上海地區支氣管擴張癥患者銅綠假單胞菌耐藥機制和分子流行病學特征

陳 慶 徐 蓉 孫景勇

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院臨床檢驗診斷中心，上海 200025；2.上海市臨床檢驗中心臨床微生物學研究室，上海 200126）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種條件致病革蘭陰性桿菌，在自然界中普遍存在，是醫院獲得性感染的主要病原。根據菌落形態，PA可分為黏液型和非黏液型。支氣管擴張癥被認為是僅次于哮喘和慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的第三大常見慢性呼吸道疾病，患者痰樣本中常分離出PA，PA感染是影響支氣管擴張嚴重程度和患者預后的一個重要危險因素，PA反復感染會導致病情頻繁惡化、死亡率增加。目前，支氣管擴張合并PA感染患者PA的耐藥特征、耐藥機制和分子流行病學相關研究較少。本研究擬分析支氣管擴張合并PA感染患者耐藥和分子流行病學特征，為臨床診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集分離自2019年6月—2021年11月上海地區6家三級甲等醫院18～75歲支氣管擴張癥患者痰樣本的PA 73株。采用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF，bio Mérieux，France）進行菌種鑒定，采用下一代基因測序技術（next generation sequencing，NGS）進行確認，通過菌落形態和拉絲試驗判定是否為黏液型PA。質控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自上海市臨床檢驗中心。本研究經上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 體外藥物敏感性試驗

參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-Ed32文件[1]對分離的PA菌株進行體外藥物敏感性試驗。測定的抗菌藥物包括：頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、哌拉西林/他唑巴坦（piperacilin/tazobactam，TZP）、美羅培南（meropenem，MEM）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、阿米卡星（amikacin，AMK）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、多黏菌素B（polymyxinB，PB）、頭孢吡肟（cefepime，FEP）、亞胺培南（imipenem，IPM）、哌拉西林（piperacillin，PIP），結果根據CLSI M100-Ed32文件[1]中的標準進行解釋。

1.2.2 DNA旋轉酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ、膜孔蛋白OprD比對

培養、分離、純化PA菌株后，提取分離株的DNA，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行NGS（細菌基因組掃描圖），獲得分離株的核酸序列和預測的氨基酸序列。將73株PA中對左氧氟沙星或環丙沙星非敏感菌株預測的氨基酸序列與GenBank數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）PA標準株PAO1的DNA旋轉酶亞單位GyrA、GyrB和DNA拓撲異構酶Ⅳ亞單位ParC、ParE的氨基酸序列進行比對分析；將73株PA中對亞胺培南非敏感菌株預測的氨基酸序列與GenBank數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）PA標準株PAO1中膜孔蛋白OprD的氨基酸序列進行比對分析。使用SnapGene-4.24軟件對上述結果進行比對分析。

1.2.3 耐藥基因檢測和同源性分析

將NGS所得核酸序列與Resfinder數據庫（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）進行比對，統計PA分離株中所含的耐藥基因。根據測定的核酸序列對菌株進行多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST），將所得核酸序列（7個管家基因：guaA、acsA、mutL、trpE、aroE、nuoD、ppsA）與PubMLST數據庫（https：//pubmlst.org/organisms/pseudomonasaeruginosa）進行比對，統計分離株的MLST結果，用phyloviz-2.0軟件進行MLST分析，基于phyloviz算法對菌株進行分組，基于等位基因特征的組定義繪制草圖，以顯示遺傳關系[2-3]。

1.3 統計學方法

采用WHONET 5.6軟件分析最終藥物敏感性試驗數據，采用SPSS 25.0軟件分析黏液型與非黏液型PA耐藥率的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同性別患者黏液型PA檢出情況

73株PA中，分離自男性、女性患者樣本的菌株分別為24株（32.9%）、49株（67.1%）。73株PA中，有43株（58.9%）為黏液型PA，30株（41.1%）為非黏液型菌株。

2.2 PA分離株對不同抗菌藥物的耐藥性

73株PA對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率最高，對左氧氟沙星的耐藥率為41.1%，對環丙沙星的耐藥率為34.2%；非黏液型PA對亞胺培南的耐藥率（20.0%）遠高于黏液型PA（7.0%）。未發現對多黏菌素B和阿米卡星耐藥的PA菌株。黏液型與非黏液型PA對臨床常用抗菌藥物的耐藥率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 PADNA旋轉酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ比對結果

73株PA中，對左氧氟沙星或環丙沙星耐藥的PA共44株。將這44株PA與PAO1進行比對，結果顯示，有單個蛋白突變15株，雙蛋白突變15株，3個蛋白突變10株，4個蛋白突變1株，4個蛋白均無突變菌株3株。見表2。

表2 PA DNA旋轉酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ突變預測結果

2.4 PA膜孔蛋白OprD比對結果

73株PA中，對亞胺培南非敏感的銅綠假單胞菌共13株，將這13株菌與PAO1進行比對，結果顯示全部存在突變或缺失。13株對亞胺培南敏感的PA中，有7株（53.8%）的突變類型（43D-N、57S-E、59S-R、202E-Q、210I-A、230E-K、240S-T、262N-T、267A-S、281AG、296K-Q、301Q-E、310R-G、359V-L、372-383：MSDNNVGYKNYG-VDSSSS缺失YAGL）完全一致，有5株（38.5%）存在替換合并大片段丟失，有1株（7.7%）存在3個位點（103TS、115K-T、170F-L）的突變。

2.5 PA分離株檢出獲得性耐藥基因情況

73株PA中，共發現20種不同類型的獲得性耐藥基因，包括β-內酰胺類、氨基糖苷類、磷霉素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類，見表3。所有菌株都含有blaPAO、aph（3'）-IIb、fosA和catB7；體外藥物敏感性試驗結果顯示，絕大多數耐藥基因與耐藥表型是一致的，但所檢出的獲得性耐藥基因crpP與喹諾酮類抗菌藥物的耐藥表型不相符。

表3 73株PA耐藥基因分布

2.6 73株PA的MLST結果

73株PA共檢出52個ST型別，其中1株為新發現的ST型，已遞交PubMLST數據庫。居第1位的ST型別為ST277，占5.5%（4/73），其次是ST274、ST357、ST514，各占4.1%（3/73）。52種ST型被分成12個克隆復合體，僅ST357（編號C470、C473、C694）與ST3991（編號C125）屬于同一個克隆復合體，并在進化上具有一定的同源性。73株PA菌株MLST最小生成樹見圖1。

圖1 PA MLST最小生成樹

3 討論

PA是常見的條件致病菌，也是導致支氣管擴張癥患者感染的最主要病原體。PA的感染或定植與支氣管擴張的發生、發展關系密切，該菌及其毒力基因會影響疾病的急性加重頻率和患者預后（如肺功能較差、肺功能下降速度更快、病死率更高）[4]。本研究收集了上海地區73例支氣管擴張癥患者痰樣本中分離出的PA，從性別比例上看，女性多于男性，與顧悅等[5]的研究結果相符。本研究結果顯示，支氣管擴張癥患者感染的PA中，黏液型所占比例較大（58.9%），與相關研究結果[6]一致。黏液表型的出現與PA通過群集感應系統調控生物膜的形成有關。而黏液型PA更容易定植于支氣管擴張癥患者氣道中，產生生物膜，不易被清除，同時產生毒力因子攻擊宿主細胞，導致多重耐藥和反復的支氣管-肺感染，為臨床治療帶來更多的挑戰。

本研究結果顯示，PA對氟喹諾酮類藥物的耐藥率最高（對左氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率分別為41.1%和34.2%），且黏液型PA的耐藥性高于非黏液型PA；對亞胺培南的耐藥率為12.3%，但黏液型菌株的耐藥率低于非黏液型；對其他類抗菌藥物的耐藥率均＜6%。2020年全國細菌耐藥監測報告顯示，PA對環丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率全國平均分別為12.2%、13.4%[7]，遠低于本研究結果。任何藥物在治療PA感染的過程中均可產生耐藥，而氟喹諾酮類藥物是支氣管擴張癥患者清除PA感染的一線治療藥物，此類患者往往反復感染，導致氟喹諾酮類藥物的長期反復使用，從而造成其耐藥率的上升，建議在治療前根據藥物敏感性試驗結果合理選擇抗菌藥物[1]。本研究NGS結果顯示，73株PA對氟喹諾酮類藥物的主要耐藥機制為DNA旋轉酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ的突變，最主要的突變位點集中在GyrA的83位和87位、GyrB的466位、ParC的646位和262位，ParE的533位，且Thr-83→Ile為主要的突變方式，與以往的報道[8]相似。有研究發現，有41.1%的PA菌株中含有一種近年來新發現的獲得性喹諾酮耐藥基因crpP，該基因編碼的酶可通過磷酸化修飾環丙沙星而使其失去作用[9]，但本研究中攜帶有crpP基因的PA基因型和耐藥表型并不一致，部分菌株表現為對環丙沙星高度敏感，與相關研究結果[10-11]一致，原因尚需進一步探究。PA對亞胺培南的耐藥機制主要為產碳青霉烯酶和膜孔蛋白OprD的缺失或突變[11]，本研究分離的13株亞胺培南非敏感PA除1株因攜帶blaIMP-45基因而產生耐藥外，其他菌株均存在OprD蛋白的突變或缺失，其中有7株的突變類型一致，且在372～383位點出現了廣泛的替代突變，同時還伴有氨基酸的缺失，與相關研究結果[12-13]相似。本研究僅發現4株對頭孢他啶或頭孢吡肟耐藥的菌株，除1株攜帶blaIMP-45外，NGS未檢測到超廣譜β-內酰胺酶基因，而是和其他敏感株一樣，含有多種OXA型β-內酰胺酶，但這些OXA型β-內酰胺酶通常僅水解青霉素類藥物，并不介導細菌對頭孢菌素的耐藥?；谏鲜?株耐藥菌株同時對哌拉西林/他唑巴坦耐藥，本研究推測其可能的耐藥機制為誘導型AmpC酶突變引起酶的高表達。本研究中，PA對多黏菌素B和氨基糖苷類藥物高度敏感，僅發現1株對妥布霉素耐藥菌株，上述抗菌藥物的吸入治療是國外指南[14]推薦的清除PA支氣管擴張癥患者感染的重要措施。我國抗菌藥物吸入劑型尚未獲批，但考慮到此類藥物的高敏感性，可以聯合β-內酰胺類靜脈用藥作為二線治療。本研究中，黏液型與非黏液型PA耐藥率差異無統計學意義，可能與收集的菌株數量較少有關。

定義PA高?？寺≈炅餍刑卣鞯慕饦藴适?9年前Barry Curran開發的MLST分型方案[15]，迄今為止已經發現了超過4 000個ST型別。ST235、ST111和ST175是全球范圍內PA流行的主要克隆株[16]。然而，在本研究中，73株PA被分成53種ST型，其中最多的ST277（在巴西廣泛流行[17]）也僅占5.5%（4/73），其次為ST274、ST357（與高毒力相關[18]）、ST514，各占4.1%，提示上海地區支氣管擴張癥患者感染的PA不存在明顯的暴發流行。遺憾的是，本研究菌株數較少，且缺乏我國支氣管擴張癥患者感染PA的分子流行病學數據，尚需進一步擴大菌株數，以進一步明確上海地區支氣管擴張癥患者感染的PA的分子流行特征。