氣相色譜-質譜聯用儀測定柑橘類水果中2,4-滴的殘留量

陳麗香， 許佩勤

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東 廣州 511442）

2,4-滴，化學名稱為2,4-二氯苯氧乙酸，是一種有機化合物，主要用作除草劑和植物生長調節劑，也可作為殺菌保鮮劑，常在柑橘、番茄、香蕉等果蔬種植中用于防落花落果和延長貯藏保鮮時間[1-2]。世界衛生組織國際癌癥研究機構在2017年10月27日公布的致癌物清單中，2,4-滴為2B類致癌物，對人類有潛在致癌作用。有研究認為，長期暴露超過最大污染水平，2,4-滴可能會對腎臟和肝臟等造成損害，甚至能夠導致畸致癌變[3]。

《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》GB 2763-2021規定了2,4-滴和2,4-滴鈉鹽在柑、橘、橙的最大殘留限量為0.1 mg/kg，指定按照GB/T 5009.175規定的方法測定，該方法采用氣相色譜儀配置電子捕獲檢測器（ECD）檢測，ECD靈敏度高，農產品樣品基質復雜，雜峰干擾多，定性能力較弱，檢出陽性需要再用質譜輔助定性。目前相關文獻報道2,4-滴的檢測方法主要有氣相色譜法[4-5]、氣相色譜質譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜串聯質譜法[10-11]和離子色譜法[12]，多數是研究飲用水中2,4-滴的檢測方法，沒有專門研究柑橘類樣品中2,4-滴的檢測方法。2,4-滴因其具有極性官能團，使得其用氣相色譜分析會有拖尾和吸附現象，為改善其色譜行為，需通過衍生化反應來封閉羥基的氫鍵部位，改善它與固定性相的作用特性。衍生化常用反應有酯化、?；?、烷基化、硅烷化和離子化等，GB/T 5009.175-2003標準方法采用酯化，用14%三氟化硼丁醇溶液將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，該方法用的衍生劑比較難購得且價格較貴。本文研究在酸性條件下采用乙醚提取，硫酸作為催化劑用正丁醇將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，使用氣相色譜-質譜聯用儀測定柑橘中2,4-滴的殘留量，外標法定量，建立柑橘水果中2,4-滴測定的方法，優化后的方法靈敏度高，定性準確，回收率穩定，能更好地監測柑橘類水果中2,4-滴的殘留量，為食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑為市售。

2,4-滴標準物質純度為99.4%，上海安譜璀世標準技術服務有限公司；甲醇，色譜純，上海星可高純試劑有限公司；無水乙醚，分析純，廣州化學試劑廠；正己烷，色譜純，上海星可高純試劑有限公司；丙酮，色譜純，廣州化學試劑廠；正丁醇，分析純，天津康科德技術有限公司；濃硫酸，分析純，廣州化學試劑廠；氯化鈉，分析純，福晨（天津）化學試劑有限公司；實驗用水為Milli-Q-Advantage A10制備的一級水，美國Milli-pore公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀，Agilent GC 7890B，MSD 5977B，配拉出透鏡高靈敏度離子源（EI），美國安捷倫公司；MS 3basic 旋渦混合器，德國IKA 公司；ROTINA 380R 高速冷凍離心機，Hettich 公司；TL-DCII 氮吹儀，北京同泰聯科技發展有限公司；HWS-26水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液的配制：準確稱取2,4-滴標準物質10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 000 μg/mL的標準儲備液，冷凍保存。

1.3.1.2 標準中間液的配制：準確移取標準儲備液（1.3.1.1）100 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，即得1.00 μg/mL的標準中間液，冷藏保存。

1.3.1.3 標準曲線工作溶液的配制：分別準確移取2,4-滴標準中間液（1.3.1.2）0、5.00、10.0、50.0、100、200、500 μL，用甲醇稀釋定容至1 mL，氮吹至干，以下步驟按1.3.2.2與試樣同時處理，最終得0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL的系列標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取 稱取樣品5.00 g置于50 mL離心管，加入5 mL pH 2.0的酸性稀硫酸水溶液，再加入10 mL乙醚，振蕩提取5 min，8 500 r/min離心3 min，將有機相轉移到另一支50 mL離心管中，于殘渣中加入10 mL乙醚，重復提取一次，合并有機相，加入2 g無水硫酸鈉，混勻以吸收水分，放置5 min后轉移到另一條50 mL離心管，用少許乙醚潤洗無水硫酸鈉2次，合并，室溫氮吹至干，待衍生化。

1.3.2.2 衍生化 加入160 μL 正丁醇和40 μL 濃硫酸，加蓋混勻后在45 ℃下衍生50 min，加入2.5 mL 正己烷:丙酮（9+1），渦旋3 min，8 500 r/min離心3 min，將上清液轉移到另一條15 mL塑料離心管中，加3 mL 50 g/L飽和氯化鈉水溶液,渦旋1 min，8 500 r/min 離心3 min，移出有機相，加入約0.3 g無水硫酸鈉進行干燥，將溶劑轉移至進樣小瓶中，供氣相色譜-質譜聯用儀測定。

1.3.3 儀器分析參數

1.3.3.1 色譜條件 色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min；以10 ℃/min升至230 ℃，再以30 ℃/min升至260 ℃保持5 min；進樣口溫度：260 ℃；載氣（He）流速：1.2 mL/min；進樣模式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

1.3.3.2 質譜條件 拉出透鏡高靈敏度離子源（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質譜接口溫度：260 ℃；采集模式：選擇離子掃描（SIM）；溶劑延遲：10 min；定量離子：276；定性離子：185、278。

1.3.4 數據處理

2,4-滴衍生后標準工作液和試樣衍生后溶液通過氣相色譜-質譜聯用儀進行測試，應用安捷倫Mass-Hunter數據處理軟件對數據進行分析處理，以2,4-滴衍生物峰面積為縱坐標（Y），以2,4-滴的濃度為橫坐標（X，mg/L），繪制標準曲線，根據標準曲線計算得到試樣溶劑中2,4-滴的濃度（mg/L），如果試樣溶液中2,4-滴的濃度超出線性范圍時應根據測定濃度進行適當稀釋后再進行分析。同一試樣進行平行試驗測定，平行試驗測定結果的算術平均值為最終測定結果。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考察了2,4-滴衍生物在農殘分析常用的弱極性（TG-5MS）和中極性（DB-1701P）色譜柱上的色譜行為。根據1.3.3儀器分析條件，分析為0.1 mg/kg的2,4-滴衍生物在上述兩種極性色譜柱的出峰情況，總離子流色譜圖如圖1所示。結果表明：2,4-滴衍生物在這兩種色譜柱上峰形尖銳對稱，但弱極性色譜柱的靈敏度比中級性的靈敏度高，中級性色譜柱的雜峰也比較多，故選用弱極性色譜柱進行分析。

圖1 2,4-滴衍生物在弱極性色譜柱（TG-5MS）和中極性色譜柱（DB-1701P）的色譜圖Figure 1 Chromatograms of 2,4-D derivatives with weakly polar (TG-5MS) column and medium polarity (DB-1701P) column

2.2 質譜條件的優化

采用全掃描（SCAN）的采集模式對2,4-滴衍生物（2,4-滴丁酯）進行分析，質譜圖如圖2 所示。質荷比豐度由高到低分別是185、57、276、175、161、278，選擇這幾個質荷比作為特征離子分析沃柑加標樣品，發現57、175 和161 目標峰附近有干擾峰，且不能完全分離，185基線有點漂移，276基線平整且目標峰附近沒有雜峰干擾。根據選擇質荷比大、豐度高及無干擾的原則，最后確定了276作為定量離子，185、278作為定性離子。加標樣品的定量離子和定性離子色譜圖見圖3。

圖2 2,4-滴衍生物全掃描質譜圖Figure 2 Full scan mass spectrum of 2,4-D derivatives

圖3 加標樣品定量離子和定性離子色譜圖Figure 3 Spiked sample quantifier and qualifier chromatograms

2.3 提取次數的確定

在空白沃柑樣品中加入0.1 mg/kg 的2,4-滴標準溶液，除了用乙醚提取次數不一樣，其他步驟按照1.3.2 操作，對比提取1 次、2 次和3 次對加標樣品回收率的影響，每次用10 mL 乙醚提取。比對結果見表1。結果表明，提取1 次回收率偏低，提取2 次和3 次的回收率相差不大，綜合考慮提取效率、實驗時間和成本節省，確定本方法提取次數為2 次。

表1 不同提取次數對回收率的影響Table 1 Effect of different extraction times on the recovery rate

2.4 衍生條件的優化

2.4.1 衍生溫度的確定

配制5個濃度為0.2 μg/mL的標準溶液，氮吹干后，加入160 μL正丁醇和40 μL濃硫酸，在35、45、55、65、75 ℃ 5個不同溫度下各衍生40 min，之后操作同1.3.2.2，比較結果見圖4(a)。結果表明，45 ℃條件下衍生時目標物的響應值最大，故確定45 ℃為衍生溫度。

圖4 不同衍生溫度和衍生時間對2,4-滴衍生物響應值的影響Figure 4 Effect of different derivation temperatures and times on the response value of 2,4-D derivatives

2.4.2 衍生時間的確定

配制5個濃度為0.2 μg/mL的標準溶液，氮吹干后，加入160 μL正丁醇和40 μL濃硫酸，在45 ℃下分別衍生30、40、50、60、70 min，之后操作同1.3.2.2，比較結果見圖4（b）。結果表明，衍生50 min時目標物的響應值最大，故確定衍生時間為50 min。

2.5 標準曲線、檢出限和定量限

按確定的方法進行測定，以定量離子的峰面積為縱坐標（Y），以濃度為橫坐標（X，μg/mL），繪制標準曲線，如圖5 所示。結果表明，在0 ～ 0.5 μg/mL 的線性范圍內，2,4-滴衍生物呈良好線性關系，相關系數（R2）大于0.999。根據3 倍和10 倍定量離子信噪比確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得出2,4-滴的檢出限為0.002 5 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg，可以滿足柑橘中2,4-滴檢測要求。

圖5 2,4-滴的標準曲線圖Figure 5 2,4-D Standard curve

2.6 準確度和精密度

在不含2,4-滴的沃柑空白試樣中分別添加0.005、0.01 和0.1mg/kg 3 個水平做加標回收試驗，每個水平做6 個平行，按照“1.3”實驗方法進行試驗，結果見表2。結果表明，2,4-滴的回收率在86.61%～99.32%之間，RSD 在2.08%～4.46%（n= 6）之間，符合GB/T 27404-2008附錄F中回收率和精密度的要求。

表2 2,4-滴在沃柑中的添加回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 2, 4-D added to citrus

2.7 實際樣品檢測

按照本文建立的方法對市售的30 批柑橘樣品進行檢測，檢測結果見表3。30批柑橘樣品中共有17批樣品檢出2,4-滴，檢出率高達56.7%，其中有6 批樣品的含量高于食品安全國家標準GB 2763-2021 中柑橘的最大殘留限量0.1 mg/kg，不合格率為20%。

表3 實際樣品中2,4-滴的檢測結果Table 3 Detected results of the 2,4-D in real sample

3 結論

本文在酸性條件下采用乙醚提取，硫酸作為催化劑用正丁醇將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，利用氣相色譜-質譜聯用儀測定柑橘中2,4-滴的殘留量。該方法回收率范圍在86.61%～99.32%之間，相對標準偏差在2.08%～4.46%（n= 6）之間，檢出限為0.002 5 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg，符合分析方法的要求，靈敏度高，回收率穩定，能夠滿足柑橘類水果中2,4-滴的定性和定量檢測，為食品安全監督管理提供準確的數據。