松墨天牛對小蠹危害后馬尾松揮發物的氣相色譜-觸角電位聯用技術反應1)

楊夢君 魯進韜 許原 陳曉 楊振德 熊運凡 胡平

(廣西高校亞熱帶人工林培育與利用重點實驗室(廣西大學),南寧,530004)

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)又稱松褐天牛,屬鞘翅目(Coleoptera)、天?？?Cerambycidae)、墨天牛屬(Monochamus)。松墨天牛是松樹重要的蛀干害蟲,同時也是全球毀滅性森林病害——松材線蟲病的主要傳播媒介,對我國馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarrière)、華山松(PinusarmandiiFranch.)、落葉松(LarixgmeliniiKuzen.)和雪松(CedrusdeodaraG. Don)等多種松樹造成嚴重危害,造成松林大面積死亡[1-2]。防止松材線蟲病蔓延的主要途徑之一是防控媒介昆蟲松墨天牛。常用的防控手段有及時清理枯死樹木、噴灑化學藥劑等,而在天牛的監測上,植物源引誘劑扮演了重要角色。已有研究表明,添加了植物源揮發物的誘芯能顯著提升對天牛的誘捕效果[3]。因此,厘清松樹揮發物中的引誘活性物質對松墨天牛的防控具有重要意義。

植物揮發物是指植物的地上部分散發產生的揮發性有機化合物(VOCs),主要為萜類、醇、醛、酯類化合物。大多數寄主植物受到害蟲的侵害時,會改變揮發性組分的種類、比例、濃度,這些蟲害誘導揮發物(HIPVs)可影響昆蟲的行為,例如,棉花(Gossypiumspp.)被?；页嵋苟?SpodopteralittoralisBoisduval)取食后,誘導產生的4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯會抑制成蟲的交配和產卵行為[4];馬鈴薯甲蟲(LeptinotarsadecemlineataSay)的成蟲可被其幼蟲危害后的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)植株所吸引[5]。此外,蟲害誘導揮發物對于同寄主的不同植食性昆蟲也會產生一定的影響,有研究發現,受到蚜蟲(MacrosiphumeuphorbiaeThomas)危害的番茄(SolanumlycopersicumL.)植株更能吸引甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHvbner)取食[6]。本課題組在對感染松材線蟲病初期和中期的馬尾松進行調查時發現,在同時遭受松樹材小蠹(X.festivusEichhoff)危害的馬尾松嫩梢上極易發現被松墨天牛取食的痕跡。有試驗證明,未交配的松墨天牛成蟲對于受害馬尾松揮發物呈負趨性[7],據此推測,受小蠹蛀干危害的馬尾松枝揮發物能吸引松墨天牛成蟲前來取食,小蠹與松墨天牛存在協同危害的可能。本研究采用動態頂空吸附法收集受小蠹危害的馬尾松側枝與其生長端上的1年生松嫩梢的揮發性組分,利用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)和氣相色譜-觸角電位聯用技術(GC-EAD)初步鑒定其組分,并篩選出對松墨天牛有觸角電生理反應的物質,為綜合防治松墨天牛提供參考。

1 材料與方法

供試植物：本試驗在廣西南寧興寧區(地理中心坐標為108°22′13.6″E,22°54′7.5″N),對3棵已經感染松材線蟲病的馬尾松病株(圖1-A,B,C),采集受到松樹材小蠹危害的側枝,以及其生長端的當年生綠色嫩梢(圖1-D,E,F),側枝截面直徑約6 cm,長度約30 cm,當年生松梢長度約40 cm。將采集后的植物材料裝入保鮮密封袋內保濕,帶回實驗室備用。

A、B、C為馬尾松病株;D為被松墨天牛取食的嫩梢;E為被松樹材小蠹危害的側枝;F為1年生松嫩梢樣品。

供試蟲源：松墨天牛采自廣西南寧興寧區,收集受害的馬尾松主干木段,帶回實驗室隔離飼養,待成蟲羽化后,裝入塑料杯內,用新鮮馬尾松枝條飼養。以未交配的雌蟲和雄蟲為供試蟲源。

植物揮發物的收集：采用動態頂空吸附法收集受害的馬尾松側枝和嫩梢的揮發物,將兩者分別放入聚對苯二甲酸乙二酯烘烤袋(江蘇申凱包裝高新技術股份有限公司,中國)內,利用QC-1S型大氣采樣儀(北京勞動保護研究所)進行抽提,進氣口連接活性炭,出氣口連接填充了Porapark Q吸附劑(80/100目,Alltech,美國)的石英玻璃管,通過聚四氟乙烯軟管連接收集袋、活性炭、玻璃管、流量計(LZB-3WB)和大氣采樣儀,做好各部分連接的密封。先將袋內空氣抽走,泵入活性炭過濾后的凈化空氣,氣體流量為400 mL/min,密封循環采氣6 h,采集均設3個重復。采集完成后,使用正己烷(色譜純)對玻璃管內吸附的物質進行洗脫,隨后將洗脫液迅速放入冰箱-20 ℃保存。

揮發物組分測定：采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS,7890B-7000D,安捷倫科技有限公司,美國)對受害后的馬尾松揮發物洗脫液進行組分分析。氣相色譜配備HP-5毛細管柱,每次進樣量為1 μL,進樣口溫度為250 ℃,不分流模式,檢測器溫度為300 ℃,載氣為He(1 mL/min)。升溫程序設置為先以10 ℃/min的速度升溫到80 ℃,再以3 ℃/min升溫到110 ℃,然后以5 ℃/min升溫到160 ℃,保持3 min,共運行30 min。質譜儀電離方式為電子電離(EI),能量為70 eV,離子源發生器溫度250 ℃,Scan掃描模式,質量掃描范圍質荷比(m/z)為30～350。

松墨天牛對揮發物的觸角電位反應：氣相色譜-觸角電位聯用儀(GC-EAD,7890B-IDAC4,安捷倫科技有限公司,美國;Styntech公司,德國)載氣為高純度N2(1 mL/min),分流比1∶1。其余條件設置同氣相色譜-質譜聯用儀。

使用手術刀將前期飼養的天牛雌、雄成蟲各一個觸角從基部切下,切除端節的少許末梢,用導電膠(spectra 360 Electrode,德國)將觸角兩端粘到金屬電極的兩極,最后將電極插入觸角電位儀探頭處,使用氣相色譜-觸角電位聯用儀1.2.5軟件同時放大并記錄觸角電位(EAG)和氫火焰離子化檢測器(FID)信號。試驗雌雄成蟲各3頭,每個觸角測試重復3次。

數據處理：數據采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis (B.07.00)軟件,根據各色譜峰對應的質譜圖,連接由美國國家標準與技術研究院建立的NIST 17標準質譜庫,進行檢索分析各組分的質譜數據,選取質譜匹配度高的化合物,定量分析采用峰面積百分比法確定各成分的相對質量分數。通過與氣相色譜-觸角電位聯用儀、氣相色譜-質譜聯用儀峰圖上的化合物峰形和保留時間進行對比,鑒定出具有電生理反應的物質。

2 結果與分析

2.1 受害馬尾松側枝與嫩梢揮發物的成分與相對質量分數

對馬尾松揮發物采用氣相色譜-質譜聯用儀分析,其總離子流圖見圖2,具體的物質見表1。從馬尾松側枝與嫩梢中檢測出的24種化合物以萜烯類居多,共21種,其中單萜化合物有9種,倍半萜化合物有12種,還有極微量酮類和酯類。側枝與嫩梢揮發物組分不同,嫩梢中含有20種,主要有α-蒎烯(57.93%)、左旋-β-蒎烯(15.26%)、假檸檬烯(13.15%)、莰烯(3.12%)、長葉烯(2.09%)、萜品油烯(2.02%)等;側枝中含有16種,相對質量分數較高的為α-蒎烯(76.32%)、莰烯(5.03%)、右旋萜二烯(5.14%)、長葉烯(4.47%)、左旋-β-蒎烯(3.61%)等。側枝和嫩梢中含有的相同組分為α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、別羅勒烯、(+)-α-長葉蒎烯、(+)-環苜蓿烯、(+)-長葉環烯、(+)-苜蓿烯、長葉烯、β-石竹烯;不同的組分為右旋萜二烯、假檸檬烯、3-蒈烯、乙酸芳樟酯、3-乙基苯乙酮、左旋乙酸冰片酯、羅漢柏烯、(-)-α-可巴烯、β-波旁烯、β-欖香烯、β-可巴烯、大根香葉烯-D。兩個部位化合物組分的相對質量分數也不同,差別較大的物質有α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、假檸檬烯和長葉烯;嫩梢中,左旋-β-蒎烯和假檸檬烯相對質量分數較高;側枝中,α-蒎烯、右旋萜二烯和長葉烯相對質量分數較高。本次嫩梢中檢測到的揮發性組分占到總離子流的98.01%,側枝為97.61%,剩余組分為少量雜質和柱流失。

表1 受害馬尾松嫩梢與側枝的揮發物成分及其相對質量分數

續(表1)

圖2 馬尾松揮發物氣相色譜-質譜聯用儀總離子流圖

2.2 松墨天牛成蟲對受害馬尾松揮發物的GC-EAD反應

由圖3可知,利用雌、雄成蟲觸角篩選得到的活性物質是一致的。嫩梢中篩選出的有效物質有7種,分別是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、假檸檬烯、萜品油烯、長葉烯、β-石竹烯;馬尾松側枝中篩選出的有效物質有5種,分別是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、長葉烯。

A為對嫩梢的GC-EAD反應。其中,1為α-蒎烯;2為莰烯;3為左旋-β-蒎烯;6為假檸檬烯;8為萜品油烯;21為長葉烯;22為β-石竹烯;a為柱流失;♀為雌性成蟲;♂為雄性成蟲。B為對側枝的GC-EAD反應。其中,1為α-蒎烯;2為莰烯;3為左旋-β-蒎烯;5為右旋萜二烯;21為長葉烯;b為柱流失;♀為雌性成蟲;♂為雄性成蟲。

2.3 馬尾松健康與感病感蟲植株揮發物組分以及松墨天牛GC-EAD反應的比較分析

通過對比一些健康馬尾松揮發物的相關研究結果[8-12],相對質量分數較高的化合物組分中,除了假檸檬烯與右旋萜二烯,其余組分種類基本一致。目前針對松墨天牛與寄主馬尾松之間的化學通訊已有很多研究結論,松墨天牛對健康馬尾松揮發物的觸角電位反應試驗篩選得到的物質有α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、石竹烯、月桂烯、β-月桂烯、萜品油烯、長葉烯、異己烯、雪松烯、乙酸龍腦酯等[13-14]。本次GC-EAD試驗中初步篩選出的活性組分共有8種,除了右旋萜二烯,其余7種組分都存在于嫩梢的揮發物中,將篩選結果與前人研究進行對比發現,健康馬尾松與受害后馬尾松揮發物存在相同的組分,如α-蒎烯、萜品油烯、長葉烯,同時也發現,在健康馬尾松的揮發物組分中存在左旋-β-蒎烯,但相對質量分數較低,未能被篩選為活性物質,而在本試驗中,受害后馬尾松左旋-β-蒎烯相對質量分數較高,故能被篩選出來。

3 結論與討論

利用氣相色譜-質譜聯用儀對受松樹材小蠹危害后的馬尾松側枝與嫩梢中的揮發物進行檢測,共鑒定得出24種化合物,其中87.5%為萜烯類。通過與健康松樹揮發物的對比發現,相對質量分數較高的組分只有假檸檬烯與右旋萜二烯不同,推測這兩種物質或與小蠹危害有關。松墨天牛的寄主包含多種松科樹種,例如云南松(PinusyunnanensisFranch.)、黑松(PinusthunbergiiParl.)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongholicaLitv.)以及紅松(PinuskoraiensisSiebold &Zucc.)等[15-18],單萜和倍半萜類化合物常存在于這類植物的揮發物中。如云南松松針的揮發物組分有α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯、β-欖香烯、石竹烯、α-石竹烯等[15],黑松松梢的揮發物組分有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯、α-萜品油烯、異長葉烯等[18]。萜烯類化合物是植物揮發物中一類重要化合物,它使植物可與其周邊環境及生物保持互作關系,因此,松類植物揮發性的萜烯類物質在與松墨天牛的化學通信中有重要作用。

有試驗在對比了健康松梢揮發物與取食危害后揮發物的組分,以及使用標準樣品進行觸角電位(EAG)測試后得出,α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和β-月桂烯為重要的活性物質[19]。并且有研究證明,松墨天牛對寄主松樹揮發物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、月桂烯、檸檬烯、萜品油烯、β-石竹烯、β-水芹烯均可產生電生理活性[13,20-22],結合這些相關研究,本試驗中,雌成蟲與雄成蟲氣相色譜-觸角電位聯用技術(GC-EAD)所篩選的活性物質在影響天牛行為方面有不可忽視的作用。

松墨天牛對松樹揮發物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、右旋萜二烯、β-石竹烯等萜烯類物質都具有顯著的趨向性[21,23]。其中,衰弱松樹揮發物中的(+)-α-蒎烯對松墨天牛有很好的引誘效果[24]。本試驗篩選得到的活性組分中,α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯和β-石竹烯很可能會吸引松墨天牛進行取食或產卵。此外,有研究表明,月桂烯可顯著吸引松墨天牛并且促進其取食[25-26];在進行松墨天牛的田間誘捕試驗中發現,(+)-3-蒈烯可誘捕到雌雄兩性天牛[27];與松墨天牛同屬于溝脛天牛亞科的云斑天牛(BatocerahorsfieldiHope)成蟲取食定位寄主野薔薇的特異成分為3-蒈烯[23]。由于昆蟲觸角電位反應程度與揮發性化合物濃度有一定關系,雖然我們沒有篩選出月桂烯和3-蒈烯作為活性物質,但上述關于這兩種化合物組分的行為試驗證明其是有相關研究價值的,因此,對于本試驗中其他微量組分也可根據情況做進一步探究。

從種間關系的角度考慮,小蠹蟲蛀干危害影響了樹體內的物質運輸,導致樹脂分泌減少,這使得松墨天?？梢愿玫厝∈乘缮?兩物種存在一定的協作關系。松墨天牛作為松材線蟲的傳播媒介,在未達到性成熟時取食枝葉,體內攜帶的松材線蟲便有機會通過取食的傷口進入樹體危害,故本次試驗針對未交配成蟲的活性物質篩選能有效幫助誘捕成蟲,這將更有助于減少松材線蟲病的擴散發生。雖然應用氣相色譜-觸角電位聯用技術幫助篩選出了這些活性成分,但目前仍無法確定它們對于天牛是產生吸引還是趨避作用。此外,未交配的雌雄成蟲在取食寄主時是否存在差異尚未確定。因此仍需要進一步進行行為試驗,以探究這些活性物質的吸引或趨避作用,以及雌雄成蟲的取食選擇差異。

綜上所述,本次所收集并鑒定的受害馬尾松揮發性化合物中,假檸檬烯和右旋萜二烯兩種成分可能與小蠹危害有關;而α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、莰烯、右旋萜二烯和β-石竹烯則可能在吸引天牛取食或產卵方面發揮重要作用。然而,對于假檸檬烯的作用有待進一步探究。鑒于天牛在未性成熟時取食就可能導致松材線蟲病的傳播,今后的研究應集中在如何利用揮發性化合物來吸引并刺激天牛進行取食。隨后的室內行為試驗將進一步篩選有效吸引未性成熟松墨天牛的物質。