口腔微生物與食管癌關系的研究進展

孫凡鑰,楊玉鑫,陳宏偉,師鑫鵬,羅曉勇,王保永

人體微生物組是指定植在人體不同生態位置中的微生物群體,包括細菌、真菌和病毒等[1],其在維持人類健康方面發揮重要作用,包括機體代謝活動和免疫系統成熟等方面[2]。近年來,新一代測序技術的發展使得研究微生物群的組成和多樣性成為可能。微生物群的組成受到多種因素的影響,如飲食、運動、藥物攝入以及宿主免疫系統和遺傳因素等[3]。近期的研究表明,口腔等上消化道的微生物群在食管癌(esophageal cancer,EC)的發病機制中起到重要作用[4]。然而,關于口腔微生物在EC發展中的確切作用和機制的研究還相對較少[5]。本文概述口腔微生物與EC相關研究的進展,探討口腔微生物與EC之間的潛在聯系,為EC的早期預測和治療提供理論基礎。

1 EC

EC是世界第八大最常見癌癥和第六大常見癌癥相關死因[6]。在我國惡性腫瘤中,EC的發病率居第三位,死亡率居第四位。根據組織病理學分類,EC可以分為管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)[7]。在發展中國家,ESCC是主要類型,而在發達國家,EA更為常見[8]。在分子水平上,ESCC的亞型常伴有多個基因的頻繁突變,包括MLL2、ZNF750、TP53、NFE2L2、NOTCH1和TGFBR2[9]。而在EA中,常見的突變發生在ARID1A、SMAD2和ERBB2基因中[10]。由于缺乏準確的早期篩查方法和有效治療,EC的5 a存活率僅為15%～25%[11],因此迫切需要研究早期EC預測的新型高效生物標志物。

2 口腔微生物

2.1 口腔微生物的組成與功能

人體的口腔微生物群是僅次于胃腸道的第二大豐富微生物群,也是人類微生物組成的重要部分,包括數百到數千種不同的物種。人類口腔的16S rDNA譜分析表明,口腔細菌群主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、螺旋菌門,這些細菌占口腔細菌總數的96%(口腔微生物組數據庫可從網站www.homd.org獲得)?？谇晃⑸锶旱慕M成平衡對人體口腔健康、免疫系統、消化系統和代謝功能正常發揮均具有重要作用。

2.2 口腔微生物與健康的關系

口腔微生物是口腔內環境的重要組成部分。多項研究表明,口腔微生物組成失調不僅對人類最常見的兩種口腔疾病--牙齦炎和牙周炎具有顯著影響[12],而且也是其他疾病的重要誘因,如糖尿病、心血管疾病、腫瘤等[13-15]。因此,維持口腔微生物組成的穩定與平衡,對于人體健康至關重要。

3 口腔微生物與EC的關系

人體口腔、食管和后腸道等處的微生物數量龐大,種類多樣。隨著微生物測序新技術的發展,食管中的放線桿菌(如羅氏菌)、變形桿菌(如嗜血桿菌)、梭桿菌(如具核梭桿菌)、擬桿菌(如普雷沃菌)及厚壁菌(如鏈球菌)等細菌種類不斷被發現和報道[16]。由于口腔與食管在解剖結構上具有連續性,因此食管微生物與口腔微生物組成類似[17]。研究表明,中國EC患者和健康人群的口腔微生物組成存在差異,EC患者增加最顯著的類群是厚壁菌、負菌綱、硒足菌科、前蝶科、普雷沃菌和韋榮氏球菌,而減少最顯著的類群是變形桿菌、β變形桿菌、奈斯序列、奈瑟菌科等[18]。EC的發生與發展與口腔微生物之間的機制十分復雜,涉及多種因素及之間的相互作用,如細胞因子、趨化因子、致癌信號通路、細胞表面受體、細胞外基質降解和細胞凋亡等[19]。

3.1 口腔微生物與ESCC

ESCC是EC最重要的病理類型,其在發展中國家更為常見[20]。ESCC的危險因素主要包括飲酒、吸煙、不良飲食、化學因素、感染、EC家族史和遺傳突變等[21]。研究表明,不良的口腔健康是食管鱗狀上皮不典型增生的一種危險因素,而食管鱗狀上皮不典型增生是ESCC的癌前病變[22]。因此,對口腔微生物與食管鱗狀癌關系的研究備受關注。

諸多研究表明ESCC患者的口腔微生物群與健康口腔微生物群之間存在顯著差異。如表1所示,ESCC患者的口腔微生物中的厚壁菌門、擬桿菌門,以及牙齦卟啉單胞菌屬、普雷沃菌屬、鏈球菌屬等的豐度顯著升高,而變形桿菌屬、梭桿菌屬和奈瑟菌屬等的豐度顯著降低。此外,ESCC患者的口腔微生物群常伴有α多樣性及β多樣性顯著降低,表明與健康人群相比,ESCC患者的口腔微生物菌群多樣性和豐富度均受到不良影響。與表1總結的現象有所不同,作者比較(未發表數據)了25例ESCC患者的癌組織及癌旁組織的微生物組成,發現ESCC組織和其癌旁組織在α多樣性和β多樣性均無顯著差異,但在屬水平上,與癌旁組織相比,ESCC組織中的普雷沃菌、消化鏈球菌、具核梭桿菌的相對豐度顯著增加。作者與表1中結論的不同可能與各試驗參與者的飲食習慣、采樣季節和采樣部位等存在差異有關。一項研究關注EC前病變和鱗狀細胞癌中口腔和食管微生物群的特征,發現顆粒菌、羅氏菌、鏈球菌、孿生球菌屬、鉤端菌和沙利亞是低度異型增生患者的常見生物標志物,乳酸桿菌是高度異型增生患者的常見生物標志物。EC多伴隨發生氨基酸、脂肪酸和糖代謝紊亂等相關生物標志物的代謝組學變化[23]。本團隊早在2020年對中國EC患者的口腔微生物群進行了研究,發現與正常人相比,ESCC患者口腔微生物群存在差異,其中奈瑟菌屬、普雷沃菌屬和韋氏菌屬的相對豐度差異顯著。這些差異菌可能成為EC的新潛在標志物,并為研究口腔微生物與ESCC之間的關系提供方向[18]。此外,有研究比較健康對照組和ESCC組,發現普雷沃菌的豐度顯著增加。最近的研究通過收集牙菌斑和未刺激的唾液樣本,使用16S rDNA測序技術,在EC患者的癌組織中檢測到了心絞痛鏈球菌和牙菌斑中的連翹曲霉,這可能與ESCC的高風險有關[24]。目前需要進一步的研究以驗證先前的發現,并闡明口腔微生物對ESCC發生機制的影響。研究口腔微生物群與ESCC風險因素的相關性有望在深入了解該癌癥的病因方面取得顯著進展,并可能為早期ESCC的檢測提供新的思路。

表1 口腔微生物與ESCC的研究

此外,口腔與腸道微生物的聯合效應在系統性疾病中的研究越來越受到關注。最近的研究表明,口腔微生物可以轉移并定植在腸道中,口腔可以作為腸道微生物的內源性儲存庫[25]?？谇恢械挠泻恨D移到下消化道(即食道、胃、小腸和大腸),可能引起肝硬化、類風濕性關節炎和炎癥性腸炎等疾病[26-28]。Deng等調查研究了23對食道癌患者及匹配的健康個體的腸道(新鮮糞便)微生物組,通過16S rRNA基因測序進行比較分析,發現與健康個體相比,食道癌患者的腸道中厚壁菌和放線菌相對豐度顯著升高[29];此外,Li等的研究中發現,EC患者的腸道中脆弱擬桿菌、大腸桿菌、梭桿菌等菌群的相對豐度顯著增加[30]。雖然較少研究直接關注于比較EC患者與正常個體的口腔及腸道微生物組的相關性及差異性。然而由表1可知,EC患者的口腔厚壁菌、擬桿菌、放線菌和梭桿菌等微生物的豐度普遍升高。綜上可以發現,EC患者的口腔及腸道中高豐度菌群存在較強的一致性,表明它們可能成為早期EC診斷的生物標志物,然而其具體效果還有待進一步研究與驗證。

3.2 口腔微生物群與EAC

EAC是發達國家的主要EC類型,而在亞洲和非洲則為罕見[33]。該癌癥的主要危險因素包括慢性胃食管反流病、肥胖和吸煙等[37]。巴雷特食管被認為是EAC的癌前病變[38]。一項研究通過16S rRNA基因測序等方法比較了17名正常人與32名巴雷特食管患者的口腔微生物組,發現與正常人相比,巴雷特食管患者的口腔微生物組的厚壁菌門相對豐度顯著增加,變形桿菌門豐度顯著降低。此外,該研究還發現,在患有高度不典型增生和癌癥的巴雷特食管患者中,腸桿菌科的相對豐度顯著增加,該研究還揭示了腸桿菌科細菌的相對豐度在患有高度不典型增生和癌癥的巴雷特食管患者中顯著增加,表明其與從巴雷特食管到EAC的進展顯著相關[39]。近年來,僅有較少研究直接關注于口腔微生物與EAC的關系,表2總結了部分口腔或食管微生物與巴雷特食管及EAC關系的研究結果,發現主要差異菌在不同研究之間存在較大變異性,但總結來看,巴雷特食管和EAC的發生可能與放線菌和韋榮球菌屬的相對豐度升高存在正相關,而與變形桿菌門,鏈球菌和棒狀菌的相對豐度升高存在負相關。食管是人類胃腸道系統的重要組成部分,具有獨特和多樣化的微生物組成,且與口腔微生物組成相似[40]。研究表明,在巴雷特食管中革蘭氏陰性菌(包括梭菌、奈瑟氏菌、彎曲桿菌、擬桿菌,變形桿菌和類桿菌)的相對豐富度增加,這可能與EAC的發生發展有關[41]。然而,一項基于16S rDNA的研究卻未觀察到口腔微生物多樣性或組成與EAC風險之間的顯著相關性[4]。目前,關于口腔微生物與EAC關系的研究較少,其與EAC的發生和發展機制尚不清楚,需要進一步研究和探討。揭示口腔微生物與EAC之間的關系,有助于早期發現和預防該疾病,并為其預防開辟新的研究領域,提供成本效益高、相對安全的治療方法。

表2 口腔及食管微生物與巴雷特食管和EAC的研究

口腔微生物與EC的研究尚處于早期階段,但已有研究表明口腔微生物組成的變化在不同類型的EC中可能扮演不同的角色,并為EC的早期預測和治療提供了重要線索。這些研究發現特定口腔細菌(如牙齦卟啉單胞菌屬、普雷沃菌屬和鏈球菌屬)的相對高豐度、口腔微生物多樣性和豐富度的降低可能與ESCC和EAC的發展相關。此外,革蘭陰性食管菌(主要是鏈球菌和普雷沃菌)的比例變化可能與巴雷特食管有關。然而,目前尚未觀察到明確且一致的口腔微生物變化與EC之間的關系模式,因此需要進一步的研究來加深我們對這一領域的理解。

4 口腔微生物對EC的作用機制

目前關于口腔微生物對EC發生發展作用機制的研究較少,已有的報道主要集中于口腔微生物對食管的炎癥和免疫調節、NF-κB 通路激活、EC細胞增殖與細胞凋亡以及微生物的代謝產物和內毒素等方面。

4.1 炎癥和免疫調節

微生物通過多種途徑產生促炎微環境引起慢性炎癥,進而促進EC的發生發展。引發EC的一個潛在機制是產生白細胞介素6(interleukin 6,IL-6),這是一種促炎細胞因子,可激活信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3) 通路。IL-6/STAT3 級聯的靶基因參與調節細胞增殖、分化和存活,從而導致各種癌癥的發展[46-47]。牙齦卟啉單胞菌可促進食管黏膜IL-6 的生物合成,進而激活下游 STAT3 通路,維持EC的惡性表型[48]。該菌也可促進IL-6 的分泌,進而促進食管上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 以及骨髓源性免疫抑制細胞募集,從而促進腫瘤轉移和免疫逃逸[49]。此外,普雷沃菌也可以通過刺激上皮細胞產生IL-8、IL-6、CCL20等細胞因子,促進黏膜Th17免疫反應和中性粒細胞募集[50],但普雷沃菌是否可以通過影響 IL-6的分泌而影響EC的發生發展尚未見報道,需要未來的進一步研究證明。

此外,宿主免疫系統在抑制胃腸道腫瘤的發生發展中起著重要作用[51]。微生物群落失調引起的免疫系統紊亂可能誘導炎癥,炎癥介質的持續釋放通常是癌癥的重要促成因素[52]。牙齦卟啉單胞菌通過降解免疫球蛋白和補體系統影響宿主免疫系統來促進人ESCC的進展和化學抵抗[53];具核梭桿菌誘導CD8+T細胞表面的抑制性受體KIR2DL1高表達,從而削弱抗腫瘤免疫反應,促進ESCC的進展[54]。這些研究均表明,宿主口腔等微生物引起的宿主免疫失調與炎癥反應,是導致EC等癌癥發生的重要途徑。

4.2 NF-κB通路與細胞的增殖與凋亡

NF-κB信號通路是經典的炎癥通路,已經被證明可能與ESCC細胞的遷移和侵襲有關[55]。NF-κB可被多種因子刺激而激活,如細菌LPS、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細胞介素1-β(Interleukin-1β,IL-1β)和膽汁酸等[56-57]。研究表明,具核梭桿菌感染EC細胞后,使NOD1和磷酸化RIPK2過表達進而激活NF-κB信號通路,從而顯著提高EC的增殖能力[58]。此外,口輕微生物可以通過抑制細胞的凋亡來促進癌細胞的增殖。Li等的一項研究表明,牙齦卟啉單胞菌通過誘導激活人上皮KB細胞線粒體凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)而抑制口腔黏膜的修復[59];具核梭桿菌通過靶向TLR4/骨髓分化初級反應蛋白MYD88信號激活自噬途徑并消除化學治療劑介導的細胞凋亡,從而導致結直腸癌細胞的化學抗性表型[60]。類似的研究也表明具核梭桿菌通過調節自噬級聯和細胞凋亡賦予ESCC細胞的化學抗性[61]。

4.3 微生物代謝產物及內毒素

大量研究表明,微生物的毒力因子如LPS、鞭毛和其他微生物相關分子模式 通過模式識別受體與宿主的先天免疫系統通信,導致持續的炎癥反應和致癌作用[62],其可能是微生物促癌的機制之一。LPS是一種免疫活性成分,可通過環加氧酶延遲胃排空1/2或直接影響食管下括約肌的功能,進而增加胃內壓促進胃食管反流病的發生,導致EAC的發展[63-64]。Toll樣受體家族是負責連接微生物和機體免疫系統的重要識別受體,其激活代表了炎癥相關腫瘤發生的重要調節因子[65]。如具核梭桿菌通過其毒力因子LPS與Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓系分化初級反應基因88(MYD88激活NF-κB通路,增加microRNA-21(miR-21)的表達,進而激活腫瘤RAS信號傳導,導致腫瘤細胞的增長[66-67]。腸道微生物群也可以分泌一些代謝物,如多胺、腐胺[68]以及丁酸鹽等來刺激癌癥的發展[69-70]。

此外,一些細菌可以直接產生內毒素導致基因組損傷,進而導致癌癥的發生發展。例如,由革蘭氏陰性菌分泌的細胞致死性腫脹毒素可能引起宿主DNA損傷[71],而食管DNA損傷的進一步修復可能導致EC的發展[72]。Li等發現CagA1陽性幽門螺桿菌可引起食管上皮細胞DNA斷裂,從而導致食管鱗狀上皮組織非典型增生,并促成ESCC的致癌作用[73]。

5 EC相關的常見口腔微生物

5.1 牙齦卟啉單胞菌

牙齦卟啉單胞菌是革蘭氏陰性菌,屬于擬桿菌屬。該菌能夠表達和分泌多種物質,包括牙齦蛋白酶、胞外多糖、脂多糖和血紅蛋白攝取系統相關的物質,并干擾生物體的正常生理代謝,抑制細胞凋亡。因此,牙齦卟啉單胞菌被認為是誘導腫瘤發生的潛在危險因素[4]。

既往研究表明,在ESCC患者中,牙齦卟啉單胞菌的IgA和IgG血清水平明顯高于食管炎和健康對照組。此外,牙齦卟啉單胞菌的高血清IgA或IgG水平與ESCC患者的不良預后相關,高IgA和IgG的患者預后最差。因此,該研究結果表明牙齦卟啉單胞菌可能與ESCC的發病機制有關[53]。此外,牙齦卟啉單胞菌可以通過多種途徑促進ESCC的進展,包括通過TGFβ依賴的Smad/YAP/TAZ信號通路、miR-194/GRHL3/PTEN/Akt信號通路、NF-κB信號通路的激活,以及增加IL-6和IL-8的產生等促進ESCC的進展[74-77]。研究表明,牙齦卟啉單胞菌通過下調Beclin1的表達以及通過GSK3β介導的線粒體氧化磷酸化促進人ESCC的進展和化學抵抗[78-79]。

5.2 具核梭桿菌

具核梭桿菌是一種存在于人類口腔中的革蘭氏陰性菌,是人體微生物組的重要組成成分,已被發現與牙周病以及多種癌癥的發展密切相關[80]。研究表明,具核梭桿菌可能通過激活趨化因子(如CCL20)促進調節性T細胞的富集,進而促進腫瘤細胞的免疫逃逸[81]。此外,具核梭桿菌可通過激活NOD1/RIPK2/NF-κB通路、上調IL-32/PRTN3表達、通過AHR/CYP1A1/AKT信號傳導促進ESCC的增殖、改變癌細胞全基因組甲基化水平以及誘導CD8+T淋巴細胞KIR2DL1高表達等機制[54,58,82-84],促進ESCC的發生與發展。有研究表明,具核梭桿菌能產生高水平的腐胺,干擾多胺代謝,促進ESCC的增殖[68]。具核梭桿菌在衰老的ESCC細胞中侵入并存活,并誘導DNA損傷的增加以進一步激活DNA損傷反應途徑,從而增強衰老相關的分泌表型的分泌,從而促進ESCC的進展。因此,具核梭桿菌在ESCC的發生和發展中扮演重要角色,通過多種機制影響腫瘤的免疫逃逸、細胞增殖、基因組甲基化、免疫調節和衰老相關的分泌表型等過程。

5.3 普雷沃菌

普雷沃菌是擬桿菌門的革蘭氏陰性菌,通常被認為是一種共生菌。該菌的豐度增加與Th17介導的黏膜炎癥有關,可激活Toll樣受體2,導致抗原提呈細胞產生Th17極化細胞因子(如IL-23、IL-1);普雷沃菌介導的黏膜炎癥可導致炎癥介質、細菌和細菌產物的在宿主集體的傳播,從而可能影響全身性疾病的結果[50]。研究發現普雷沃菌在EC中的相對豐度高于正常組織[18,24],牙齦卟啉單胞菌和普雷沃菌的比值對早期ESCC診斷具有良好的敏感性和特異性[28]。而普雷沃菌在EC發生和發展中的作用機制尚不清楚,需要進一步的研究來闡明。

5.4 其他

除了已經提到的牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌和普雷沃菌外,口腔微生物組中的其他菌也與EC發展相關。其中鏈球菌被認為是食管中的主要微生物[24]。然而,食管炎和巴雷特食管中革蘭氏陽性菌轉化為革蘭氏陰性菌可能與EC的發病機制有關。巴雷特食管患者與對照組的微生物組成存在許多差異,有研究發現巴雷特食管患者中厚壁菌的相對豐度顯著增加,而變形桿菌的相對豐度顯著降低。另外,一項研究對與ESCC相關的口腔微生物組進行了分析,發現ESCC受試者的口腔微生物多樣性總體降低,并且ESCC患者的月桂屬、大皰菌屬、卡托氏菌屬、棒狀桿菌屬、莫里氏菌屬、消化球菌屬和心桿菌屬的水平相對較低[22]。

總之,雖然目前尚未觀察到明確且一致的口腔微生物與EC之間的關系模式,但口腔微生物組成的失衡和特定菌群的變化可能與EC的發展相關。進一步的研究將有助于深入了解口腔微生物與不同類型的EC之間的關系,并為EC的早期預測和治療提供更多的指導。

6 未來與展望

目前尚不清楚口腔微生物與EC發生發展的確切機制。然而,慢性感染已被認為是癌癥發展的重要流行病學和環境決定因素。研究發現,ESCC中炎癥標志物升高,表明ESCC與慢性炎癥有關。炎癥信號通路激活是EC發生的主要機制之一,其中NF-κB通路在ESCC的發展中起著重要作用,其激活與ESCC的癌細胞的遷移和侵襲有關[85]。此外,NF-κB及其兩個主要下游效應子,即IL-8和IL-1β,可調節重要的細胞功能,如血管生成、存活、腫瘤細胞干性、細胞遷移、轉移和免疫細胞浸潤等[86-87]。因此,未來的研究或許將口腔菌群與NF-κB通路、Smad/YAP/TAZ等信號通路聯系起來,以進一步明確EC的發病機制。當然,上述機制的研究仍存在一些問題需要解決。首先,口腔微生物的變化是EC的病因還是結果需要深層次的探究。其次,需要鑒定否存在特定的口腔微生物致病菌推動了EC的發展。

綜上所述,本文通過對口腔微生物與EC發生發展的關系進行綜述,以期發現特定微生物菌株作為敏感且特異性的臨床診斷標志物,從而實現對ESCC的定向診斷和治療,提高患者的生存率。本綜述有助于深入理解口腔微生物在EC發展中的作用,并為發展更有效的治療策略提供新的思路。