環狀RNA在食管癌診斷和預后中的研究進展

馬麗霞,左志向,石林林,李佳怡,喻 瑩,谷變利,魯智豪,高社干

2020年全球癌癥統計數據顯示,食管癌新發60.4萬例,死亡54.4萬例,發病率位列第七,死亡率位列第六位,通常食管癌病理類型90%以上是食管鱗癌[1]。由于食管癌早期癥狀不明顯,多數患者發現時已至中晚期,且預后較差[2]。雖然近年來食管癌患者的治療和管理得到了很大的改善,但總的5 a生存率(約10%)和食管癌切除術后5 a生存率(15%～40%)仍然很低[3]。因此,挖掘食管癌早期診斷和治療的分子標志物迫在眉睫。

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種非編碼RNA,其3′端和5′端共價結合形成閉合環狀結構,對核酸外切酶不敏感,因此結構較為穩定;同時具有組織特異性和序列保守性等特點[4-5]。circRNA最初在20世紀末的RNA病毒中被發現,且被認為是轉錄背景噪音,沒有生物學功能[6]。隨著高通量測序技術和生物信息學方法的應用,circRNA的研究才有了重大進展;隨后,circRNA在不同組織和細胞中的表達譜及重要功能被揭示[7-8]。多項研究已經證實circRNA在轉錄和轉錄后水平調控基因表達,通過改變細胞增殖、分化和凋亡,參與腫瘤的發生發展,并可作為腫瘤標志物[9]。

基于此,本文對circRNA在食管癌診斷和預后中的作用及研究進行綜述。

1 circRNA的特點及生物學功能

circRNA主要通過反向剪接機制產生,這一過程不同于經典剪接。迄今為止,circRNA生物發生機制的3種假設模型已被廣泛接受,其中包括RNA結合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)介導、內含子配對驅動和套索驅動環化[10-16](見圖1A)。根據起源,circRNA可分為4種類型,即外顯子circRNA、外顯子內含子circRNA、內含子circRNA和基因間circRNA[17](見圖1B)。circRNA通常具有以下特性:①普遍性:circRNA在多種物種中廣泛表達,在人體表達的基因中,大約1/8能檢測到circRNA的表達,并且其表達水平比相應的線狀RNA高出約10倍[18-19]。②穩定性:與常見的線性RNA不同,circRNA具有封閉的環狀結構,不受RNA外切酶影響。③保守性:circRNA在物種間表現出高度的保守性。例如,大約有15 000個circRNA在人類和小鼠的同源位點中表達,分別占人類和小鼠circRNA總量的15%和40%[20]。④特異性:在不同細胞、組織或發育的不同階段,circRNA通常表現出特異性[21-24]。

圖1 circRNA的生成及功能

circRNA的生物學功能主要包括:①作為microRNAs(miRNAs)分子海綿,與miRNAs競爭性結合,降低miRNAs靶向mRNA的能力,并參與機體不同器官細胞生理功能的調節[25](見圖1C1)。②與蛋白質相互作用:RBP是最著名的circRNA相互作用分子,許多RBP在癌癥中參與circRNA介導的致癌或抑癌過程。circRNA也作為蛋白質海綿、蛋白質誘餌、蛋白質招募或蛋白質支架,直接或間接地調控轉錄或翻譯。此外,circRNA與蛋白質的相互作用也有助于靶蛋白轉錄后的調控,包括泛素化和磷酸化介導的降解等[26](見圖1C2)。③調控基因轉錄和翻譯:一方面,circRNA可與RBP相互結合影響親本基因mRNA的表達;另一方面,circRNA形成過程中內含子間的競爭性互補配對,可以與線性RNA之間達成一種平衡,影響mRNA的表達,甚至蛋白質翻譯[15,27-28](見圖1C3)。④翻譯蛋白質:因序列中存在核糖體入口位點(internal ribosome entry site,IRES)[3],或通過m6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)介導的帽不依賴機制[29],參與疾病相關蛋白質的編碼過程[30](見圖1C4)。

2 circRNA與食管癌的惡性演進

2.1 食管癌中circRNA的功能

盡管多數研究處于早期階段,但目前研究支持circRNA作為致癌基因或腫瘤抑制因子參與食管癌的惡性演進,并有望成為食管癌潛在的治療靶標。表1總結了circRNA在食管癌中的作用研究。

表1 食管癌中circRNA的功能

2.1.1 circRNA調控細胞增殖研究顯示circRNA在細胞增殖調控中發揮重要作用。利用臨床樣本,Luo等通過qRT-PCR技術發現circFNDC3B在癌組織中的表達水平較癌旁明顯升高,食管癌細胞系中轉染sh-circFNDC3B后,細胞增殖能力減弱,表明circFNDC3B調控食管癌細胞增殖[31]。大部分circRNA(如circRNA-0008717、circRAD23B、ciRS-7等)作為分子海綿與miRNA相互作用,也調控食管癌細胞的增殖[32-34]。

2.1.2 circRNA調控食管癌細胞遷移、侵襲circRNA在調控食管癌細胞的遷移、侵襲和轉移中也發揮了重要作用。Hu等證實circGSK3β通過與GSK3β相互作用,抑制GSK3β活性,促進食管鱗癌細胞遷移和侵襲[35]。研究發現某些circRNA會抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。例如,circ-BMI1[38]、circ-Foxo3[39]在食管鱗癌組織中低表達,過表達后都能抑制細胞的遷移及侵襲。由此可見circRNA對食管癌細胞遷移及侵襲調控作用是雙向的。

2.1.3 circRNA調控食管癌細胞凋亡和細胞周期腫瘤細胞一般具有無限生長的特性,腫瘤發生是其細胞凋亡受抑制的結果。研究發現circRNA調控食管癌細胞凋亡,如hsa_circ_0023397在食管癌細胞中下調,過表達后明顯抑制了KYSE-150細胞的增殖并促進其凋亡,機制研究表明其通過競爭性結合miR-106b影響食管癌細胞的生物學功能[40]。細胞周期的紊亂導致細胞增殖失調,誘發癌變。has_circ_14153通過結合miR-4469,激活CDK3的表達,調控食管癌細胞周期[41],參與食管癌的發生發展。

2.1.4 circRNA調節食管癌細胞自噬自噬是一種受多種非編碼RNA調控的細胞內降解途徑。目前對ciRS-7(CDR1as)的研究比較深入,在食管鱗癌細胞中,它通過競爭性結合miR-1299,影響其下游Akt-mTOR信號通路,抑制自噬[42]。

2.2 circRNA調控上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)

EMT是一種上皮細胞向間充質細胞轉變的過程,為上皮細胞提供遷移和轉移的能力。EMT異常激活促進腫瘤細胞的侵襲和擴散,是腫瘤轉移過程中必要的細胞過程。例如,circ_0004370通過miR-1301-3p/COL1A1軸介導食管癌細胞EMT過程[43]。hsa_circ_0006948在食管鱗癌組織中過表達,通過吸附miR-490-3p增強HMGA2誘導EMT,促進腫瘤進展[76]。hsa_circ_0012563通過調控XRCC1/EMT通路促進食管鱗癌的遷移和侵襲[78]。

2.3 circRNA調節放療抵抗

獲得性放射抵抗是放療后腫瘤局部復發或治療失敗的最重要原因,了解circRNA參與放化療耐藥的調控機制可以識別新的靶點以優化治療,這方面研究目前較少。Su等應用微陣列技術對3752個人類細胞樣本circRNAs的表達進行了定量分析,明確了KYSE150細胞系放療抵抗的表達譜,篩選出2個關鍵分子(circRNA_001059和circRNA_000167),有助于闡明circRNA在放療抗性中的分子機制[37]。此外,研究表明circRNA_100367通過miR-217/Wnt3通路調控食管鱗癌的輻射敏感性[79]。circVRK1通過調控miR-624-3p/PTEN軸和PI3K/AKT信號通路逆轉食管鱗癌細胞輻射抗性[75]。

3 食管癌診斷和預后標志物

越來越多的研究發現,circRNA作為一種新的腫瘤標志物潛力巨大。例如,Fan等發現hsa_circ_0001946和hsa_circ_0062459在血漿中作為食管鱗癌診斷標志物的AUCs分別為0.894(敏感性92%,特異性80%)和 0.836(敏感性64%,特異性92%)[8]。大部分circRNA在食管癌中高表達且與預后不良相關;Huang等發現circ_0004771在食管癌血漿和組織中表達上調,并且其表達水平與原發腫瘤的浸潤程度和血管浸潤程度顯著相關,提示circ_0004771可作為判斷預后的指標[44]。然而,也有小部分低表達circRNA提示食管癌預后較差。例如,circ-SMAD7在食管癌組織與血漿中低表達,與TNM分期(P=0.000)和淋巴轉移(P=0.000)高度負相關[80]。體內體外實驗證實circ-Foxo3的過表達抑制食管癌細胞的生長、遷移和侵襲;在食管癌組織中低表達的circ-Foxo3,經circ-Foxo3/miR‐23a/PTEN通路起作用,與組織學分級相關,且提示預后不良[39]。

同時,得益于測序技術的飛速發展,越來越多的circRNA及其在人類癌癥中的作用得以揭示。Wang等利用高通量測序分析,從73對食管鱗癌和癌旁組織中共檢測到128 165個circRNA,與CircBase數據庫重合25 945個。其研究表明,食管癌組織中circRNA的豐度低于正常組織,且表達量存在差異,進一步篩選出hsa_circ_0005314、hsa_circ_0007541、hsa_circ_0000005和hsa_circ_0077536作為食管癌診斷和預后標志物,準確率較高[7]。Fan等利用微陣列技術對3對食管鱗癌冷凍腫瘤和癌旁組織進行了研究,發現了食管鱗癌相關的1 045個上調和1 032個下調circRNAs,分析出hsa_circ_0001946和hsa_circ_0043603可作為食管癌診斷標志物,單獨hsa_circ_0001946的AUC、敏感性和特異性為0.894、92和80%,單獨hsa_circ_0043603則為0.836、64和92%,而共同檢測的AUC、敏感性和特異性為0.928、84和98%。而且還證實了在冰凍和石蠟包埋組織中的hsa_circ_0001946水平可預測食管鱗癌復發、總生存率和無疾病生存率,而hsa_circ_0001946的過度表達則降低細胞增殖、遷移和侵襲能力,顯示其作為食管癌預后標志物的潛力[8]。

通過廣泛的臨床樣本測試,包括食管癌患者和健康對照組的組織、血清和外泌體,多個circRNA被認定為潛在的分子標志物,這些circRNA有可能實現食管癌的早期診斷并預測其復發和轉移(表2)。

表2 circRNA作為食管癌診斷和預后標志物

4 展望

近年來,隨著對circRNA研究的不斷深入,越來越多的疾病與circRNA聯系起來,特別是腫瘤。但食管癌中circRNA的研究目前尚處于初級階段,大量circRNA在食管癌中的功能亟待闡明,且能夠作為早期診斷和預后標志物的分子仍比較少,需要更多的基礎與臨床研究來揭示和證實。本文綜述了circRNA在食管癌中的功能及臨床應用,著重介紹了circRNA作為食管癌診斷和預后標志物的潛在臨床價值,以期為食管癌早期診斷、預后評估提供新思路。