安眠酮膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

劉國華，蔣永青，陳 彤*，黃 婷，許 芳

(1.深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518000；3.深圳市綠詩源生物技術有限公司，廣東 深圳 518120)

安眠酮(methaqualone，MTQ) 又名甲苯喹啉酮，化學式為C16H14N2O，在臨床上常用作催眠藥、鎮定藥，主要用于動物過度興奮或驚厥，可使其機體平靜，人若過量服用安眠酮則會出現安眠酮中毒現象，表現為意識模糊不清、注意力不集中、惡心、頭暈、無力、煩躁不安甚至短時間內精神失常等[1]。在醫學上，服用小劑量的安眠酮會使服用者進入極端神經質和興奮狀態，長期服用則會產生依賴性或成癮性[2]。1978 年以來隨著安眠酮使用量的逐漸增加，安眠酮成為濫用藥品之一。1971 年《精神藥物公約》將安眠酮列入其中，并已有17 個國家禁止使用和出口安眠酮，我國于1987 年禁止了安眠酮的生產和流通。

同時，安眠酮還具有促進畜禽生長、誘導畜禽入睡和提高產量的作用，隨著我國畜牧業的壯大，一些養殖場(戶)因利益的驅動，在飼喂畜禽時肆意補充，造成動物源性食品的獸藥殘留量超標，影響人類的身體健康[3-4]。2007 年，中華人民共和國農業農村部公告第824 號文件明確規定，國家管制的精神藥品，如安眠酮，在動物源性食品中殘留為零。根據《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》(中華人民共和國農業農村部公告第250 號)文件規定，安眠酮為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出。

目前，我國尚未規定安眠酮在動物源性食品中的殘留限量和檢測方法標準，國際社會對安眠酮殘留檢測也尚未有相應的檢測標準。安眠酮的檢測方法主要有高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[5]、氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[6]和液相色譜-串聯質譜聯用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[7]等。但在檢測過程中，這些方法存在樣本前處理復雜、所需儀器設備昂貴、操作繁瑣、效率較低、成本較高等缺陷，且無法快速檢測出動物源性食品中安眠酮的殘留量。因此，亟須建立一種快速、靈敏、準確的安眠酮殘留量檢測方法，對豬肉等動物源性食品中安眠酮的殘留量進行檢測和篩查，為我國畜禽產品中安眠酮殘留量檢測方法的國家標準制定提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗所用3 只雄性新西蘭大白兔購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑

氯金酸、牛血清白蛋白均購自山東省青島市李滄區中恒展創生物技術中心公司，碳酸鉀購自國藥集團化學試劑有限公司，弗氏完全佐劑購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，二甲基甲酰胺、碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、檸檬酸三鈉復溶液均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

BSA4202S 電子天平購自賽多利斯科學儀器有限公司，XYZ 三維劃膜噴金儀、ZQ2000 切條機由上海金標生物科技有限公司生產，HD-9623A 電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司，TWCL-T1000 加熱磁力攪拌器由鞏義市予華儀器有限責任公司生產，H2-16KR 高速冷凍離心機購自湖南可成儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 安眠酮半抗原的制備及鑒定

以鄰乙酰氨基苯甲酸和3-甲基-4-氨基苯甲酸甲酯為化學原料，通過一系列縮合反應和水解反應實驗，最終獲得安眠酮半抗原，并對其進行質譜鑒定。

1.2.2 安眠酮抗原的制備

10.0 mg 安眠酮半抗原溶解于1 mL 二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF) 中作為反應液Ⅰ；30 mg 碳化二亞胺(carbo diimide，EDC) 和20 mg N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS) 用0.5 mL DMF 充分溶解后加入反應液Ⅰ中，室溫下攪拌24 h，作為反應液Ⅱ；60 mL 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 充分溶解在6.0 mL pH 為8.0 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，將反應液Ⅱ逐滴緩慢滴加到BSA 溶液中，并于室溫下攪拌24 h，作為反應液Ⅲ；用0.01 mol/L PBS 在4 ℃時透析3 d，以除去未反應的小分子物質，獲得包被抗原，于—20 ℃保存備用。

1.2.3 安眠酮多克隆抗體的制備及鑒定

用合成的抗原免疫試驗動物，制備多克隆抗體。選擇雄性新西蘭大白兔3 只，體重2 kg左右，編號分別為1 號、2 號、3 號，采用頸背部皮下多點注射法免疫。免疫程序如下：將相同體積的免疫抗原與弗氏完全佐劑混合進行乳化，初次免疫劑量為0.5 mg/只。初次免疫后第21天和第42天進行加強免疫，劑量為0.4 mg/只，乳化方法相同。以后每隔21 d 加強免疫一次，共免疫8 次。從第3 次加強免疫開始，每次免疫7 d 后對動物采血并進行血清效價測定和特異性檢測，安眠酮陽性濃度設定為10 μg/kg和30 μg/kg。

1.2.4 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取500 mL 超純水置于1 L 圓底燒瓶中，放入3.0 cm 轉子，上接冷凝管置于磁力加熱攪拌器上加熱煮沸，煮沸后繼續加熱3 min。準確吸取2.4 mL 1% AuCl3溶液加入圓底燒瓶中，繼續加熱至煮沸，煮沸持續5 min，再吸取9.1 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，迅速加入圓底燒瓶中，繼續煮沸，同時觀察瓶中的顏色變化；當顏色呈穩定的酒紅色后，繼續煮沸10 min，取出圓底燒瓶置于操作臺上，冷卻至室溫，補水至原體積，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.5 膠體金最適標記pH

取4 根無菌的1.5 mL 試管，每管加入1 mL 膠體金溶液，分別加入2、3、4、5 μL K2CO3(0.2 mol/L) 調整各管溶液pH。反應10 min 后，每管加入10 μg/mL 的安眠酮多克隆抗體，混勻靜置15 min 后觀察膠體金顏色。每管加入100 μL BSA(10%)溶液混勻封閉1 h，4 ℃ 8 000 r/min 離心10 min，200 μL 復溶液重懸，使用試紙條檢測，確定最適標記pH。

1.2.6 膠體金最佳蛋白標記量

取3 個無菌的1.5 mL 試管，每管加入1 mL膠體金溶液，加入4 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液混勻，再分別加入3.52、7.40 和10.92 μg/mL的安眠酮多克隆抗體，混勻靜置20 min，向每管中加入100 μL BSA(10%)溶液，混勻后封閉1 h，4 ℃ 8 000 r/min 離心10 min，200 μL 復溶液重懸，使用試紙條檢測，確定最佳蛋白標記量。

1.2.7 膠體金標記抗體制備

取100 mL 膠體金溶液置于250 mL 燒杯中，將燒杯放于磁力攪拌器上，放入轉子，向其中加入400 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液，用保鮮膜封口，200 r/min 攪拌10 min。用超純水稀釋抗體使其蛋白濃度為7.4 μg/mL，向調整好pH 的膠體金溶液中逐滴加入稀釋好的抗體溶液，待溶液攪勻20～30 s 后吸取膠體金溶液，加入到稀釋抗體的離心管中，洗凈管壁上殘留的抗原，吹吸3～5 次，并將溶液加回至燒杯中。繼續攪拌30 min，向標記好的膠體金溶液中加入10 mL BSA(10%)溶液，室溫攪拌封閉30 min，4 ℃ 10 000 r/min 離心30 min。結束后取出離心管收集下層濃縮的金標抗體。根據量取的膠體金體積計算加入的復溶液體積，向收集的金標抗體中加入復溶液，混勻，備用。

1.2.8 試紙條的組裝

使用噴膜儀在玻璃纖維上噴金標抗體，噴量為8 μL/cm，38 ℃下干燥24 h，即得金標墊；將偶聯抗原安眠酮-卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)用0.02 mol/L PBS 緩沖液(pH 為7.4)稀釋至0.8 mg/mL，用噴膜儀噴于硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上，噴量為2 μL/cm，為檢測線(T 線)；在檢測線上面5 mm 處噴涂羊抗鼠IgG(0.8 mg/mL)，噴量為2 μL/cm，為質控線(C 線)，38 ℃下干燥24 h。干燥完成后依次將NC 膜、金標墊、樣本墊、吸水墊貼在聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)板上，組裝成半成品試紙。將組裝好的半成品試紙用切條機切割成4 mm 寬的試紙條，分別裝入塑料卡殼中，用壓殼機將殼封閉，制備成成品檢測試紙條。

1.2.9 檢測時間分析

按照安眠酮膠體金免疫快速檢測試紙條操作流程，2 人一組，共計5 組，對陰陽性標準品進行檢測，記錄樣本檢測時間。

1.2.10 試紙條操作方法

將檢測卡平放，用微量移液器吸取待檢樣本100 μL 加入檢測卡加樣孔中，靜置5～8 min后觀察結果并讀數，其他時間讀數無效。如果T 線顯色強于C 線或與C 線顯色無明顯差異，說明樣本呈陰性，即樣本不含安眠酮或其濃度低于檢測限；如果T 線顯色明顯弱于C 線顯色，或者T 線不顯色，說明樣本呈陽性，即樣本中安眠酮濃度等于或高于檢測限；如果C 線不顯色，則無論T 線顯色與否都說明此試紙條已經失效(圖1)。

1.2.11 試紙條的性能評價

1.2.1 1.1 敏感性試驗 將安眠酮標準品配成1 μg/kg 濃度，再將5 個陰性尿樣配制成不同濃度(0、10、20、30、40、50 μg/kg)，分別用試紙條進行檢測，觀察顯色結果。每個濃度重復3 次，根據結果確定試紙條的敏感性。

圖1 試紙條結果判定示意圖

1.2.1 1.2 特異性試驗 將其他相關動物常見獸藥殘留物質包括四環素類、喹諾酮類、磺胺類等藥物，用0.02 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖液配制成濃度為500 μg/kg 的溶液，分別取100 μL 用試紙條進行檢測，觀察顯色結果。每個濃度的樣本重復檢測3 次，根據結果確定試紙條的特異性。

1.2.1 1.3 準確性試驗 試紙條的準確性通常以假陽性率和假陰性率表示，假陽性率應小于5%，假陰性率應為0。用試紙條檢測經儀器確證的50 份陰性樣本(質量分數＜30 μg/kg)和50 份陽性樣本(質量分數＞30 μg/kg)，計算假陽性率和假陰性率。

1.2.1 1.4 重復性試驗 取同一批次和不同批次的試紙條分別檢測已經儀器確證的20 份陰性樣本(質量分數＜30 μg/kg)和20 份陽性樣本(質量分數＞30 μg/kg)，每個樣本重復測定3 次，確定試紙條的重復性。

1.2.1 1.5 穩定性試驗 將制備好的試紙條密封后儲存于37 ℃，分別在第0、5、10、15、20、25、30 天，抽取不同保存期限的試紙條，檢測已經儀器確證的樣本，確定試紙條的穩定性。

2 結果

2.1 安眠酮半抗原的鑒定結果

對獲得的安眠酮半抗原進行質譜鑒定，半抗原的理論相對分子質量是365.3，質譜的正離子模式(+1)，測出的相對分子質量是366.3(圖2)，說明安眠酮半抗原合成成功。

圖2 安眠酮半抗原的質譜檢測圖

2.2 安眠酮抗原的制備結果

本研究制備的安眠酮半抗原，其結構上有活性基團羧基，利用羧基和氨基成為酰胺鍵的原理，以此偶聯載體蛋白。偶聯結果采用紫外分光光度計進行測定，掃描結果顯示(圖3 和圖4)，BSA 和卵清白蛋白的波峰均在278 nm，安眠酮在264 nm 處有一個波峰，偶聯產物的波峰分別在303 nm 和305 nm。偶聯產物紫外吸收峰發生偏移可能是半抗原交聯到載體蛋白上引起的，說明兩種完全抗原均偶聯成功。

2.3 安眠酮多克隆抗體的鑒定

兔血清ELISA 測定結果見表1。由表1 可知，制備的安眠酮多克隆抗體可以特異性識別安眠酮，說明多克隆抗體制備成功。

2.4 膠體金最適標記pH 結果

圖5 膠體金最適標記pH 結果

膠體金最適標記pH 結果見圖5。由圖5可知，含2 μL K2CO3的膠體金幾乎呈黑色，3 μL 碳酸鉀的膠體金呈黑紫色，4 μL K2CO3的膠體金呈酒紅色，5 μL K2CO3的膠體金也呈酒紅色。說明安眠酮抗體標記調節pH 的K2CO3用量為4 μL。

2.5 膠體金最佳蛋白標記量結果

膠體金最佳蛋白標記量結果見圖6。圖6 表明，安眠酮抗體標記最佳用量為7.4 μg/mL。

2.6 檢測時間分析結果

檢測時間分析結果見表2。表2 表明，研制的試紙條檢測時間小于5 min。

圖6 膠體金最佳蛋白標記量結果

2.7 敏感性試驗結果

不同濃度的樣本分別與試紙條反應后，觀察試紙條顯色。由表3 可知，試紙條能夠檢測出安眠酮的敏感性較高，為30 μg/kg。

2.8 特異性試驗結果

試紙條的特異性檢測結果見表4。由表4可知，試紙條檢測500 μg/kg 的四環素類、喹諾酮類、磺胺類等藥物，結果均為陰性，說明制備出的試紙條能夠特異性地與安眠酮結合，與其他小分子藥物沒有交叉反應，特異性較好。

2.9 準確性試驗結果

用檢測卡分別檢測50 份陰性樣本，檢測結果如圖7 所示，均為陰性，說明假陽性率＜5%；用檢測卡分別檢測50 份陽性樣本，檢測結果如圖7 所示，均為陽性，說明試紙條假陰性率≤0.5%。

2.10 重復性試驗結果

同一批次和不同批次的試紙條分別檢測每個樣本，并重復測定3 次，結果顯示檢測結果相同，說明試紙條重復性良好。

2.11 穩定性試驗結果

試紙條的穩定性檢測結果見表5。由表5可知，檢測卡在儲存溫度37 ℃下，一個月內穩定性指標均符合要求，無假陽性或假陰性情況發生，說明試紙條穩定性較好。

3 結論

圖7 試紙條的準確性檢測結果

本研究成功制備出安眠酮半抗原，使之與牛血清白蛋白/卵清白蛋白偶聯，分別得到安眠酮免疫抗原和安眠酮包被抗原，以安眠酮多克隆抗體和安眠酮包被抗原作為主要原料，制備出安眠酮膠體金免疫快速檢測試紙條，并對其性能進行了評價，證明該試紙條敏感性較高、特異性較好、準確性較高、重復性良好、穩定性較好，且具有操作方便、快速的優點。因此，本研究開發的安眠酮膠體金免疫快速檢測試紙條對動物源性食品中安眠酮殘留量的現場快速檢測和篩查具有較大的實際意義。