凍結過程中面團水分均勻度及面筋蛋白網絡結構變化規律研究

張艷艷,吳昊,白冰潔,張普,谷瑞麗,張華

1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院/冷鏈食品加工與安全控制教育部重點實驗室,河南 鄭州 450001;2.中原食品實驗室,河南 漯河 462300;3.河南省食品和鹽業檢驗技術研究院 國家市場監管重點實驗室, 河南 鄭州 450003

0 引言

冷凍處理是一種常用食品保藏技術,具有易保藏、易運輸等特點,被廣泛應用于中國傳統面制品加工生產中[1]。然而,冷凍處理會使面團品質下降,主要表現為面團持氣能力、持水能力和彈性下降,黏性和硬度增加,面團內部孔隙變大,面筋結構變差,等等[2-3]。水作為面筋蛋白與淀粉交聯作用的介質,其含量、物理狀態、位置等對最終產品品質的影響至關重要[4]。面粉加水后,經混合攪拌形成面團,再經一段時間的靜置,可使面團組分的交聯分布更均勻、更穩定[5-6]。但在冷凍過程中,原本均勻分布在面團中的水分會發生遷移,水分子與蛋白質間的相互作用被破壞,水分不斷向細小的冰晶遷移靠近,使得面團微孔內的冰晶不斷生長變大,而大冰晶會刺破面團組織,破壞面筋蛋白網絡結構,導致面團品質劣變[7]。

目前,研究者主要關注冷凍后、儲藏過程中及添加改良劑后面團的品質[8-10],如陳麗等[11]利用低場核磁共振技術測定和面過程中及凍藏過程中面團的水分結合狀態及分布情況,發現水分主要以弱結合水的形式存在,當和面時間為5 min時,弱結合水發生的遷移量最大,冷凍面團的冰晶孔洞面積較小且數量較少。王世新等[9]研究發現,隨著加水量的增加,與未冷凍處理的面團相比,冷凍面團的黏性增大,面筋蛋白二級結構的β-折疊和α-螺旋比例增加。楊勇等[12]研究發現,到達凍結終點所需的時間越久,冷凍面團網絡的孔隙越大,水分的遷移量越多,質構特性及流變學特性越差。面團中水分的動態變化使水分趨于均勻分布,而凍結過程中水分逐漸變成冰晶,面團的水分分布、冰晶形態逐漸改變,進而導致水分均勻度及面筋蛋白網絡結構改變,但相關的機理研究鮮有報道。

基于此,本文擬在前期原位表征分析面團冷凍過程中面筋蛋白分子結構與水分分布的基礎上[13],研究不同加水量面團凍結過程中的凍結曲線、水分均勻度變化,分析冰晶生長對面筋蛋白網絡結構及維持其結構穩定性的化學作用力的影響,以期為面團冷凍技術的完善及最終產品品質的提高提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

金苑精制粉(淀粉、蛋白質、脂肪和水的含量分別為74.0%、11.0%、2.1%和11.0%),河南金苑糧油有限公司;純凈水,鄭州輕工業大學自制。

1.2 主要儀器與設備

JA20002型電子天平,上海良平儀器儀表有限公司;HA-3480A型全自動和面機,克萊美斯機電科技有限公司;NMI-20-060V-I型高性能變溫核磁共振成像分析儀,上海紐邁電子科技有限公司;AT4508型多路溫度測試儀,常州安柏精密儀器有限公司;JSM-6490LV型掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社;LSM710型激光共聚焦掃描顯微鏡(SEM),德國蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 面團制備參考Y.L.Jiang等[8]的方法,并稍作修改。稱取300 g金苑精制粉于全自動和面機中,分別加入質量分數為40%、45%、50%和55%的純凈水,于60 r/min條件下攪拌10 min,形成面團,再通過壓面機壓延5次,靜置醒發60 min,使面團質地更均勻,備用。

1.3.2 凍結曲線測定將制備的面團用自封袋密封,于-20 ℃冰箱中冷凍,需提前調整好超低溫冷凍儲存箱的溫度,并平衡24 h。使用多路溫度測試儀記錄面團中心溫度的變化,每隔10 s記錄一次面團中心溫度,直至面團中心溫度達到-18 ℃。

1.3.3 水分均勻度測定參考M.Li等[14]的方法,對面團進行低場核磁成像檢測。圖片像素點的標準差由下式計算得到:

1.3.4 冰晶形態測定將面團的SEM圖加載到Matlab 2016a軟件中,參考Z.L.Pan等[15]的程序方程,計算面團冰晶的平均孔隙面積、孔隙數量和孔隙率。

1.3.5 面筋蛋白網絡結構定量分析參考Z.H.Huang等[16]的方法,切取2.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的面團,不要用力擠壓,避免對內部結構的破壞。將面團浸泡在體積分數為2.5%的戊二醛溶液中,固定12 h,切成10 mm厚的薄片,用質量濃度為0.25 g/L的羅丹明B對蛋白質避光染色5 min,用去離子水洗脫3 min后,將薄片置于激光共聚焦培養皿上,用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察,羅丹明B的激發波長為568 nm,發射波長為625 nm。

參考I.Lucas等[17-18]的方法,基于激光共聚焦掃描顯微鏡圖像對面筋蛋白網絡結構進行量化分析,使用Angio-Tool軟件計算分支率和終點率。

1.3.6 化學作用力測定參考F.H.Cao等[19]的方法,并稍作修改。取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的面團,冷凍至不同溫度(25 ℃、0 ℃、-3 ℃、-6 ℃、-9 ℃、-12 ℃、-15 ℃和-18 ℃)后,分別與5 mL 濃度為0.05 mol/L的NaCl溶液(SA)、濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液(SB)、濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液+濃度為1.5 mol/L的尿素溶液(SC)、濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液+濃度為8 mol/L的尿素溶液(SD)和濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液+濃度為8 mol/L的尿素溶液+濃度為50 mmol/L的DTT溶液(SE)混合,室溫下振蕩2 h,于10 000 r/min條件下離心20 min。取0.1 mL上清液,加入5 mL考馬斯亮藍G250,渦旋均勻后靜置2 min,測定其吸光度OD595。以牛血清蛋白為參考,根據吸光度(y)和蛋白質含量(x)繪制標準曲線。離子鍵含量以溶解于SB與SA中的蛋白質含量之差表示;氫鍵含量以溶解于SC與SB中的蛋白質含量之差表示;疏水相互作用的貢獻以溶解于SD與SC中的蛋白質含量之差表示;二硫鍵含量以溶解于SE與SD中的蛋白質含量之差表示[20]。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2010處理數據,利用Origin 2018軟件作圖,通過SPSS 23軟件的Duncan多重比較法進行單因素方差分析,檢驗數據的顯著性(P<0.05,差異顯著)。每個實驗均重復3次,實驗數據以(平均值±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 凍結過程中面團的凍結曲線分析

根據溫度變化,面團的凍結過程可分為3個階段:第1階段從面團初始溫度降溫至冷凝點0 ℃;第2階段從0 ℃降溫至-5 ℃,也稱最大冰晶生成帶;第3階段從-5 ℃降溫至凍結終點-18 ℃,也稱深凍階段[21]。加水量對面團凍結曲線的影響如圖1所示。由圖1可知,第1階段溫度降低較快,曲線斜率較大;第2階段曲線相對平直,大量水分在此階段轉變為冰晶,釋放出潛熱,溫度下降較慢,80%以上的水分被凍結;第3階段面團內部剩余的水分逐漸凍結成冰晶。面團總冷凍時間和通過最大冰晶生成帶的時間越短,面團內部大冰晶的比例越低,冷凍對面團的影響越小,更利于保護面團品質[12]。隨著加水量的增加,面團中心溫度達到-18 ℃所需時間呈先短后長的趨勢,當加水量為45%時,面團中心溫度達到-18 ℃所需時間最短(為38 min),這可能是因為50%和55%加水量的面團內部水分均較多,在凍結過程中釋放的潛熱也較多。而45%加水量面團比40%加水量面團內部水分分布更均勻且擁有更多晶核,生成的冰晶更小,凍結速率更快。因此,當加水量為45%時,經冷凍處理后的面團其品質優于其他加水量。

圖1 加水量對面團凍結曲線的影響Fig.1 Effect of water addition on the dough freezing curve

2.2 凍結過程中面團水分均勻度分析

水分均勻度是對低場核磁成像的圖像進行標準差計算得到的。圖像的標準差可衡量圖像中像素點像素值與均值之間的離散程度,間接反映面團中水分的分布情況,標準差越小,離散程度越小,表明面團中的水分越均勻,反之,越不均勻[22]。凍結過程中,隨著溫度的下降,面團內部水分逐漸轉變為冰晶,氫質子信號強度隨之下降直至檢測不到。水分均勻度可量化這一過程,且水分均勻度變化越大,冰晶生長越快。面團凍結過程中水分均勻度的變化見表1。由表1可知,隨著溫度的降低,不同加水量面團的水分均勻度整體呈下降趨勢。在-3 ℃降溫至-6 ℃階段,40%、50%和55%加水量面團的水分均勻度分別下降33.48、47.01和46.29后趨于穩定,這可能是因為0 ℃降溫至-5 ℃階段屬于最大冰晶生成帶,在此區間內,絕大多數水分由液態變為固態,冰晶急劇生長,面筋蛋白網絡結構被破壞,導致冷凍面團品質變差。而45%加水量面團在-3 ℃降溫至-6 ℃階段的水分均勻度下降27.42,在-6 ℃降溫至-9 ℃階段下降11.37,表明在凍結過程中,45%加水量面團的冰晶生長較溫和,減緩了冰晶對面筋蛋白網絡結構的破壞,有利于提升冷凍面團的品質。在凍結終點(-18 ℃),水分均勻度隨著加水量的增加先減小后增大,在加水量為45%時達到最小值,表明45%加水量面團在凍結終點的水分分布和冰晶分布較為均勻,對面團品質的影響較小[23]。結合凍結曲線,選擇加水量為45%的面團進一步研究凍結過程中面筋蛋白網絡微觀結構及化學作用力的變化。

表1 凍結過程中面團水分均勻度的變化Table 1 Changes in moisture uniformity indicators during dough freezing process

2.3 凍結過程中冰晶形態變化分析

使用Matlab 2016a軟件對面團的SEM圖進行冰晶孔隙分析,并進一步量化面團中冰晶孔隙的分布和大小。凍結過程中面團冰晶孔隙如圖2所示,其中白色區域是面團內部的冰晶和可凍結水,黑色區域是面團的背景[24]。由圖2可知,從25 ℃降溫至0 ℃階段,面團內部水分分布較均勻;從0 ℃降溫至-6 ℃階段,水分轉變為冰晶且孔隙面積逐漸變大、數量減少較快,這可能是因為該階段屬于最大冰晶生成帶,大量水分聚集轉化為冰晶且體積增大;從-6 ℃降溫至-9 ℃階段,冰晶大量生成,冰晶孔隙面積快速增大,這與該階段水分均勻度快速減小相對應;從-9 ℃降溫至-18 ℃階段,冰晶重結晶且顆粒不斷變大,破壞面筋蛋白網絡結構,導致更大的孔隙形成。凍結過程中產生的大冰晶會對面筋蛋白網絡結構造成機械損傷,使面團持氣性減弱,導致面團解凍后的加工性能變差[25]。

圖2 凍結過程中面團冰晶孔隙圖Fig.2 The void map of the ice crystals during dough freezing process

凍結過程中面團冰晶孔隙參數的變化見表2。由表2可知,隨著溫度的降低,孔隙數量不斷減少,平均孔隙面積不斷增大且在-6 ℃降溫至-9 ℃階段快速增大,表明該溫度范圍內冰晶快速生成。溫度繼續降低,小冰晶逐漸聚集生長為大冰晶,進一步破壞面團面筋蛋白網絡結構。

表2 凍結過程中面團冰晶孔隙參數的變化Table 2 Changes in the pore parameters of the ice crystals during dough freezing process

2.4 凍結過程中面筋蛋白網絡微觀結構定量分析

凍結過程中面筋蛋白微觀結構如圖3所示,其中,羅丹明B標記的面筋蛋白顯示為紅色,黑洞代表面筋蛋白網絡結構中的孔隙或淀粉顆粒。由圖3可知,在室溫(25 ℃)下,面團中的面筋蛋白網絡結構是完整和連續的,淀粉顆粒填充于面筋蛋白網絡結構中且二者交聯緊密。隨著溫度的降低,面筋蛋白網絡結構逐漸松散,面筋蛋白被冰晶擠壓聚集成塊狀,與淀粉顆粒間的相互作用降低。

圖3 凍結過程中面筋蛋白網絡微觀結構Fig.3 Microstructure of gluten protein network during dough freezing process

面筋蛋白網絡結構參數分支率和終點率可反映面筋蛋白的凝聚力,其中,分支率與面筋蛋白網絡分布的均勻性密切相關,分支率越大,面筋蛋白網絡分布越均勻;終點率可用來表征面筋蛋白的連續性,終點率越小,面筋蛋白的連續性越好[18]。凍結過程中面筋蛋白網絡結構參數分支率和終點率的變化見表3。由表3可知,隨著溫度的降低,分支率從2.20×10-3逐漸降低至1.90×10-3,終點率從2.10×10-3逐漸升高至2.40×10-3,說明冰晶增大導致面筋蛋白網絡結構被破壞,分布不均勻,面團品質隨之下降。

表3 面團凍結過程中面筋蛋白網絡結構參數分支率和終點率的變化Table 3 Changes in branch rate and endpoint rate of gluten protein network structure during dough freezing process

2.5 凍結過程中面筋蛋白化學作用力變化分析

化學作用力對面筋蛋白網絡結構的穩定性具有重要作用[25],其中,由氨基和羧基的帶電基團形成的離子鍵對維持面筋蛋白三級結構的穩定性具有重要作用;形成于水分子之間、蛋白質表面基團與結合水之間的氫鍵對維持面筋蛋白二級結構的穩定性具有重要作用;疏水相互作用會隨著面筋蛋白中非極性氨基酸側鏈微環境的變化而變化,疏水基團暴露越多,疏水作用越強;二硫鍵是維持面筋蛋白三級結構穩定性的重要作用力,同時也是促進面筋蛋白網絡形成的重要化學鍵[26]。面團凍結過程中面筋蛋白化學作用力的變化如圖4所示,其中不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。由圖4可知,隨著溫度的降低,氫鍵逐漸減少。冰晶的生長會減弱水分子之間、蛋白質表面基團與結合水之間的氫鍵作用,破壞面筋蛋白二級結構,并使二級結構向無序化轉變[13]。隨著冰晶的形成,面筋蛋白網絡的交聯被破壞,二硫鍵逐漸減少,另外,面筋蛋白三級結構逐漸舒展開,羧基與氨基間的離子鍵及巰基間的二硫鍵維持面筋蛋白三級結構的作用力也隨之下降,蛋白質內部的疏水性基團被更緊密地包裹,最終導致疏水相互作用減弱。而疏水相互作用在-12 ℃的突然升高,可能是因為冰晶已形成較大顆粒,對蛋白質結構破壞程度較大,使得蛋白質中疏水性基團暴露,增大了疏水相互作用,而冰晶隨著溫度降低進一步變大,繼續擠壓蛋白質,其疏水相互作用持續降低[27]。

圖4 面團凍結過程中面筋蛋白化學作用力的變化Fig.4 Changes in the chemical force of gluten proteins during dough freezing process

3 結論

本文研究了凍結過程中不同加水量面團的凍結曲線、水分均勻度、面筋蛋白網絡微觀結構及維持其結構穩定性的化學作用力,得到如下結論:隨著凍結溫度的降低,不同加水量面團的水分均勻度逐漸下降,冰晶逐漸變大且對面團的破壞不斷增大,面筋蛋白網絡間的相互作用力逐漸減弱,加水量為45%的面團達到凍結終點的時間最短,經過最大冰晶生成帶的速率最快,水分均勻度下降最迅速,對面筋蛋白網絡結構的破壞最小。隨著凍結溫度的降低,45%加水量面團的冰晶平均孔隙面積逐漸變大,孔隙數量逐漸變少,冰晶膨脹破壞了面筋蛋白網絡結構的完整性,進一步減弱了維持蛋白高級構象的各種化學鍵。下一步將對面筋蛋白的理化特性及結構性質進行表征,以深入研究冷凍過程中面筋蛋白的分子性質及結構變化。