為可溶表達樣本；在沉淀中加入1 mL去離子水清洗，12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液；加入0.5 mL 8 mol/L尿素溶液重懸菌體，取15 μL與5 μL 4×loading buffer混合，作為包涵體樣本；將可溶表達和包涵體樣本在沸水中煮5 min后，取10 μL樣品進行電泳（120 V、90 min）；將凝膠放入染色液中，在水平旋轉振蕩儀中染色30 min；倒掉染色液，加入脫色液振蕩，至脫色完全；加入清水，振蕩30 min后記錄結果。

1.2.7 pAgos的純化

取出發酵后的菌體，加入適量體積的破胞緩沖液，調整菌液的OD600約為10；用高壓勻漿機進行破胞，壓力設為60 ～ 70 MPa，進行3個循環的破碎；將破碎后的混合液在4 ℃、10 000g條件下離心30 min，上清液使用0.22 μm的濾膜進行超濾；往鎳離子層析柱中加入3倍柱體積的破胞緩沖液；然后加入上一步得到的破胞液；再用破胞緩沖液進行清洗，直到280 nm的吸收峰穩定；加入洗脫緩沖液洗脫目標蛋白。

為提高目的蛋白濃度以及更換為蛋白保存緩沖液，使用孔徑為30 kDa的超濾管對洗脫樣本進行超濾，方法為4 ℃、5 000 r/min離心30 min，棄下層液體后加入適量蛋白保存緩沖液，重復上述步驟，直至咪唑濃度低于0.1 mmol/L。使用Bradford 試劑盒對濃縮后的蛋白樣品進行定量，再加入加入等體積的甘油、1 mmol/L二硫糠醇（DTT）、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），混勻后分裝，置于-80℃保存。

1.2.8 pAgos的可編碼核酸酶活性測試

反應體系如下：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），0.2 mol/L NaCl，5 mmol/L MnCl2，0.5 μmol/L pAgos，0.5 μmol/L向導核酸，0.5 μmol/L靶標核酸，加入去離子水補充至總體積20 μL。首先將除了靶標核酸以外的組分混勻，在50 ℃條件下孵育10 min；加入靶標核酸后，將各個pAgos 反應液分別置于相應的溫度下反應1 h，其中TtrAgo、TeAgo、MhAgo和DeAgo的溫度分別為90、90、60和50 ℃；反應結束后加入等體積的2× SSCP去離子甲酰胺凝膠上樣緩沖液，95 ℃變性5 min；取10 μL樣本進行尿素-PAGE，在1 × TBE緩沖液、150 V條件下電泳1 h；將凝膠轉移至藍光切膠儀觀察結果。

2 結果與討論

2.1 pAgos的篩選與序列分析

NCBI的比對結果顯示TtrAgo（NCBI序列號：WP_055429304.1）和TeAgo（NCBI序列號：WP_050002102.1）與PfAgo 的同源性分別為54.46%和33.02%，MhAgo（NCBI 序列號：WP_072865986.1）與MpAgo 的同源性為65.41%，DeAgo（NCBI 序列號：WP_052698403.1）與KmAgo 的同源性為49.8%。由于經文獻報道的活性Agos在催化四聯體（DEDX，X可以為D、H或N）位置高度保守，因此本研究分析了4個候選蛋白和已報道的活性pAgos的氨基酸序列，并以此構建了系統發育樹。結果顯示四個候選pAgos均具有催化四聯體（圖1A），分別為TtrAgo（D538、E576、D608、H725）、TeAgo（D529、E570、D602、H728）、MhAgo（D445、E481、D515、N623）及DeAgo（D529、E564、D598、D715）。在系統發育樹中，各個候選蛋白與對應的參考蛋白均處于相鄰分支（圖1B），表明其親緣關系較近。

圖1 候選pAgos的序列分析Figure 1 The sequence analysis of pAgos (A: Results of sequence alignments; B: The phylogenetic tree)

2.2 pAgos在大腸桿菌系統中的可溶表達

為了分析pAgos 的表達對宿主細胞生長速率的影響，本研究記錄了各個菌株的生長曲線（圖2）。與對照組（含有pET28a空質粒）相比，TtrAgo、TeAgo和MhAgo的表達對細胞的生長無明顯影響，而含有DeAgo 質粒的菌株最終的OD600僅為6 ～ 7 左右，我們推測這可能是由于表達的DeAgo 在大腸桿菌胞內環境下也具有核酸酶活性，因此對細胞產生了一定毒性所導致的。而TtrAgo、TeAgo 和MhAgo 的工作溫度較高，在胞內的核酸酶活性不明顯，因此對細胞的生長影響不大。

圖2 生長曲線Figure 2 The growth curves

對表達了pAgos蛋白的菌液進行SDS-PAGE驗證，結果顯示TtrAgo（88.6 kDa）、TeAgo（89.3 kDa）、MhAgo（77.9 kDa）以及DeAgo（86 kDa）在對應的理論分子量位置均有明顯的可溶表達（圖3）。其中TtrAgo和DeAgo的可溶部分含量與包涵體部分相當，而TeAgo和MhAgo則主要以包涵體形式存在，這可能與pAgos的密碼子、氨基酸序列以及蛋白的結構與功能有關。

圖3 候選pAgos的表達結果Figure 3 The expression of pAgos

2.3 pAgos的純化

對親和層析后的洗脫樣本進行SDS-PAGE分析，以確定是否含有目標蛋白以及目標蛋白純度。結果顯示所有候選蛋白均成功純化（圖4）。其中TeAgo的回收率低于其余3個pAgos，主要原因是其組氨酸標簽與鎳柱的結合強度較低，這可能是由于TeAgo的折疊導致組氨酸標簽未暴露在蛋白表面導致的?？偟膩碚f，利用大腸桿菌表達系統及親和層析可有效獲得高純度的pAgos蛋白。

圖4 候選pAgos的純化結果Figure 4 Purification of pAgos

2.4 候選pAgos的可編碼核酸酶活性

本研究測試了4 個pAgos 在4 種向導核酸，即5’末端磷酸基團或羥基修飾的ssDNA 或RNA 介導下，對DNA或RNA靶標的切割效率。

當以DNA為靶標核酸時，4個pAgos均具有可編碼核酸酶活性（圖5）。其中TeAgo和TtrAgo可在DNA介導下高效切割DNA底物，且5’末端羥基或磷酸基團修飾的向導DNA對應的切割產物大小不一致，表明切割位點不同；MhAgo可在4種向導核酸作用下切割DNA，但效率均不高；DeAgo也能以DNA為向導核酸，但催化效率較低。除此之外，MhAgo與DeAgo的切割產物有多個條帶，表明此時存在多個切割位點。

圖5 4個pAgos的可編碼DNA內切酶活性測試結果（AD分別為TtrAgos、TeAgo、MhAgo和DeAgo對DNA的切割結果；N表示未加入向導核酸的陰性對照，PD表示磷酸修飾的DNA，OHD為羥基修飾的DNA，PR為磷酸修飾的RNA，OHR為羥基修飾的RNA，靶標為FAM-tDNA）Figure 5 The programmable DNA endonuclease of four pAgos (A-D: The results of TtrAgos, TeAgo, MhAgo and DeAgo, respectively; N represented negative control, PD represented P-gDNA, OHD represented OH-gDNA, PR represented P-gRNA, OHR represented OH-gRNA, FAM-tDNA was used as target)

當以RNA為靶標核酸時，4個pAgos也展現出可編碼的RNA切割活性（圖6）。其中TeAgo和TtrAgo的活性最佳，在DNA向導的作用下可將RNA底物切割完全，不過此時的切割位點也受向導5末端的修飾基團影響；MhAgo 的結果與DNA靶標的類似，雖然在向導核酸的類型上具有全能性，但催化效率均不佳；DeAgo 則僅能使用羥基修飾的DNA作為向導，但活性較弱。

圖6 4個pAgos的可編碼DNA內切酶活性測試結果（AD：分別為TtrAgos、TeAgo、MhAgo和DeAgo對DNA的切割結果；N表示未加入向導核酸的陰性對照，PD表示磷酸修飾的DNA，OHD為羥基修飾的DNA，PR為磷酸修飾的RNA，OHR為羥基修飾的RNA，靶標為FAM-tDNA）Figure 6 The programmable RNA endonuclease of four pAgos (A-D: The results of TtrAgos, TeAgo, MhAgo and DeAgo, respectively; N represented negative control, PD represented P-gDNA, OHD represented OH-gDNA, PR represented P-gRNA, OHR represented OH-gRNA, FAM-tRNA was used as target)

3 結語

本研究首先通過序列比對，獲得了與靶序列具有高同源性的候選pAgos氨基酸序列；其次利用大腸桿菌系統實現了候選pAgos的可溶表達，并采取親和層析對目的蛋白進行純化；最后建立了可編碼核酸切割活性的測定方法，并以此測試了TtrAgo、TeAgo、MhAgo以及DeAgo的核酸酶活性。本研究不僅深化了對Ago的理解，且對于后繼Ago核酸酶的研究工作也具有借鑒和參考價值。