SDC-1 調控TGF-β1/THBS1 信號通路對肝纖維化進程的影響

羊 丹 田婉婷 徐 菁

乙型肝炎是全球范圍內的重要公共衛生問題?！?022 中國衛生健康統計年鑒》[1]發布的數據顯示，2021年中國新發乙型肝炎97.68 萬例，相較于2020年（90.63 萬例）增加了8%，距離WHO 提出的2030年消除乙型肝炎的目標仍有一定差距。乙型肝炎是由HBV 感染引起的肝臟疾病，大多數HBV感染者經治療后在短期內能夠痊愈，但5%～10%的成年患者無法清除病毒，可能進展為慢性乙型肝炎[2]。慢性乙型肝炎患者通常無明顯癥狀，但可能引起肝纖維化改變，進而導致肝硬化和肝細胞癌（HCC）發生，威脅患者的生命健康[3]。多配體蛋白聚糖-1（SDC-1）是一種位于細胞表面的糖蛋白，可參與調控細胞黏附、細胞外基質的組裝、細胞信號轉導、細胞遷移等多種生物學過程。近年來的研究發現，HCC 細胞中SDC-1 表達顯著上調，可能發揮促進肝纖維化進展的作用[4]。轉化生長因子-β1（TGF-β1）是TGF-β 超家族的多肽成員之一。既往研究表明，肝臟受損后，炎癥反應和纖維化的激活可導致TGF-β1 釋放，TGF-β1 則可與肝星狀細胞（HSC）表面受體結合，激活下游信號轉導通路，進而促使HSC 轉化為纖維化細胞，參與肝纖維化進程[5]。血小板反應蛋白1（THBS1）屬于THBS 家族，在肝臟等組織中表達。Reszegi 等[6]的研究發現，THBS1 與TGF-β1 在肝纖維化進程中存在相互作用，且SDC-1 在此過程中發揮重要的調控作用。目前關于SDC-1 的表達與肝纖維化的關系，以及其對于HSC 及細胞周期作用機制的報道較少。本研究對此進行了分析，旨在為肝纖維化的臨床診治提供參考依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021年4月至2023年4月于三二〇一醫院住院治療并行肝穿刺活體組織病理檢查的102 例慢性乙型肝炎患者作為研究對象，其中男性58 例，女性44 例，年齡32～76 歲，平均年齡為（58.35±10.21）歲，BMI 為22～26 kg/m2，平均BMI 為（24.36±2.14）kg/m2；參照《肝纖維化診斷及治療共識（2019年）》[7]中的肝纖維化分期標準，S0 期22 例，S1 期19 例，S2 期24 例，S3 期21 例，S4 期16 例。納入標準：（1）18～80 歲；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的診斷標準；（3）尚未接受抗病毒治療；（4）患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：（1）合并其他類型的肝炎病毒感染；（2）合并藥物性、酒精性、自身免疫性、膽汁淤積性和遺傳代謝性等肝??；（3）合并惡性腫瘤；（4）近6 個月內曾接受抗病毒或抗炎保肝治療；（5）有心、腦、腎等重要器官功能不全。本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過（批件號20210623）。

1.2 方法

1.2.1 血清SDC-1 表達水平檢測 采用ELISA 法檢測受試者血清SDC-1 的表達水平。于患者入院時，采集清晨空腹狀態下的外周靜脈血5 mL，3 500 r/min 離心5 min，取上清液，使用全自動生物化學分析儀檢測血清SDC-1 的表達水平，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（貨號E-EL-H1298c）。

1.2.2 LX-2 細胞的培養和活化 將人HSC 系LX-2（購自上海雅吉生物科技有限公司）置于10%高糖DMEM 培養基內，于37 ℃、5% CO2環境中培養；待細胞融合度達80%時，棄去培養液，用無菌PBS溶液沖洗；之后更換為無血清DMEM 培養基，將細胞隨機分為2 組，其中1 組加入TGF-β1 溶液（質量濃度為10 ng/mL）后繼續培養24 h，設為TGF-β1組；另1 組不作處理，設為陰性對照（NC）組。

1.2.3 SDC-1 敲低實驗 本研究中的SDC-1 小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，正向序列為5'-CCACCAAACAGGAGG AAUUTT-3'，反向序列為5'-UUCCUCCUGUUUGGU GGTT-3'。取TGF-β1 組中對數生長期的細胞，以1×106個/孔接種于6 孔板上，加入不含抗生素的DMEM 培養基培養24 h，之后隨機分為2 組，其中1 組轉染隨機排序的小片段siRNA，設為NC siRNA 組；另1 組轉染SDC-1 siRNA，設為SDC-1 siRNA 組。以上步驟均按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒（購自英國Invitrogen 公司）說明書進行操作，之后將細胞置于Opti-MEM 培養基中轉染12 h，后更換為無胎牛血清的DMEM 培養基，于37 ℃、5% CO2環境中培養48 h。

1.2.4 α-平滑肌肌動蛋白、SDC-1 和THBS1 蛋白表達水平檢測 采用蛋白質印跡法測定α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、SDC-1 和THBS1 蛋白表達水平。取1.2.3 中轉染48 h 后的細胞，棄去舊培養基，用預冷的PBS 溶液沖洗3 次；滴加RIPA 裂解液（購自北京伊塔生物科技有限公司，貨號SY4680）裂解細胞，冰上反應10～30 min；4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒（購自上海信帆生物科技有限公司，貨號YX3763）測定α-SMA、SDC-1 和THBS1 蛋白的表達水平。具體步驟：取蛋白樣品進行SDS-PAGE，濕法轉至PVDF 膜；用快速封閉液[購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司]封閉抗體，依次滴加兔抗α-SMA 多克隆抗體（購自上海遠慕生物科技有限公司）、兔抗SDC-1 多克隆抗體和兔抗THBS1多克隆抗體（均購自上海酶聯生物科技有限公司），按1 ∶1 000 比例稀釋，4 ℃孵育過夜；用TBST 溶液沖洗3 次，滴加二抗（購自上海烜雅生物科技有限公司），按1 ∶5 000 比例稀釋，37 ℃孵育1 h；用TBST 溶液沖洗3 次，采用ECL 法（試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司）曝光顯影；使用凝膠成像系統觀察條帶，應用ImageJ 軟件進行灰度值分析，以β-actin 作為內參，實驗重復3 次。

1.2.5α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR 法檢測α-SMA、SDC-1和THBS1 mRNA 的表達水平。取1.2.3 中轉染48 h后的細胞，用PBS 溶液沖洗2 次；滴加TRIzol 試劑（購自南京森貝伽生物科技有限公司）提取總RNA，冰上孵育10 min；用移液槍吹打5 min，轉移至EP 管內；滴加預冷的氯仿，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，取上層水相置于新的EP 管內，滴加異丙醇沉淀DNA；4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入預冷的75%乙醇洗滌沉淀；4 ℃下7 500 r/min 離心5 min，棄上清；使用紫外可見分光光度計（購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定波長260 nm 和280 nm 處的光密度（OD）值，檢測RNA 純度（R），公式：R=OD260/OD280，取R值在1.8～2.0 間的RNA 樣品，并測定RNA 濃度；按照反轉錄試劑盒[購自優利科（上海）生命科學有限公司]說明書操作，將RNA 反轉錄為cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；之后94 ℃ 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 60 s，共35 個循環；最后72 ℃延展10 min。取PCR 擴增產物，經2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統分析結果；以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 的相對表達量。

1.2.6 細胞增殖情況檢測 采用CCK-8 法檢測細胞增殖情況。取1.2.3 中轉染48 h 后的細胞，用胰酶消化細胞，制備細胞懸液；以2×103個/孔接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2環境下培養4 h；待細胞貼壁后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液（購自上海烜雅生物科技有限公司），在37 ℃、5% CO2環境下培養2 h，使用酶標儀（購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定波長450 nm 處的OD 值，實驗重復3 次。

1.2.7 細胞周期檢測 采用流式細胞術檢測細胞周期。取1.2.3 中轉染48 h 后的細胞，用胰酶消化細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；用預冷的PBS 溶液沖洗，加入無水乙醇，4 ℃孵育過夜；1 000 r/min離心5 min，吸出乙醇，用PBS 溶液清洗2～3 次，加入2 μL 的RNA 酶及0.5 mL 的PI 溶液[購自弗元（上海）生物科技有限公司，貨號FY600002]，室溫避光染色30 min；用300 μm 尼龍網膜過濾，轉移至新的含PBS 溶液的EP 管內，使用流式細胞儀（購自美國BD 公司）檢測細胞周期。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料以例（%）表示。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝纖維化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達水平比較

如表2 所示，隨著肝纖維化程度逐漸加重，慢性乙型肝炎患者的血清SDC-1 表達水平呈升高趨勢，S4 期高于S3 期，S3 期高于S2 期，S2 期高于S1 期，S1 期高于S0 期，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表2 不同肝纖維化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達水平比較

2.2 LX-2 細胞活化鑒定

NC 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達量分別為0.67±0.12 和1.13±0.16，TGF-β1 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達量分別為2.85±0.56 和3.72±0.61。與NC 組相比，TGF-β1組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達量均顯著升高（P均＜0.05）。

2.3 經TGF-β1 誘導活化的LX-2 細胞中SDC-1 表達水平的變化

NC 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達量分別為1.36±0.24 和1.21±0.18，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達量分別為2.63±0.52 和1.89±0.23。與NC 組相比，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達量均顯著升高（P均＜0.05）。

2.4 敲低SDC-1 表達對活化LX-2 細胞中α-SMA、TGF-β1 及THBS1 表達水平的影響

NC siRNA 組 中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相對表達量分別為2.63±0.59、5.72±1.36 和5.84±1.43，而α-SMA、TGF-β1 和THBS1 mRNA 的相對表達量分別為2.34±0.52、5.43±1.21 和5.67±1.36；SDC-1 siRNA 組中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相對表達量分別為1.46±0.37、3.11±1.25 和2.58±1.14，而α-SMA、TGF-β1和THBS1 mRNA 的相對表達量分別為1.53±0.35、2.79±1.28 和2.53±1.34。與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組中α-SMA、TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相對表達量均顯著降低，2 組的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

2.5 敲低SDC-1 表達對活化LX-2 細胞增殖的影響

如圖1 所示，與NC 組相比，TGF-β1 組的細胞增殖活性顯著增強（P＜0.05）；與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組的細胞增殖活性顯著減弱（P＜0.05）。

圖1 敲低SDC-1 表達對活化LX-2 細胞增殖的影響

2.6 敲低SDC-1 表達對活化LX-2 細胞周期的影響

如圖2 所示，與NC 組相比，TGF-β1 組中G1期細胞占比顯著降低，S 期和G2期細胞占比顯著升高（P均＜0.05）；與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組中G1期細胞占比顯著升高，S 期和G2期細胞占比顯著降低（P均＜0.05）。

3 討論

研究表明，1990年至2019年中國的乙型肝炎疾病負擔雖呈下降趨勢，但離2030年消除HBV 的目標仍存在差距，據貝葉斯模型預測，2020年至2030年中國的乙型肝炎的發病患者約為1 486.56萬例，死亡患者約為11.18 萬例，這提示仍需強化防控措施[9]。肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理特征，在中國肝纖維化主要是由慢性乙型肝炎所致[10]。SDC-1 是一種細胞表面蛋白，參與了細胞-基質的相互作用及信號轉導[11]。近年來的研究表明，SDC-1 在肝纖維化的進程中可能發揮著重要作用[5]。研究發現，肝癌細胞表面表達的SDC-1是阻止肝癌細胞遷移的重要因素[12]。因此，探究SDC-1 表達與肝纖維化之間的關系，以及其在肝纖維化進程中的作用機制，對于阻止肝纖維化進展具有重要意義。本研究發現，隨著肝纖維化程度逐漸加重，慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達水平呈升高趨勢，這表明慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 表達顯著上調，且其與肝纖維化進程相關，其有可能成為評估乙型肝炎患者肝纖維化程度的血清學標志物。

HSC 是肝纖維化進程中的重要角色。正常情況下，HSC 處于靜止狀態，位于肝小葉之間的腔隙中，當肝臟受到損傷或炎癥反應刺激時，HSC可被激活并轉化為成纖維細胞樣細胞，并通過合成和分泌細胞外基質蛋白，參與肝臟細胞外基質重塑，導致肝組織纖維化及瘢痕形成[13]。因此，抑制HSC 的活化和增殖并誘導其凋亡，是目前抗纖維化治療的重要策略[14]。TGF-β1 是肝纖維化形成的關鍵因子[15]。本研究使用TGF-β1 誘導LX-2細胞活化，結果發現與NC 組相比，TGF-β1 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達量均顯著升高，這符合以往的研究結果[16]。此外，本研究發現，與NC 組相比，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達量均顯著升高，進一步證實TGF-β1 在誘導HSC 活化過程中可促使細胞內SDC-1 表達上調，這提示SDC-1 與TGF-β1 可能存在相互作用?；诖?，本研究利用siRNA 技術引導內源性核酸酶切割攜帶互補序列的靶向RNA，結果發現轉染SDC-1 siRNA 后，經TGF-β1 誘導的LX-2 細胞中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達量均顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達可抑制經TGF-β1 誘導的LX-2 細胞活化。肝臟中的THBS1 主要由HSC 合成及分泌[17]。近年來的研究發現，TGF-β1 與THBS1 存在相互作用，THBS1 可通過調節TGF-β1/α-SMA/膠原相關信號通路抑制人心臟成纖維細胞的增殖及膠原合成，進而改善由心臟成纖維細胞中細胞外基質增多所引起的纖維化改變[18]。本研究結果顯示，轉染SDC-1 siRNA后經TGF-β1 誘導活化的LX-2 細胞中TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相對表達量均顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達可抑制TGF-β1/THBS1 信號轉導。此外，本研究結果顯示，敲低SDC-1 表達后，經TGF-β1 誘導活化的LX-2 細胞的增殖活性顯著減弱，G1期細胞占比顯著升高，S 期和G2期細胞占比顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達可抑制HSC 的活化及增殖，阻滯HSC 由G1期進入S 期和G2期。因此，通過干擾SDC-1 表達，可抑制HSC活化并減輕纖維化程度，SDC-1 有望成為抗纖維化治療的潛在靶點。

綜上所述，敲低SDC-1 表達可能通過調控TGF-β1/THBS1 信號通路，抑制HSC 的活化及增殖，阻滯HSC 由G1期進入S 期和G2期，進而發揮抑制肝纖維化進展的作用。SDC-1 與TGF-β1/THBS1信號通路間的調控作用有待今后開展更深入的研究揭示，同時動態監測SDC-1 的表達水平變化也有可能成為評估肝纖維化程度的方法。