固定化海洋脫氮假弧菌轉氨酶實現可循環生物催化*

邵小芙,果 波,高 嵩,曹 陽

(江蘇海洋大學 a.藥學院; b.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,江蘇 連云港 222005)

近年來,隨著科學技術的發展與研究手段的豐富,陸地生物得以被廣泛且更為深入地研究[1]。較之于陸地,海洋資源占據著全球面積的70%,且存在較為極端的生存環境,生物隨之進化出可適應不同環境的生存能力[2-3]。隨著對海洋研究的深入,一些結構新穎且具有獨特生物活性的活性物質逐漸為人們所關注[4-5]。在對維系海洋生物生命活動的酶作用的探索中,由于生存環境的選擇及限制,一些被挖掘的酶呈現出特殊的活性作用,如較高的滲透壓承受能力及高鹽溶液下的穩定性[6]。

海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶區別于以往發現的大多數轉氨酶,在其催化位點的遠端手性中心同樣具有立體識別能力[7],這種能力在轉氨酶的報道案例中是極為罕見的[8],即使是少數存在第二位點選擇能力的轉氨酶,也更多是在靠近催化位點進行識別[9-10]。海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶的遠端(S)-型手性中心選擇催化能力被Gavin等進行多底物深入研究,測試結果表明這種具有特殊催化活性的轉氨酶可在以1-四氫萘胺和1-氨基茚滿為胺基供體的轉胺反應中發揮高效活性,并且可實現遠端手性中心的識別與催化,生成的酮類產物對映體過量值可高達93%[7]。海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶的遠端(S)-型手性中心選擇能力同樣可以識別拆分抗抑郁藥物舍曲林關鍵中間體[11]。經海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶中間體拆分可簡化舍曲林的合成工藝[12]。

但酶材料的制備工藝較為復雜,使用時易造成較差的穩定性,且無法實現持續性使用,導致大規模生產應用成本較高。固定化工藝是上述問題的有效解決途徑。經固定化的酶相較于游離酶具備更強的穩定性及環境抗壓能力,且固定化后的酶可克服游離酶無法回收利用的缺點,降低生產成本[13]?，F有的吸附法[14]、交聯法[15]、包埋法[16]、載體共價結合法[17]等主要固定化工藝由于非精細化固定方式的限制,往往會造成一定的酶活性損失。

噬菌體展示技術自20世紀90年代被開發應用以來[18],已成功應用于多種病毒疫苗作為展示載體[19]。T4噬菌體是一種T-偶數型裂解性細菌侵染病毒噬菌體,由頭部、尾部及尾絲三部分構成[20]。T4噬菌體頭部由主要衣殼蛋白gp23及次要衣殼蛋白gp24組成衣殼骨架。Hoc(高抗原性外衣殼蛋白)及Soc(小外衣殼蛋白)為二十面體形狀的衣殼上附加結合蛋白。由于Hoc及Soc蛋白與T4噬菌體衣殼之間以可分離及高生物親和的方式結合,外源肽段及蛋白序列被允許與其融合從而展示在T4噬菌體衣殼的結合位點[19]。本研究建立以T4噬菌體衣殼為固定化系統,采取親和固定化工藝構建海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶的精細化生物材料固定化體系,以期實現酶活的高效保留回收。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶質粒及融合蛋白擴增引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,Taq PCR擴增酶、高保真酶、PCR產物純化試劑盒購自莫納生物科技有限公司,NdeⅠ內切酶試劑盒、Hind Ⅲ內切酶試劑盒購自江蘇愚公生物科技有限公司,大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞、BL21(DE3)pLysS感受態細胞、BL21(DE3)-RIPL感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司,細菌蛋白抽提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司,(S)-ɑ-甲基芐胺、5′-磷酸吡哆醛、丙酮酸鈉、乙腈購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器及設備

AKTA蛋白純化系統,英國GE Healthcare公司;Centrifuge 5424R高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份公司;低溫超高壓連續流破碎機,廣州聚能納米生物科技股份有限公司;島津LC-20型高效液相色譜儀,日本島津公司;PCR熱循環儀器,伯樂生命醫學產品有限公司;迷你金屬浴,杭州米歐儀器有限公司;藍光速射儀,北京諾禾致源科技股份有限公司;生化培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;微量分光光度計,賽默飛世爾科技公司。

1.3 Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端的融合蛋白設計

將包含海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶的大腸桿菌表達系統pET28a表達載體轉入至DH5ɑ感受態細胞中復制,使用無縫克隆技術構建Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端的融合蛋白表達序列。以位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶序列N端的NdeⅠ內切酶識別序列作為切割位點進行載體切割,形成線性化載體;無縫克隆重組技術中Soc片段插入載體所需的載體同源臂通過PCR擴增引物引入,正向引物及反向引物的兩端各含一段載體及Soc片段序列。反向引物的載體序列及Soc片段序列之間引入9堿基大小的柔性linker,避免海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶及Soc蛋白折疊表達的相互影響,Soc片段擴增正反引物序列見表1。

表1 Soc片段擴增引物序列Table 1 Primer sequence of Soc fragment amplification

1.4 Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶C端的融合蛋白設計

Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶C端的融合蛋白表達序列同樣以無縫克隆技術構建,選擇實驗室原有的含有Soc片段的pET28b大腸桿菌表達系統作為構建載體。線性化載體的獲得基于Soc片段序列N端存在HindⅢ內切酶識別位點;海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶序列插入所需的載體同源臂同使用擴增引物引入,反向引物的載體序列及海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶片段序列之間同引入9堿基大小柔性linker,避免海洋脫氮假弧菌ω轉氨酶及Soc蛋白折疊表達的相互影響。海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶擴增正反引物序列見表2。

表2 海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶片段擴增引物序列Table 2 Primer sequence of marine P. denitrificans ω-transaminase fragment amplification

1.5 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶重組融合蛋白表達

兩種重組融合蛋白首先轉入大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞進行測序。選取測序結果正確的重組融合蛋白表達質粒轉入大腸桿菌RIPL感受態細胞中進行重組體的少量培養表達,對重組融合蛋白的誘導表達溫度進行了篩選,選取的溫度分別為16 ℃和23 ℃。使用細菌蛋白抽提試劑盒對誘導表達后的細胞進行處理,結果通過10%SDS-PAGE進行可視化觀察。

1.6 重組融合蛋白的T4噬菌體衣殼固定化

選取表達情況適宜的重組融合蛋白,進行固定化展示。重組酶固定化的反應體積為4 mL,加入酶3.86×10-2μmol,加入T4噬菌體衣殼1.172×10-6μmol,在固定化緩沖液(PI-Mg buffer)環境下孵育1 h,孵育溫度為16 ℃。孵育后的反應液經離心收集固定化后的酶,離心轉速為15 000 r/min,時間為70 min。用1 mL重組酶儲存緩沖液重懸收集到的離心沉淀,清洗未固定化的游離酶,再以15 000 r/min離心70 min收集固定化酶,離心沉淀用100 μL儲存緩沖液重懸。

1.7 固定化酶活性評價

固定后的酶活保留是酶固定化效果的一大指征。以(S)-α-甲基芐胺作為氨基供體底物,丙酮酸鈉作為氨基受體,測定轉氨酶經固定化后的催化活性保留效果。測定條件為反應溫度30 ℃,時間1 h。以乙酸乙酯進行產物苯乙酮及殘留氨基供體底物的有機相提取,收集的有機相通過TLC進行結果觀察。TLC的展開條件為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=9∶1。

固定化酶的酶活回收效率是固定化效果另一大指征?；厥詹捎玫臏y試底物及條件同酶活測試。加入酶溶液啟動催化反應,待達到反應時間,將固定化酶反應體系放置于4 ℃離心機中,在15 000 r/min轉速下離心70 min實現固定化酶回收;小心轉移離心后的上清反應液于干凈的1.5 mL EP管中,向離心沉淀中加入1 mL lysis buffer清洗殘留的溶液,小心吸走清洗液,加入100 μL lysis buffer對固定化酶進行重懸,加入至反應液中開啟下一輪循環催化反應。循環催化反應共計4組,設置3組平行。經催化的反應液同樣以等體積的乙酸乙酯進行有機相萃取。萃取的乙酸乙酯通過高效液相進行檢測,高效液相檢測波長為254 nm。

2 結果

2.1 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶重組融合蛋白選擇

兩種不同誘導表達溫度下的融合蛋白呈現出不同的上清融合表達效果。Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端的重組融合蛋白于膠圖誘導上清通道中可見清晰明顯條帶;Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶C端的重組融合蛋白的誘導上清通道中目的條帶幾乎不可見,對比圖如圖1所示。膠圖結果表明,Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端的重組融合蛋白上清可溶表達性質更佳,因此選擇Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端的重組融合蛋白作為固定化反應使用的融合蛋白。

a Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶N端重組融合蛋白

b Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶C端重組融合蛋白注:紅色箭頭所指為重組融合目的蛋白。圖1 兩種重組融合蛋白上清融合表達可溶性驗證Fig.1 Supernatants soluble expression verification of two recombinant fusion protein

2.2 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶重組融合蛋白表達優化

將選擇的重組蛋白進行大批量發酵誘導表達發現,上清可溶表達的重組蛋白收率較低,無法滿足后續實驗的要求,因此需對重組蛋白的上清可溶表達進行優化。本文選擇具有較高mRNA穩定性的BL21(DE3)pLysS感受態細胞作為重組蛋白的表達系統進行進一步表達。重組蛋白純化結果對比膠圖如圖2所示。從圖中可以看出,經BL21(DE3)pLysS感受態細胞表達的重組蛋白上清可溶表達量得到顯著提升,可以滿足后續實驗對于重組蛋白產量的要求。

a 大腸桿菌RIPL感受態表達系統

b 大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態表達系統注:紅色箭頭指示為目的蛋白。圖2 重組融合蛋白上清可溶表達優化前后純化膠圖Fig.2 Purified gel diagram of recombinant fusion protein before and after supernatant soluble expression optimization

2.3 重組融合蛋白位于T4噬菌體衣殼的固定化展示

固定化結果采取SDS-PAGE膠圖進行可視化驗證,T4噬菌體衣殼中組成數量為930拷貝的主要衣殼蛋白gp23(大小為49 kDa)可作為T4噬菌體存在的判定依據。如圖3所示,經固定展示的體系電泳泳道中位于49 kDa附近處存在蛋白條帶,證明了gp23蛋白的存在,且T4噬菌體衣殼其他位點處存在的蛋白皆可在固定展示體系電泳泳道中找到與之相對應的條帶,驗證了固定展示體系中T4噬菌體衣殼的存在。固定展示體系電泳泳道中位于重組融合蛋白大小(62 kDa)位置處的清晰條帶證明了固定展示體系中重組融合蛋白的存在。以上結果說明,經重組構建表達的融合蛋白被成功固定于T4噬菌體衣殼的Soc結合位點處。

注:紅色箭頭指示為重組融合蛋白;藍色箭頭指示為T4噬菌體衣殼主要衣殼蛋白gp23。圖3 重組融合蛋白與T4噬菌體衣殼固定化展示驗證膠圖Fig.3 Verified gel map of recombinant fusion protein immobilization with T4 phage capsid

2.4 固定化酶的活性驗證

固定化酶催化性能檢測的TLC結果如圖4所示。游離酶及固定酶的反應體系加入的酶催化溶液的濃度相同,游離酶及固定酶的反應體系中位于產物苯乙酮標準品顯影位置處均具有一致的顯影產生,兩者Rf值相同,且在底物(S)-α-甲基芐胺的檢測通道內并無苯乙酮位置處的顯影產生。TLC結果證明了游離酶及固定酶反應體系中有產物苯乙酮的生成,且游離酶及固定酶的反應體系中均無與(S)-α-甲基芐胺相同Rf值的物質顯示,從而驗證了經T4噬菌體衣殼固定化后的酶仍保留了較好的生物催化活性。

圖4 固定化酶酶活TLC測試Fig.4 Immobilized enzyme TLC activity test

2.5 固定化酶回收性能驗證

為確定經固定化酶的回收能力,對經離心回收的固定化酶催化反應體系上清進行了15%SDS-PAGE驗證,以相同濃度的重組融合酶催化反應體系為對照,15%SDS-PAGE的測試量相同。測試結果如圖5所示,重組融合酶的催化反應體系電泳泳道中可見60 kDa處明顯蛋白條帶,固定化酶催化反應體系中相應處的蛋白條帶幾不可見。由此可證,經T4噬菌體衣殼固定化后的重組融合酶經高速離心得到了較好回收。

注:紅色箭頭指示催化體系電泳泳道中的重組融合蛋白條帶;藍色箭頭指示重組酶對照電泳泳道中的重組融合蛋白條帶。圖5 固定化酶回收測試Fig.5 Immobilized enzyme recovery test

固定化酶的酶活回收效率經HPLC測試后,繪制成線性圖,回收結果如圖6所示。經4輪催化測試,平均每輪酶活的回收效率>92%,由此可以看出,經T4噬菌體衣殼固定化的海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶可實現良好的酶催化活性回收。

a 酶活回收測試體系的HPLC監測

b 酶活回收率曲線圖6 固定化酶酶活回收效率測試Fig.6 Enzyme activity recovery efficiency test of immobilized enzyme

3 討論

由于海洋資源占據著全球資源的70%,且存在廣泛的生物多樣性,海洋活性物質的挖掘及開發占據了新型活性物質挖掘的重要一環。海洋環境與陸地具有較大差異,使得海洋生物的生命活動維持所需活性物質會區別于陸地生物。隨著人們對海洋生物探索的不斷深入,一些結構新穎、活性獨特的活性物質逐漸被發現。

來自于海洋脫氮假弧菌的ω-轉氨酶具有區別于以往發掘ω-轉氨酶的獨特遠端手性中心(S)-型選擇性,這在酶催化領域也是較為少見的。由于具有獨特的選擇性,海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶可在1-四氫萘胺和1-氨基茚滿的轉氨反應中發揮特別的作用,生產的酮類也具有很高的對映體過量值,且這種獨特胺手性中心選擇性可應用于抗抑郁藥物關鍵中間體的拆分制備。當前的酶催化材料存在著穩定性不高、無法重復性利用的缺點,這在一定程度上限制了其在工業生產中的應用,而引入固定化工藝則存在解決上述問題的可能性,但這面臨著另外一個問題,即以往常用材料的固定化工藝通常存在吸附能力不強而易解析脫落、載體活化復雜、易造成酶的精細功能喪失等缺點。

本研究使用的T4噬菌體衣殼為生物固定化材料,與T4噬菌體衣殼附加Soc蛋白融合后的海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶,可基于T4噬菌體衣殼與Soc蛋白之間的高生物親和力自組裝固定于T4噬菌體衣殼的Soc結合位點,在構象上給予酶催化活動更多的空間,這種精細化的固定化方式可實現酶催化活性的高效保留。通過兩種不同結構重組融合蛋白的設計及選擇優化,本研究成功實現可與T4噬菌體衣殼結合重組融合蛋白的表達,且獲得可滿足實驗需求的較高上清可溶表達量的重組融合蛋白。通過TLC測定了固定化酶的催化活性,TLC的Rf值結果證明了固定化酶活性的保留。同時對固定化酶的催化體系進行了簡單離心回收,催化活性回收實驗結果顯示,平均每輪的酶活回收率>92%。以上結果揭示,經T4噬菌體衣殼固定化后,海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶的催化性能得以被有效保留,且能夠實現高效回收,可進一步推動海洋脫氮假弧菌ω-轉氨酶催化工藝中的應用。