氮磷添加下典型溫帶、亞熱帶森林土壤氮循環功能基因豐度和微生物群落屬性數據集

賈彥茹，唐玉倩*，張心昱，于貴瑞，王輝民，陳伏生，田大栓，張雷明

1.中國地質大學，地理與信息工程學院，區域生態與環境變化重點實驗室，武漢 430074

2.中國科學院地理科學與資源研究所，生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室，北京 100101

3.中國科學院大學，資源與環境學院，北京 100190

4.江西農業大學，林學院，南昌 330029

引 言

中國東部森林生態系統是大氣氮沉降最嚴重的區域之一。大氣氮沉降能夠造成土壤氮含量變化、酸化、有機碳含量變化和磷限制[1-2]。氮和磷是調節植物和土壤微生物生長及活性的關鍵限制因素[3-4]。但不同于土壤氮能夠通過氮沉降和生物固氮積累，土壤磷元素的增加速率遠小于氮[5]。在大氣氮沉降增加背景下，磷限制在森林生態系統會進一步加劇。磷限制一方面會影響植物生長、限制生態系統生產力和減少生物多樣性[6]；另一方面，全球變暖影響下土壤有機質分解加速，土壤氮、磷有效性增加，這將進一步影響土壤微生物及微生物驅動的土壤養分循環[3]。有關氮磷添加對森林生態系統土壤微生物影響的數據集可以為養分循環機制研究、森林管理和環境科學研究提供數據和理論支持。

溫帶和亞熱帶森林是中國東部森林中具有典型植被和土壤養分狀況差異的地區。通常認為，氮沉降在亞熱帶森林更嚴重[7]，土壤相對富氮缺磷，而溫帶森林氮沉降相對較輕，土壤相對亞熱帶森林富磷缺氮[8-9]。養分狀況的差異導致氮循環微生物對氮和磷添加有不同的響應[10-15]?；跍貛Ш蛠啛釒珠L期氮磷添加野外聯網控制實驗已經開展了大量基礎數據調查和氮循環過程研究，但仍缺乏系統的氮循環功能微生物屬性的數據集，這將嚴重影響我們對森林土壤氮循環驅動機制及其對全球變化響應機制的深入理解。

氮循環是陸地生態系統最重要的養分循環之一，直接影響生態系統服務和功能的穩定性[16]。土壤氮循環是由微生物驅動的相互聯系的網絡過程，主要包括生物固氮、礦化、硝化和反硝化。這些過程由一系列氮循環功能基因編碼的酶催化[17-18]。固氮微生物可以將大氣中的N2固定成NH3，這個過程是由nifH基因編碼的固氮酶催化[17]。幾丁質是含氮量最豐富的天然大分子之一，其分解是由chiA基因編碼的幾丁質酶催化[19]。硝化過程通常認為包括兩個過程，即氨氧化和亞硝酸氧化[20]。氨氧化過程是自養硝化過程的限速步驟，其涉及的功能基因是氨氧化古菌和氨氧化細菌的amoA基因[20]。反硝化過程涉及一系列連續異化還原過程，逐步將NO3-還原為N2[21]。NO3-通過narG和napA基因編碼的硝酸鹽還原酶還原為NO2-[22]。NO2-主要通過nirK或nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原酶轉化為NO 或N2O[17]。NO 通過氧化氮還原酶轉化為N2O。N2O 通過nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶轉化為N2[23]。靶向氮循環功能基因能夠為氮循環的研究提供更直接的證據。

土壤環境和養分含量是影響氮循環微生物群落和活性的重要因素[17,24-25]。森林生態系統中，土壤理化性質和養分含量沿土壤剖面差異顯著。相對于亞熱帶森林，溫帶森林土壤質地稠密、滲透性弱，溶解性養分難以從土壤表層滲透到下層，導致下層土壤養分含量遠低于表層[18]。因此，氮循環微生物在表層土壤的分布可能不同于下層土壤。同時，受不同氣候和植被狀況的影響，氮循環微生物沿土壤剖面的分布模式在亞熱帶和溫帶森林也是不同的。

本數據集測定和整理了中國東部典型溫帶和亞熱帶森林土壤氮循環功能基因的豐度和群落屬性，涉及氮磷添加聯網控制實驗樣地和無養分添加土壤垂直剖面的樣品。具體數據指標包括氮循環功能基因豐度、群落多樣性和結構以及微生物活性。本數據集的創建和共享將為全球變化氮沉降和磷增加背景下森林土壤氮循環的微生物驅動機制及其模擬研究提供支持，為森林生態系統溫室氣體N2O的排放、氮素淋失和養分管理提供數據和依據。

1 數據采集和處理方法

本數據集涉及3 個森林樣地，即長白山、千煙洲和鼎湖山，分別代表溫帶原生針闊混交林、亞熱帶杉木人工林和亞熱帶次生常綠闊葉混松林3 種典型森林類型。采樣點基本信息、氮磷添加處理及土壤樣品采集過程見表1。所有氮磷添加樣地設置為完全隨機區組設計。鼎湖山、長白山和千煙洲的最高氮添加量相同，均為100 kg N hm-2yr-1，旨在模擬未來氮沉降持續增加的可能影響。長白山和鼎湖山的磷添加量（100 kg P hm-2yr-1）高于千煙洲（50 kg P hm-2yr-1），但基于之前的研究結果，兩個水平磷添加均顯著改變了土壤理化性質和微生物豐度[11-12,25]。同時，氮磷添加樣品采集時，長白山、千煙洲和鼎湖山三個樣地均已施肥3 年，且三地的施肥樣地采樣時間均為距上次施肥30 d 左右。因此認為三地的氮磷添加設置具有可比性。

土壤樣品過2 mm 篩后分小份保存。其中一份樣品放于4 ℃，用于測定土壤含水量、pH、土壤NO3-、NH4+、速效磷和溶解性有機碳含量；第二份樣品烘干后研磨，過0.25 mm 篩，用于測定總有機碳、總氮和總磷含量；第三份樣品保存于-80 ℃，用于DNA 提取及后續的分子實驗；第四份存放于4 ℃，并盡快用于測定微生物活性。

1.1 土壤理化性質測定

每個樣品重復三次測定土壤理化性質。土壤pH 值使用玻璃電極測定體積比為2:5 的土:水懸浮液。土壤含水量用烘干法測定。用2 mol/L KCl 溶解提取NO3-和NH4+，并且用0.025 mol/L HCl-0.03 mol/L HN4F 溶液提取速效磷，然后用連續流動自動分析儀(Bran Lubbe, AA3, Germany)測量NO3-、NH4+和速效磷的濃度[26]。使用總有機碳分析儀(Liqui TOC II, Elementar, Germany)測定溶解性有機碳濃度?？偺己涂偟臐舛仁褂肅N 分析儀(Vario Max, Elementar, Germany)測定。土壤總磷使用H2SO4和HClO4消解，在700 nm 處用自動分光光度儀測定。土壤N2O 排放的測定采用靜態箱法。氣體采集時間為當日8:00–11:00，在40 min 時段內，用100 mL 注射器在0, 10, 20, 30, 40 min 時分別抽取1次氣體樣品，每個樣方共采集5 個氣樣，并于采集后24 h 內完成濃度測定。施肥一周后連續采樣。

1.2 氮循環功能基因豐度測定

采用Power Soil DNA Isolation Kit 試劑盒(Mo Bio, Carlsbad, CA, USA)進行土壤總DNA 提取，所提取的DNA 用微量紫外分光光度計(Nanodrop Technologies, USA)檢測其濃度和純度。DNA 保存于-20 ℃備用。利用SYBR Green Premix (TaKaRa Bio Inc.)熒光試劑，通過Eco Real-Time PCR System(Illumina)對土壤氮循環功能基因進行定量分析。氮循環各過程功能基因nifH、chiA、氨氧化古菌amoA、氨氧化細菌amoA、qnorB、narG、nirK、nirS、nosZ擴增特異引物和退火溫度等信息見表2。

表2 氮循環各功能基因的功能和PCR 擴增引物信息Table 2 Functions and primer pairs for nitrogen-cycling functional genes used in PCR

1.3 氮循環功能基因高通量測序

根據表2 對功能基因進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。利用QIAEX II?Gel Extraction Kit (Qiagen)對擴增產物進行回收并測定濃度，然后將PCR 產物混合，使各樣品用于高通量測序的DNA 濃度一致。高通量測序委托北京新科開源基因科技有限公司完成。對測序的初步數據通過next generation sequencing toolkit (NGS version 2.3.1)進行過濾[36]。然后對干凈的序列進行注釋，除chiA注釋信息來自NCBI 數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)外，其他功能基因注釋信息來自FunGene 數據庫[37]。用Vsearch 軟件在97%相似度劃分分類單元（OTU）[38]，并舍掉數目少于2 個的OTU。通過Mothur 計算各功能基因的香濃多樣性指數[39]。所有測序序列上傳至NCBI Sequence Read Archive (SRA)數據庫。長白山施肥樣地氨氧化細菌amoA、氨氧化古菌amoA、nirS、nirK、nifH和chiA對應的序列號分別為SRR5621828、SRR5621829、SRR5621826、SRR5621827、SRR5621833、SRR5621832；千煙洲施肥樣地氨氧化古菌amoA和nirK對應的序列號為SRR3342862-SRR3342865和SRR3310928-SRR3310931；鼎湖山施肥樣地氨氧化細菌amoA、氨氧化古菌amoA、nirS、nirK、nifH和chiA對應的序列號分別為SRR5621830、SRR5621831、SRR5621824、SRR5621825、SRR5621835、SRR5621834；土壤剖面樣品的chiA、nifH、氨氧化古菌amoA和nirS基因對應的序列號分別為SRR5533727、SRR5533729、SRR5533730、SRR5533726。

1.4 氮循環微生物潛在活性測定

土壤凈硝化速率利用室內培養法測定[40]。鮮土10 g 置于100 mL 的聚乙烯瓶中，在20 °C 培養箱中培養14 d。通過最終和最初單位干土中NO3-的變化量計算土壤的凈硝化速率，單位為μg NO3--N g-1soil d-1。

硝化潛勢的測定采用懸漿培養法[41]。鮮土2.5 g 中加入35 mL 含1 mmol/L (NH4)2SO4的培養液，并置于30 ℃，200 rpm 震蕩，黑暗中培養48 h。每隔12 h 開瓶通風20 min 保證有氧環境。在培養的第20 min、48 h 分別取5 mL 懸漿用于測定NO2-、NO3-含量。硝化潛勢用μg N-(NO3-+NO2-)h-1g-1表示。

反硝化潛勢的測定采用乙炔抑制法[42-43]。鮮土4 g 置于150 mL 含培養液（含KNO3：50 μg N g-1干土，葡萄糖：0.5 mg C g-1干土和谷氨酸鈉：0.5 mg C g-1干土）的厭氧瓶中，震蕩混勻。將厭氧瓶抽真空后持續通入N2-C2H2（90:10 體積比）的混合氣，以制造厭氧環境并抑制N2O 的還原。分別在培養的初始時刻和培養后2 h 抽取氣體樣品，利用氣相色譜儀(Agilent 7890A, USA)測定N2O 濃度。反硝化潛勢用ng N-N2O h-1g-1干土表示。

固氮微生物活性的測定采用乙炔還原法[44]。鮮土10 g 置于120 mL 血清瓶中，滴加葡萄糖溶液，使土壤中的C 含量保持在1 mg C g-1土壤，密封后混勻。抽取10 %瓶中空氣后注入同體積的乙炔。在28 °C 恒溫黑暗培養2 d。培養結束后，抽取50 μL 氣體樣品，用氣相色譜儀(Agilent, 7890A, USA)測定培養瓶中乙烯（C2H4）氣體濃度。固氮酶活性單位用乙炔還原速率表示，單位nmol C2H4h-1g-1。

有機氮分解潛勢采用MUB 底物結合微孔板熒光法測定β-1,4-乙?；?葡糖胺糖苷酶（β-1,4-Nacetyl-glucosaminidase, NAG）活性[45]。具體操作為：取1 g 鮮土，用醋酸緩沖液充分混勻，制備土壤懸浮液，吸取200 μL 土壤懸浮液和50 μL 4-甲基傘形酮酰-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷（4-MUB-Nacetyl-β-D-glucosaminide）底物于96 孔板。20 °C 黑暗中培養4 h，加入10 μL 1 mol/L 的NaOH 終止反應。標準物質是4-甲基傘型酮(4-MUB, 4-methylumbelliferyl)，在365 nm 波長處激發，450 nm 波長處測定。NAG 活性的單位是nmol h-1g-1。

2 數據樣本描述

本數據集集合了東部典型溫帶（長白山）和亞熱帶森林（鼎湖山和千煙洲）聯網控制實驗氮磷添加樣地和無氮磷添加樣地土壤垂直剖面中氮循環功能基因豐度、群落多樣性和組成、氮循環微生物潛在活性和土壤理化性質的數據。

數據集由2 個Excel 文件組成：Excel 1 為氮循環微生物屬性相關數據，Excel 2 為土壤理化性質數據。Excel 1 由7 個Sheet 組成，具體內容及字段含義見表3。

表3 本數據集Excel 1 內容及字段含義Table 3 Data content and descriptions in Excel 1

Excel 2 為土壤理化性質數據，由2 個Sheet 組成，具體內容及字段含義見表4。Excel 中的空白項為未測定數據。

表4 本數據集Excel 2 內容及字段含義Table 4 Data content and descriptions in Excel 2

3 數據質量控制和評估

3.1 季節差異、采樣和樣品測試誤差控制

長白山溫帶森林和鼎湖山亞熱帶森林采樣時間為8 月，為植物生長季；千煙洲亞熱帶森林土壤采樣時間為4 月，盡管季節上存在差異，但是也基本進入了亞熱帶的生長季。因此，所采樣品能夠代表氮磷添加影響下典型溫帶和亞熱帶森林土壤。

所有土壤樣品的采集均采用五點采樣法，以保證樣品的均勻性和代表性。同時，采樣均在無降水天氣晴好的時間進行。此外，除測序外，土壤理化性質和微生物屬性的測定均在中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室嚴格按照標準流程進行，以降低測試誤差。

3.2 功能基因豐度數據質量控制

氮循環功能基因豐度測定時，陰性對照、樣本和標準品一式三份同時擴增，優化擴增條件確保擴增效率達到90%–110%，R2值達到0.996–0.999。定量PCR 擴增產物的特異性通過溶解曲線估計，擴增片段的大小使用瓊脂糖凝膠電泳法確定。

3.3 功能基因高通量測序數據質量控制

原始序列通過Next Generation Sequencing toolkit (NGS version 2.3.1) 進行質量篩選[36]，其中短于200 bp 的序列、長于6 bp 的均聚物、包括模糊堿基或者超過50 %的低質量堿基數（average Q value<15）的片段被移除。為獲得高質量的測序序列，通過Mothur 軟件移除條形碼和錯誤序列，通過UCHIME 算法移除嵌合體序列，通過pre.cluster command (diffs=2)對序列進行降噪處理。

3.4 氣體樣本N2O 數據質量控制

氣體N2O 的采集采用施肥后一周連續采樣，減少N2O 通量日波動的影響。樣本采集后，在一天內完成樣本濃度測定，避免其他氣體的污染。每個樣方重復測量5 次，減少測量誤差。

4 數據價值

目前已有數據集提供中國森林生態系統的土壤性質、土壤微生物分類和大氣氮沉降數據。然而還沒有基于中國典型森林生態系統氮磷添加聯網實驗平臺的氮循環功能微生物屬性數據集，也沒有系統的數據集展示氮循環微生物在土壤剖面的分布模式。本數據集選取中國東部具有代表性的典型森林生態系統，以溫帶針闊混交林，亞熱帶杉木人工林和亞熱帶次生林作為研究對象，旨在對比不同森林類型中土壤氮循環微生物的不同分布模式，及其在全球變化氮沉降和磷添加影響下的不同響應。本數據集既可以與之前發表的溫帶、亞熱帶森林生態系統碳水通量[46-48]和土壤理化性質[49]等數據協同使用，也對缺乏的溫帶、亞熱帶森林土壤微生物數據做了補充。

本數據集的各項指標測定均基于全國聯網氮磷添加實驗平臺，保證了各臺站之間數據的有效性和可比性，能夠為溫帶和亞熱帶森林氮循環過程對全球變化氮沉降和磷添加的響應機制提供數據基礎。鑒于功能微生物在調節氮循環過程中的重要生態作用，本數據集提供的氮循環功能基因豐度和氮循環微生物活性等數據有助于深入理解森林生態系統中氮循環的微生物驅動機制，為研究陸地生態系統養分周轉和溫室氣體排放機制提供數據支撐，為降低森林土壤養分損失的管理措施提供數據和依據。

致 謝

感謝中國生態系統研究網絡（CERN）長白山、千煙洲和鼎湖山野外臺站和樣地負責老師以及樣地維護人員對本項目取樣和指標測定提供的便利和幫助。

數據作者分工職責

賈彥茹（1998—），女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向為土壤微生物生態學。主要承擔工作：數據匯編、整理和論文撰寫。

唐玉倩（1985—），女，山東煙臺人，博士，研究方向微生物生態學。主要承擔工作：數據測定、匯編、整理和論文撰寫。

張心昱（1973—），女，遼寧桓仁人，研究員，研究方向為地球環境化學。主要承擔工作：鼎湖山站數據檢測和技術指導；數據質量控制，技術指導和論文修改。

于貴瑞（1959—），男，遼寧大連人，研究員，研究方向生態學。主要承擔工作：項目統籌和論文修改。

王輝民（1967—），男，吉林長春人，研究員，研究方向生態學。主要承擔工作：千煙洲站數據檢測和技術指導。

陳伏生（1973—），男，江西永豐人，教授，研究方向生態學。主要承擔工作：千煙洲站杉木林施肥樣地建立和維護，數據檢測和技術指導。

田大栓（1985—），男，內蒙古呼和浩特人，副研究員，研究方向生態學。主要承擔工作：長白山站數據檢測和技術指導。

張雷明（1974—），男，河南開封人，副研究員，研究方向生態學。主要承擔工作：數據和技術指導。