紅欖李來源內生真菌Penicillium oxalicum HLLG-13次級代謝產物與生物活性研究

王 越， 張玉琴， 徐喆菲， 白琪琪， 陳文豪， 周學明， 陳光英*

（1.海南師范大學 化學與化工學院，熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室，海南 ?？?571127；2.海南省熱帶藥用植物化學重點實驗室，海南 ?？?571127；3.福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122）

紅樹林是生長在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶，由紅樹植物為主體的常綠喬木或灌木組成的濕地木本植物群落。根據國家林業和草原局濕地管理司于2021年公布的《中國國際重要濕地名錄》，海南省共有紅樹林自然保護區9個，包含國家級自然保護區1個，省級自然保護區2個，以及市縣級自然保護區6個，擁有著豐富的天然藥用紅樹植物資源[1]。紅樹植物紅欖李Lumnitzera littorea（Jacq.） Voigt為使君子科Combretaceae欖李屬Lumnitzera植物，已被列入1999 年8 月4 日中國國務院批準的《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》（Ⅱ級）中，為瀕危物種。本課題組前期從紅欖李內生真菌分離得到了一系列結構新穎的化合物，并表現出較好的生物活性。如：楊靜雨等[2]從紅欖李內生真菌Penicillium sclerotiorumHLL113中分離鑒定出2個新的呋喃衍生物，并且展現出顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50與陽性對照阿卡波糖相當；黃丹瑜等[3]從紅欖李內生真菌Nigrospora camelliae-sinensisS30中分離鑒定出2個新的二酮哌嗪類化合物。為了進一步探究紅欖李內生真菌次級代謝產物中的活性成分，本研究對一株紅欖李內生真菌P.oxalicumHLLG-13的次級代謝產物進行研究，從中分離得到21個單體化合物，分別為2-（4-羥苯基）乙基-（2S）-羥基丙酸（1），2-（4-羥苯基）乙酸乙酯（2），（4-羥苯基）乙酸甲酯（3），4-羥基苯乙醇（4），2,4,5-三甲基間苯二酚（5），1-（2,6-dihydroxyphenyl） butan-1-one（6），rosmarinosin C（7），penicyclone A（8），penicyclone C（9），2-（N-乙酰氨基）苯酚（10），N-乙酰酪胺（11），2-[[（2S）-羥基-1-氧丙基]氨基]苯甲酰胺（12），peniamidone A（13），meleagrin（14），7-羥基-2-（2?S-羥丙基）-5-甲基色酮（15），3-甲基-6,8-二羥基異香豆素（16），（-）-6-hydroxymellein（17），（3R）-甲基-5-氯-6,8-二羥基-二氫異香豆素（18），（3R）-甲基-6,8-二羥基-7-甲氧基-二氫異香豆素（19），（-）-citreoisocoumarinol（20）和de-O-methyldiaporthin（21）（圖1）。

圖1 化合物 1～21的化學結構Figure 1 Structures of Compounds 1-21

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker EsquireHCT 質譜儀，瑞士Bruker公司；Agilent 1260半制備型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；EYELA N-1001旋轉蒸發儀，日本東京理化有限公司；YOKO-ZK紫外分析暗箱，武漢藥科新技術開發有限公司；Bruker VANIII-400 MHz 核磁共振儀，瑞士Bruker 公司；恒溫水浴鍋SB-1000，日本東京理化有限公司；Agilent Eclipse XDB-C18 column（9.4×250 mm, 5 μm）半制備液相柱，美國安捷倫公司；200 ～ 300目薄層層析硅膠，青島海洋化工廠；C-18反相硅膠，Merck 公司；實驗操作過程中所使用的化學試劑均來自廣州西隴化工股份有限公司。

1.2 菌株的分離與篩選

1.2.1 菌株來源

從紅樹植物紅欖李（L.littorea）的根部分離、鑒定、篩選出一株代謝產物豐富并且具有一定神經保護活性的菌株HLLG-13；并對其rDNA的ITS序列進行PCR擴增、純化和測序，在Genbank上通過對真菌核糖體內轉錄間隔區DNA序列的BLAST分析，確定該真菌為P.oxalicum，該菌的Genbank號為OK560165。菌種現保存于海南師范大學化學與化工學院熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室（30% 甘油、70% PDB培養基，-80 °C保存）。

1.2.2 菌株培養

將P.oxalicumHLLG-13菌株取出活化，轉接到PDA培養基上，放在室溫培養箱中培養，2 ～ 3 d后觀察其生長情況（如果是單一菌落，即該菌沒有污染）。再將接有P.oxalicumHLLG-13菌株的PDA培養基平板放置于超凈臺上，用滅菌后的接種針挑取菌株接種至裝有PDB（馬鈴薯葡萄糖水） 培養基的1 L錐形瓶中，每1 L的錐形瓶中裝有300 mL的PDB培養基，28 °C、130 r/min速度下在搖床中搖蕩培養培養3 d，觀察種子菌液的生長情況，待種子菌液在培養基中搖蕩分布均勻即可，得到種子液。從培養好的種子液中取5 mL接種至大米固體培養基中（每瓶80 g大米、100 mL超純水、3 g海鹽，共發酵200瓶），在28 ℃條件下靜置培養28 d。

1.3 提取與分離

發酵28 d后，使用乙酸乙酯（250 mL/瓶，共50 L）浸泡培養基，浸泡3次，每次間隔3 d，合并乙酸乙酯提取物，減壓濃縮后得到乙酸乙酯部位浸膏61.27 g。將浸膏進行正相硅膠柱層析 （200 ～ 300目） 梯度洗脫，用石油醚/乙酸乙酯（體積比，100∶0 ～ 0∶100）和乙酸乙酯/甲醇（體積比，20∶1 ～ 0∶100） TLC分析后合并為9個組分（Fr.1 ～ Fr.9）。組分Fr.4（3.2 g）通過反相硅膠柱層析進行洗脫，使用甲醇/水（1∶9 → 100∶0）的梯度洗脫進行分離，TLC分析后合并為13個組分（Fr.4-1 ～ Fr.4-13）。Fr.4-1（722.8 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比32∶68，3 mL/min），得到化合物16（59.1 mg）和（Fr.4-1-2 ～ Fr.4-1-4）。Fr.4-1-2（36.5 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比20∶80，3 mL/min），得到化合物3（2.6 mg）。Fr.4-1-3（43.2 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比22∶78，3 mL/min），得到化合物5（2.3 mg）。Fr.4-1-4（76.2 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比24∶76，3 mL/min），得到化合物2（6.7 mg）。Fr.4-7（106.3 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比48∶52，3 mL/min），得到化合物1（7.6 mg）。Fr.4-10（2.7 g）通過正相硅膠柱層析進行洗脫，使用石油醚/乙酸乙酯[體積比，梯度(100∶0) → (0∶100）]的梯度洗脫進行分離，通過TLC分析為5 個組分（Fr.4-10-1 ～ Fr.4-10-5）。Fr.4-10-1（84.1 mg）進行半制備HPLC 分析制備（乙腈-水，體積比70∶30，3 mL/min），得到化合物11（2.3 mg）。組分Fr.5（4.1 g）通過反相硅膠柱層析進行洗脫，使用甲醇/水[（1∶9)→(100∶0）]的梯度洗脫進行分離，通過TLC分析為11個組分（Fr.5-1 ～ Fr.5-11）。Fr.5-1（624.3 mg）進行半制備HPLC 分析制備（甲醇-水，體積比8∶92，3 mL/min），得到（Fr.5-1-1 ～ Fr.5-1-5）。Fr.5-1-1（36.2 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比12∶88，3 mL/min），得到化合物4（2.6 mg）和化合物10（6.7 mg）。Fr.5-1-5（22.4 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比8∶ 92，3 mL/min），得到化合物6（2.5 mg）。組分Fr.6（3.9 g）通過反相硅膠柱層析進行洗脫，使用甲醇/水（1∶9 → 100∶0）的梯度洗脫進行分離，通過TLC分析為13個組分（Fr.6-1 ～ Fr.6-13）。Fr.6-1（1.2 g）通過正相硅膠柱層析進行洗脫，使用石油醚/乙酸乙酯[體積比，梯度(100∶ 0) → (0∶100）]的梯度洗脫進行分離，通過TLC分析為8個組分（Fr.6-1-1 ～ Fr.6-1-8）。Fr.6-1-1（206.3 mg）進行半制備HPLC 分析制備（乙腈-水，體積比11∶89，3 mL/min），得到化合物8（41.4 mg）和Fr.6-1-1-2。Fr.6-1-1-2（62.2 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比9∶91，3 mL/min），得到化合物9（6.6 mg）。Fr.6-1-2（107.6 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比10∶90，3 mL/min），得到化合物12（18.4 mg）。Fr.6-1-5（281.7 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比5∶95，3 mL/min），得到化合物7（7.1 mg）和化合物13（4.1 mg）。Fr.6-4（77.6 mg）進行半制備HPLC 分析制備（乙腈-水，體積比19∶81，3 mL/min），得到化合物15（19.3 mg）、化合物20（16.4 mg）和化合物21（4.8 mg）。組分Fr.7（6.2 g）通過反相硅膠柱層析進行洗脫，使用甲醇/水（1∶9 → 100∶0）的梯度洗脫進行分離，通過TLC 分析為10 個組分（Fr.7-1 ～ Fr.7-10）。Fr.7-1（544.0 mg）進行半制備HPLC 分析制備（乙腈-水，體積比20∶80，3 mL/min），得到化合物17（81.0 mg）和化合物19（5.8 mg）。Fr.7-2（27.9 mg）進行半制備HPLC 分析制備（乙腈-水，體積比40∶60，3 mL/min），得到化合物18（3.6 mg）。組分Fr.8（6.2 g）通過反相硅膠柱層析進行洗脫，使用甲醇/水（1∶9→ 100∶0）的梯度洗脫進行分離，通過TLC分析為10個組分（Fr.8-1 ～ Fr.8-10）。Fr.8-5（579.6 mg）進行半制備HPLC分析制備（乙腈-水，體積比40 ∶ 60，3 mL/min），得到化合物14（133.4 mg）。

1.4 抗菌活性測試

采用微量稀釋法測試化合物1～21 對5 株人致病菌[金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida Albicans）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）]和3 株海洋弧菌[哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）]的抗菌活性，具體實驗操作方法參考文獻[4]。二甲基亞砜（DMSO）為陰性對照，環丙沙星為陽性對照。

1.5 神經保護活性測試

采用CCK8方法對化合物1～21進行神經保護活性測試，具體實驗操作方法參考文獻[5]。測試細胞為小鼠海馬神經元細胞（HT22），細胞培養液為90% DMEM-H + 10% FBS，陰性對照組為H2O2損傷組，陽性對照為100 μmol/L依達拉奉。于450 nm波長下測定各孔光吸收值（OD值）。重復實驗3次。各組設定為3個復孔。采用SPSS軟件進行方差分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 化合物結構鑒定

化合物1：無色油狀。陽離子ESI-MS在m/z211.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為210.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C11H14O4，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH: 4.18 (2H, m, H-8), 2.76 (2H, t,J= 6.8 Hz, H-7), 7.02 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.67 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3, 5), 4.08 (1H, m, H-2′), 1.18 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-3′), 9.22 (1H, s, 4-OH), 5.34 (1H, d,J= 6.0 Hz,2′-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 127.8 (C-1), 129.8 (C-2, 6), 115.1 (C-3, 5), 155.9 (C-4), 33.6 (C-7),64.8 (C-8), 174.5 (C-1′), 65.9 (C-2′), 20.4 (C-3′)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[6]數據比對，確定化合物1為2-（4-羥苯基）乙基-（2S）-羥基丙酸。

化合物2：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z181.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為180.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C10H12O3，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,methanol-d4)δH: 4.19 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-1), 2.82 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-2), 7.03 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-4, 8), 6.70(2H, d,J= 8.4 Hz, H-5, 7), 2.00 (3H, s, H-2′)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC: 66.6 (C-1), 35.2 (C-2),130.0 (C-3), 130.9 (C-4, 8), 116.2 (C-5, 7), 157.1 (C-6), 172.9 (C-1′), 20.8 (C-2′)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[7]數據比對，確定化合物2為2-（4-羥苯基）乙酸乙酯。

化合物3：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z167.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為166.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C9H10O3，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,methanol-d4)δH：7.06 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.71 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3, 5), 3.53 (2H, s, H-7), 3.66 (3H, s,H-9)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC:126.3 (C-1), 116.3 (C-2, 6), 131.3 (C-3, 5), 157.6 (C-4), 40.9 (C-7),174.6 (C-8), 52.4 (C-9)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[8]數據比對，確定化合物3 為（4-羥苯基）乙酸甲酯。

化合物4：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z139.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為138.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C8H10O2，不飽和度為4。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH: 6.96 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.64 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3, 5), 2.59 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-7),3.51 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-8), 9.33 (1H, s, 4-OH), 4.57 (1H, s, 8-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 129.3(C-1), 129.6 (C-2, 6), 114.9 (C-3, 5), 155.6 (C-4), 38.3 (C-7), 62.6 (C-8)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[9]數據比對，確定化合物4為4-羥基苯乙醇。

化合物5：棕色粉末。陽離子ESI-MS在m/z153.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為152.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C9H12O2，不飽和度為4。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,CDCl3)δH: 6.26 (1H, s, H-1), 2.12 (3H, s, H-7), 2.09 (3H, s, H-8), 2.19 (3H, s, H-9)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δC: 109.1 (C-1),151.8 (C-2), 107.2 (C-3), 152.7 (C-4), 114.0 (C-5), 135.1 (C-6), 8.3 (C-7), 11.4 (C-8), 20.1 (C-9)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[10]數據比對，確定化合物5為2,4,5-三甲基間苯二酚。

化合物6：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z181.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為180.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C10H12O3，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6):δH7.18 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-4), 6.36 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-3, 5), 3.02 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-8), 1.61(2H, m, H-9), 0.90 (3H, t,J= 7.2 Hz, H-10), 1.24 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-11)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC110.8 (C-1), 161.5 (C-2, 6), 107.2 (C-3, 5), 135.4 (C-4), 207.4 (C-7), 46.1 (C-8), 17.4 (C-9), 13.8 (C-10)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[11]數據比對，確定化合物6為1-（2,6-dihydroxyphenyl）butan-1-one。

化合物7：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z243.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為242.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C11H14O6，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH： 6.64 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.63 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-5), 6.48 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6),3.44 (2H, m, H-7), 3.62 (1H, m, H-8), 4.04 (1H, dd,J= 11.2, 6.4 Hz, H-10a), 3.89 (1H, dd,J= 11.2, 4.2 Hz, H-10b), 3.34 (2H, m, H-11)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 125.0 (C-1), 116.7 (C-2), 145.1 (C-3), 144.2 (C-4),115.4 (C-5), 120.0 (C-6), 39.7 (C-7), 69.3 (C-8), 171.6 (C-9), 65.9 (C-10), 62.6 (C-11)。根據其1H 和13C NMR數據并與文獻[12]數據比對，確定化合物7為rosmarinosin C。

化合物8：棕色油狀。陽離子ESI-MS在m/z241.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為240.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C12H16O5，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH: 5.87 (1H, s, H-2), 4.17 (1H, d,J= 4.4 Hz, H-4), 3.83 (1H, d,J= 4.4 Hz, H-5), 2.21 (1H, dt,J=14.6, 3.8 Hz, H-7a), 2.00 (1H, dt,J= 14.6, 3.8 Hz, H-7b), 1.77 (1H, m, H-8a), 1.23 (1H, m, H-8b), 2.40 (1H, m,H-9), 2.03 (3H, s, H-11), 1.12 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-12)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 196.1 (C-1), 123.4(C-2), 162.0 (C-3), 69.3 (C-4), 70.9 (C-5), 87.8 (C-6), 24.6 (C-7), 24.6 (C-8), 34.8 (C-9), 173.8 (C-10), 21.6 (C-11), 16.9 (C-12)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[13]數據比對，確定化合物8為penicyclone A。

化合物9：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z273.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為272.1，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C13H20O6，不飽和度為4。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH: 5.66 (1H, s, H-2), 4.43 (1H, dd,J= 7.8, 3.6 Hz, H-4), 3.77 (1H, dd,J= 7.8, 4.2 Hz, H-5), 1.73(1H, dt,J= 11.8, 2.8 Hz, H-7a), 1.56 (1H, dt,J= 11.8, 2.8 Hz, H-7b), 1.63 (1H, m, H-8a), 1.46 (1H, m, H-8b),2.37 (1H, m, H-9), 1.91 (3H, s, H-11), 1.07 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-12), 3.59 (3H, s, H-13), 5.16 (1H, s, 4-OH),4.92 (1H, s, 5-OH), 5.26 (1H, s, 6-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 197.8 (C-1), 123.2 (C-2), 159.8 (C-3), 68.5 (C-4), 73.7 (C-5), 75.6 (C-6), 28.7 (C-7), 25.8 (C-8), 39.5 (C-9), 176.4 (C-10), 20.1 (C-11), 16.8 (C-12),51.2 (C-13)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[13]數據比對，確定化合物9為penicyclone C。

化合物10：黃棕色粉末。陽離子ESI-MS 在m/z152.1 處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為151.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C8H9NO2，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.69 (1H, dd,J= 8.0, 1.4 Hz, H-3), 6.72 (1H, m, H-4), 6.91 (1H, m, H-5), 6.84 (1H, dd,J= 8.0, 1.4 Hz, H-6), 2.08 (3H, s, H-8), 9.34 (1H, s, NH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:148.2 (C-1), 126.5(C-2), 122.2 (C-3), 118.6 (C-4), 124.5 (C-5), 115.9 (C-6), 168.8 (C-7), 23.6 (C-8)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[14]數據比對，確定化合物10為2-（N-乙酰氨基）苯酚。

化合物11：黃色油狀。陽離子ESI-MS在m/z180.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為179.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C10H13NO2，不飽和度為5。核磁波譜數據1H NMR (400 MHz, methanol-d4)δH: 3.15 (2H, t,J= 8.8 Hz, H-1), 2.66 (2H, t,J= 8.8 Hz, H-2), 7.00 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-4,8), 6.69 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-5, 7), 1.89 (3H, s, H-2′)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC: 41.5 (C-1), 34.6 (C-2), 130.2 (C-3), 129.7 (C-4, 8), 115.3 (C-5, 7), 156.0 (C-6), 172.3 (C-1′), 21.6 (C-2′)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[15]數據比對，確定化合物11為N-乙酰酪胺。

化合物12：棕色油狀。陽離子ESI-MS在m/z209.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為208.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C10H12N2O3，不飽和度為6。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.75 (1H, dd,J= 7.8, 1.2 Hz, H-3), 7.47 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-4), 7.11 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-5), 8.58 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6), 4.09 (1H, q,J= 6.8 Hz, H-9), 1.29 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-10), 8.16 (1H, s, 7-NH), 7.59 (1H, s, 8-NH), 5.98 (1H, s, 9-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 120.9 (C-1), 138.7 (C-2), 122.4(C-3), 131.8 (C-4), 119.9 (C-5), 128.5 (C-6), 170.3 (C-7), 174.1 (C-8), 67.9 (C-9), 20.9 (C-10)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[16]數據比對，確定化合物12為2-[[（2S）-羥基-1-氧丙基]氨基]苯甲酰胺。

化合物13：棕色油狀。陽離子ESI-MS在m/z226.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為225.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C11H15NO4，不飽和度為5。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.26 (1H, s, H-3), 7.15 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5), 6.72 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6), 3.18 (2H, m,H-8), 1.48 (2H, m, H-9), 1.43 (2H, m, H-10), 3.40 (2H, m, H-11), 8.09 (1H, s, 7-NH)。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC: 148.2 (C-1), 144.8 (C-2), 115.1 (C-3), 126.0 (C-4), 118.8 (C-5), 114.8 (C-6), 166.0 (C-7), 39.0 (C-8), 30.0 (C-9), 26.0 (C-10), 60.6 (C-11)。根據其1H和13C NMR 數據并與文獻[17]數據比對，確定化合物13為peniamidone A。

化合物14：棕色粉末。陽離子ESI-MS在m/z434.2處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為433.2，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C23H23N5O4，不飽和度為15。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.53 (1H, d,J= 7.4 Hz, H-4), 7.24 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-5), 7.26 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-6),6.97 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-7), 5.27 (1H, s, H-8), 10.18 (1H, s, 14-NH), 8.21 (1H, s, H-15), 7.77 (1H, s, H-18),12.96 (1H, s, 19-NH), 6.01 (1H, s, H-22), 4.98 (2H, m, H-23), 1.20 (6H, s, H-24, 25), 3.67 (3H, s, H-26)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 101.4 (C-2), 52.3 (C-3), 126.1 (C-3a), 123.8 (C-4), 123.2 (C-5), 128.0 (C-6),111.6 (C-7), 146.3 (C-7a), 109.2 (C-8), 143.0 (C-9), 158.6 (C-10), 123.2 (C-12), 164.8 (C-13), 107.1 (C-15),124.7 (C-16), 137.3 (C-18), 133.7 (C-20), 41.9 (C-21), 143.4 (C-22), 112.9 (C-23), 24.1 (C-24), 23.2 (C-25),64.8 (C-26)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[18]數據比對，確定化合物14為meleagrin。

化合物15：棕色粉末。陽離子ESI-MS在m/z235.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為234.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C13H14O4，不飽和度為7。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, methanol-d4)δH: 6.05 (1H, s, H-3), 6.61 (1H, dd,J= 2.4, 0.8 Hz, H-6), 6.64 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-8), 2.72(1H, dd,J= 14.4, 5.2 Hz, H-9a), 2.64 (1H, dd,J= 14.4, 7.8 Hz, H-9b), 4.18 (1H, m, H-10), 1.26 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-11), 2.70 (3H, s, H-12)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC: 167.1 (C-2), 118.0 (C-3), 181.9 (C-4),115.8 (C-4a), 143.6 (C-5), 112.5 (C-6), 161.4 (C-7), 101.7 (C-8), 163.1 (C-8a), 44.2 (C-9), 66.3 (C-10), 23.5 (C-11), 23.1 (C-12)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[19]數據比對，確定化合物15 為7-羥基-2-（2?S-羥丙基）-5-甲基色酮。

化合物16：棕色粉末。陽離子ESI-MS在m/z193.0處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為192.0，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C10H8O4，不飽和度為7。核磁波譜數據1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH: 6.41 (s, H-4), 6.29 (d,J= 2.0 Hz, H-5), 6.28 (d,J= 2.0 Hz, H-7), 2.18 (s, H-9)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6).δC: 166.2 (C-1), 153.9 (C-3), 104.2 (C-4), 139.6 (C-4a), 102.5 (C-5), 165.5 (C-6), 101.4 (C-7),162.7 (C-8), 97.6 (C-8a), 18.8 (C-9)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[20]數據比對，確定化合物16 為3-甲基-6,8-二羥基異香豆素。

化合物17：白色粉末。陽離子ESI-MS在m/z195.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為194.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C10H10O4，不飽和度為6。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6,)δH: 4.66 (1H, ddq,J= 12.6, 6.4, 2.8 Hz, H-3), 2.89 (1H, dd,J= 16.4, 3.4 Hz, H-4a), 2.78 (1H,dd,J= 16.4, 11.2 Hz, H-4b), 6.22 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-5), 6.19 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-7), 1.37 (3H, d,J= 6.4 Hz,H-9), 10.60 (1H, s, 6-OH), 11.13 (1H, s, 8-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 169.5 (C-1), 75.4 (C-3),33.8 (C-4), 142.2 (C-4a), 106.8 (C-5), 163.5 (C-6), 100.1 (C-7), 164.5 (C-8), 100.9 (C-8a), 20.3 (C-9)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[21]數據比對，確定化合物17為（-）-6-hydroxymellein。

化合物18：淡黃色粉末。陽離子ESI-MS 在m/z229.0 處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為228.0，結合1H和13C NMR波譜數據，推斷其相對分子式為C10H9ClO4，不飽和度為6。核磁波譜數據：1H NMR(400 MHz, DMSO-d6,)δH: 4.71 (1H, m, H-3), 3.17 (1H, dd,J= 17.0, 2.0 Hz, H-4a), 2.77 (1H, dd,J= 17.0, 11.6 Hz, H-4b), 6.42 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-7), 1.43 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-9), 10.60 (1H, s, 6-OH), 11.21 (1H, s, 8-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 169.0 (C-1), 74.7 (C-3), 31.7 (C-4), 139.0 (C-4a), 110.0 (C-5), 160.4(C-6), 100.8 (C-7), 161.6 (C-8), 101.7 (C-8a), 20.2 (C-9)。根據其1H 和13C NMR 數據并與文獻[22]數據比對，確定化合物18為（3R)-甲基-5-氯-6,8-二羥基-二氫異香豆素。

化合物19：棕色油狀。陽離子ESI-MS在m/z225.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為224.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C11H12O5，不飽和度為6。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 4.68 (1H, ddd,J= 11.4, 6.2, 3.6 Hz, H-3), 2.88 (1H, dd,J= 16.4, 3.4 Hz, H-4a), 2.76 (1H,dd,J= 16.4, 11.2 Hz, H-4b), 6.31 (1H, s, H-5), 1.38 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-9), 3.69 (3H, s, H-10),11.20 (1H, s, 8-OH)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC: 169.7 (C-1), 75.7 (C-3), 33.3 (C-4), 135.9 (C-4a), 106.8 (C-5), 156.0(C-6), 133.5 (C-7), 157.1 (C-8), 100.5 (C-8a), 20.3 (C-9), 59.8 (C-10)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[23]數據比對，確定化合物19為（3R）-甲基-6,8-二羥基-7-甲氧基-二氫異香豆素。

化合物20：棕色晶體。陽離子ESI-MS在m/z281.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為280.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C14H16O6，不飽和度為7。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, methanol-d4)δH: 6.36 (s, H-4), 6.30 (s, H-5), 6.30 (s, H-7), 2.56 (dd,J= 8.4, 14.6 Hz, H-9a), 2.69(dd,J=4.4, 14.6 Hz, H-9b), 4.14 (d, H-10), 1.71 (m, H-11a), 1.61 (m, H-11b), 3.98 (m, H-12), 1.20(d,J= 6.2 Hz, H-13)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC: 167.8 (C-1), 155.9 (C-3), 107.2 (C-4), 141.2 (C-4a), 103.7 (C-5),167.3 (C-6), 102.6 (C-7), 164.8 (C-8), 99.8 (C-8a), 42.5 (C-9), 68.7 (C-10), 46.4 (C-11), 67.1 (C-12), 23.6 (C-13)。根據其1H和13C NMR數據并與文獻[24]數據比對，確定化合物20為（-）-citreoisocoumarinol。

化合物21：棕色晶體。陽離子ESI-MS在m/z237.1處給出準分子離子峰 [M + H]+，推測分子量為236.1，結合1H 和13C NMR 波譜數據，推斷其相對分子式為C12H12O5，不飽和度為7。核磁波譜數據：1H NMR (400 MHz, methanol-d4)δH: 6.37 (s, H-4), 6.30 (s, H-5), 6.30 (s, H-7), 2.58 (m, H-11), 4.14 (m, H-12), 1.25 (d,J= 6.4 Hz, H-13)。13C NMR (100 MHz, methanol-d4)δC: 167.9 (C-1), 156.1 (C-3), 141.2 (C-4), 99.6 (C-5), 164.8 (C-6),107.0 (C-7), 167.9 (C-8), 102.8 (C-9), 103.9 (C-10), 43.8 (C-11), 66.2 (C-12), 23.3 (C-13)。根據其1H 和13C NMR數據并與文獻[25]數據比對，確定化合物21為de-O-methyldiaporthin。

2.2 抗菌活性測試結果

對化合物1～21 進行了金黃葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、白色念珠菌（C.Albicans）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus）8株菌的抗菌活性測試，結果表明化合物1～21對以上菌株均無明顯抗菌活性。

2.3 神經保護活性測試結果

對化合物1～21進行了神經保護活性測試，活性結果顯示化合物16 在10 ～ 200 μmol/L 條件下均展現出一定的神經保護活性，特別是在200 μmol/L濃度條件活性最好，可以將細胞存活率從43.36% 提高至60.15%（表1）。

表1 化合物16對H2O2誘導HT22氧化損傷的細胞活力的影響Table 1 Effect of compound 16 on cell viability of HT22 oxidative damage induced by H2O2

3 結論

運用多種色譜分離手段和波譜鑒定技術，從一株紅欖李（L.littorea）內生真菌P.oxalicumHLLG-13中分離鑒定了21個已知單體化合物，包括7個酚類化合物（1～7），5個含氮類化合物（10～14），6個異香豆素類化合物（16～21），以及3個其他類化合物（8～9, 15）?；钚詼y試結果發現化合物16在10 ～ 200 μmol/L 范圍內具有一定的神經保護活性，在200 μmol/L濃度條件下活性最佳，可以將細胞存活率從43.36%提高至60.15%。本研究可為瀕危藥用紅樹植物紅欖李的可持續開發利用提供理論依據，同時為缺血性腦卒中治療藥物的先導化合物提供了研究基礎。