食管鱗癌免疫治療相關基因鑒定

任 婧,王登奎,楊瑞娜,袁小志,劉志偉,王新帥

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)作為食管癌中的主要組織學類型,在我國發病率和死亡率均較高[1]。目前對于食管癌的治療主要是手術、放療、化療、靶向治療和綜合治療,依據患者病情,選擇個體合適的治療方案,可顯著延長患者總生存期。近年來,免疫治療手段作為一種新的抗腫瘤治療方式已在腫瘤研究中不斷取得進展。腫瘤的免疫治療是指激活人體免疫系統,通過自身免疫功能抑制“免疫逃逸”,發揮抗腫瘤作用[2]。其治療方式是通過藥物重新啟動建立體內免疫系統對腫瘤的清除,恢復體內抗腫瘤免疫反應。目前已有的免疫治療藥物有免疫檢查點抑制劑、腫瘤相關疫苗、小分子抑制劑等等。近年來,腫瘤免疫治療已在多種腫瘤治療中取得了巨大的成就,如黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌等等。此外,最新食管癌治療指南支持PD-1抑制劑可作為晚期一線、晚期二線食管癌治療新標準。并且,免疫聯合放化療在食管癌治療中已證實出安全性和可行性。表明免疫治療在食管鱗癌治療中的可行性?；蚣患治?gene set enrichment analysis,GSEA)是指將數個基因組成的基因集與整個轉錄組、修飾組等做出簡單而清晰的關聯分析,相比于差異基因富集分析,GSEA是從全體基因的表達矩陣中找出具有協同差異的基因集,故能兼顧差異較小的基因。鑒于免疫治療在食管鱗癌治療中的潛力,且為了更好地助力食管鱗癌的免疫治療研究,作者基于生物信息學分析展開了此次研究。

1 資料和方法

1.1 資料來源在GEO公共基因數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,以“ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCIONMA”為關鍵詞檢索,下載包括ESCC及癌旁組織基因芯片數據集GSE20347。

1.2 基因集富集分析和核心基因鑒定運用R軟件(4.0.4版本)中clusterProfiler包對基因表達數據進行基因集富集分析,挑選免疫相關通路并鑒定通路中核心基因進行下一步分析。

1.3 預后、免疫浸潤分析和PPI網絡構建為了探索本研究鑒定的基因表達量,作者基于UALCAN數據庫(https://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析核心基因與食管癌患者臨床特征相關性。HPA人類蛋白質數據庫(https://www.proteinatlas.org/)是包含蛋白質組學、轉錄組學、單細胞轉錄組等多組學的數據庫,依據其單細胞數據,分析核心基因在細胞中表達分布,探究細胞間是否存在互作關系。在THE KAPLAN-MEIER PLOTTER (http://kmplot.com/analysis/index.php p=background)和TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)中分別進行核心基因生存預后分析及核心基因在食管癌組織中與免疫細胞浸潤的相關性分析?；贕ENEMANIA(http://genemania.org/)數據庫構建蛋白-蛋白相互作用(PROTEIN-PROTEIN INTERACTION,PPI)網絡預測基因功能[3]。

1.4 統計學分析P<0.05被認為具有統計學差異,基因集富集分析采用多重假設檢驗矯正。

2 結果

2.1 數據處理GSE20347平臺信息為GPL571[HG-U133A_2] AFFMETRIX HUMAN GENOME U133A 2.0 ARRAY,且GSE20347基因芯片共有34例樣本包含17例ESCC組織及17例癌旁組織,經R軟件標準化及探針轉換處理,共得到12 402個基因表達數據集。

2.2 基因集富集分析和核心基因鑒定運用clusterProfiler 包對基因表達矩陣進行基因集富集分析,結果如圖1所示,共得到15個免疫相關通路:免疫效應過程、白細胞介導的免疫、免疫效應過程中的負調控、免疫受體的體細胞多樣化、單一位點內通過種系重組免疫受體的體細胞多樣化、免疫球蛋白的體細胞多樣化、體液免疫負調節、B細胞免疫調節、B細胞活化參與免疫反應、自然殺傷細胞介導免疫、免疫球蛋白產生、自然殺傷細胞介導免疫調節、通過體細胞突變實現免疫受體的體細胞多樣化、體液免疫應答、調節免疫球蛋白產生,依據通路中基因RANK排名,鑒定出15個核心基因(UTP18、PTPN14、UMPS、ATAD5、BCL11B、ATM、CTNNBL1、SCCPDH、TNFSF4、MICA、POLB、TUBA1C、UNG、EHMT2、PKN1)。

圖1 基因集富集分析

2.3 預后及腫瘤免疫浸潤分析基于KM plotter數據庫對核心基因進行預后評估,生存預后結果如圖2所示15個核心基因中ATAD5、ATM、EHMT2、PTPN14、UTP18基因高表達與ESCC患者較好的總生存期(overall survival,OS)顯著相關(P<0.05)。進一步分析預后相關的核心基因與食管癌患者腫瘤分級及淋巴結轉移關系,結果如圖3和圖4所示,對比正常組織,免疫基因與腫瘤分級及淋巴結轉移顯著相關(P<0.05),且腫瘤的分級和分期越高,部分基因的表達量越高。細胞測序結果分析(圖5)提示EHMT2、ATAD5和UTP18在鱗狀上皮細胞和B細胞中表達分布豐富,ATM在免疫細胞中表達分布較豐富,PTPN14主要富集于內皮細胞中?？紤]到核心基因在免疫細胞中分布豐富,我們進一步行腫瘤免疫浸潤分析,結果如圖6所示,CD4+T細胞和中性粒細胞浸潤水平與ATAD5、UTP18、ATM和PTPN14表達水平呈正相關,而與EHMT2表達水平呈負相關。樹突狀細胞浸潤水平與ATAD5、ATM和PTPN14表達水平呈正相關,與UTP18和EHMT2表達水平呈負相關。B細胞浸潤水平與ATAD5和UTP18表達水平呈正相關。CD8+T細胞浸潤水平與ATM、EHMT2和PTPN14表達水平呈正相關。

圖2 免疫基因OS評估

圖3 免疫基因在不同分級表達量

圖4 免疫基因在不同淋巴結轉移表達量

圖5 免疫基因單細胞亞群分布熱圖

圖6 腫瘤免疫浸潤分析

2.4 核心基因網絡構建基于GeneMANIA數據庫構建核心基因的PPI網絡,如圖7所示,參與網絡的基因主要涉及功能包括組蛋白甲基轉移酶活性、細胞周期的正調控、細胞周期阻滯的正調控、細胞周期過程的正調控、DNA損傷檢查點、細胞周期檢測點。

圖7 核心基因PPI網絡及功能構建

3 討論

食管癌治療是腫瘤治療的難點和熱點[4]。腫瘤微環境是體內腫瘤細胞生長的內外環境,與腫瘤細胞的生長和轉移相關,且腫瘤微環境中不僅有腫瘤細胞,還包括免疫細胞、成纖維細胞、結締組織等,微環境中浸潤的免疫細胞作為癌癥的特殊生物標志物顯著影響腫瘤的診斷、生存預后和臨床抗腫瘤效果。此外,腫瘤微環境中的免疫抑制細胞可以通過影響免疫細胞對腫瘤細胞識別更進一步促進腫瘤細胞生長。腫瘤免疫浸潤分析可幫助研究人員開發新型癌癥診斷和治療策略。本研究通過基因集富集分析鑒定出ESCC基因集主要參與的免疫相關通路(免疫效應過程、白細胞介導的免疫、免疫效應過程中的負調控等)和通路中的核心基因。生存預后提示核心基因中ATAD5、ATM、EHMT2、PTPN14、UTP18基因高表達與ESCC患者較好的OS顯著相關。且核心基因的表達與腫瘤分級及淋巴結轉移相關。此外,單細胞測序提示核心基因在鱗狀上皮及免疫細胞中表達豐度較高,提示免疫細胞與鱗狀細胞可能通過這些核心基因位點進行互作,而且核心基因腫瘤免疫浸潤分析結果顯示ESCC組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、B細胞的浸潤水平與核心基因表達水平存在相關性。這些免疫通路可能參與腫瘤微環境的改變,而通路中的核心基因會影響免疫通路整體的效價,并且核心基因會導致腫瘤微環境內免疫細胞水平的改變可能會進一步加速腫瘤的免疫逃逸。這些瀑布反應會使得體內的腫瘤細胞惡性程度更高。而且,通過構建基因網絡發現核心基因主要調控細胞周期、DNA損傷檢查點和組蛋白甲基轉移酶活性。結果表明核心基因在調控免疫通路的同時還能影響細胞內的增殖周期、蛋白修飾、DNA損傷修復等等?？偟膩碚f,核心基因不僅影響體內腫瘤生存的微環境,還同時調控細胞內的代謝,而細胞內外的改變可能會使得腫瘤細胞惡性程度更高。

核心基因的進一步分析同樣更加重要。ATAD5是一種AAA+ ATP酶蛋白,可與RFC2-5形成選擇性復制因子C樣復合體(ribasome lamellar complex, RLC),對于維持基因組穩定性非常重要[5]。既往HeLa和酵母細胞研究表明,免疫球蛋白重鏈(Igh)重組、B細胞分裂降低和基因組不穩定性與ATAD5 表達降低相關[6-7]。屬于激酶家族的ATM主要參與DNA鏈斷裂后的細胞周期檢查點因子Chk、DNA修復和凋亡等生物學反應[8]。已有研究證實,在人單核細胞和巨噬細胞中,炎癥因子基因的表達可以直接由p53和ATM依賴機制誘導[9],而T細胞激活引起的氧化應激反應以及T細胞受體和CD40誘導的抗體類別轉換重組過程中的DNA雙鏈斷裂損傷均需要ATM調控[10-11],且在基因毒應激后,NF-κB靶基因參與炎癥的轉錄誘導需要ATM對p65的Ser547磷酸化[12]。EHMT2是一種賴氨酸甲基轉移酶,其主要功能是使組蛋白H3的賴氨酸二甲基化 (H3K9me2)[13]。EHMT2是T細胞、先天淋巴細胞和Th細胞發育、分化以及功能調節的中心控制點。如EHMT2通過介導依賴H3K9me2的T細胞反應參與T細胞功能調節,或通過H3K9me2限制轉錄因子和共激活劑對特定基因位點的可及性,調控幼稚T細胞,抑制基因表達,而且可抑制病毒感染期間記憶T細胞CD25和CD27的表達[14-15]。UTP18是核糖體亞基加工組的重要組成部分。已有研究發現在人神經母細胞瘤、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌細胞和HEK 293T細胞中觀察到內源性UTP18免疫應答[16]。PTPN14是調節多種細胞過程的信號分子,包括細胞生長、分化、有絲分裂周期和致癌轉化。PTPN14作為腫瘤抑制因子,其低表達與較短的總生存率相關[17]。但新研究表明,PTPN14通過介導血管內皮鈣粘著蛋白的磷酸化也參與了炎癥的調節[18]。

綜上所述,本研究基于基因集富集分析鑒定出與ESCC顯著相關的免疫基因,同時分析免疫基因與腫瘤患者臨床特征的相關性,并進一步通過腫瘤免疫浸潤分析發現與核心基因顯著相關的免疫細胞,可為ESCC免疫相關研究提供一定的理論依據。