豬DAZL啟動子克隆、轉錄表達及蛋白功能特性分析

許 靜，張 霞，劉志朋，王淑燕，李洪林，李小偉，王 配*，霍金龍*

（1.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.呂梁學院生命科學系，山西 呂梁 033001）

DAZL（Deleted in Azoospermia Like，類無精癥缺失）基因在雄性生殖細胞的增殖、發育、成熟以及精子發生中發揮重要功能[1]，它是DAZ基因家族的重要成員，該家族基因編碼具有RNA結合基序和DAZ重復序列的蛋白質，且都在哺乳動物生殖細胞中特異性表達[2-3]。DAZL的表達是脊椎動物生殖細胞發育和分化的標志[4]，且在兩性配子發生中都必須[5]。DAZL幾乎在雄性動物精子發生整個過程均有表達[2]，在原始生殖細胞的發育和遷移、精原細胞分化以及減數分裂的開始和進行過程中都發揮重要作用[6]。DAZL 還是精子發生所必需的主要翻譯調節因子，可通過調節對精子發生各階段重要靶轉錄物蛋白的表達來促進精子發生[4]。DAZL的缺失或突變會使雄性動物生殖細胞逐漸喪失、聯會失敗、減數分裂停滯等[4,7-8]，從而導致不育。另外，有研究表明DAZL基因啟動子DNA甲基化模式的改變與雄性精子缺陷有關[9]。

版納微型豬近交系（Banna mini-pig inbred line,BMI）是具有高純合基因和明確遺傳背景的大型哺乳動物近交系，被廣泛應用于生物醫學研究領域[10-11]。我們先前已證明DAZL在BMI 成年豬的睪丸組織中特異性表達，并在豬睪丸細胞(ST)的細胞核中發揮重要功能[12]。本研究克隆獲得DAZL啟動子序列，獲悉其CpG 島、核心啟動子區域及轉錄因子結合位點，全轉錄組測序獲得DAZL在BMI 睪丸中的表達量，注釋DAZL基因并了解其重要功能，構建DAZL的ceRNA 轉錄調控網絡并分析其表達調控；分析各物種DAZL及其相鄰基因獲悉保守同源性，構建DAZL 的互作蛋白網絡并分析各蛋白的作用。研究結果可為深入探索DAZL在精子發生過程中的重要功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用4頭來自版納微型豬近交系昆明原種豬場的12月齡成年BMI 公豬，活體去勢取睪丸組織樣品。

1.2 DAZL啟動子克隆及分析

在NCBI 數據庫檢索豬DAZL基因5'端側翼區序列；使用Prime3 PLUS 篩選長度17～25 bp、GC 含量40%～60%、Tm值60～65 ℃、ATCG 分布均勻的一對引物（F：CCTGAGTTTCCGCACATGACAC；R：CTCCACTCACCATTACTGCGACA），由昆明擎科生物科技有限公司合成。以提取的BMI 基因組DNA為模板，PCR 擴增DAZL啟動子序列。隨后瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用TaKaRa 膠回收試劑盒回收片段并送昆明擎科生物科技有限公司測序。利用BDGP 的Neural Network Promoter Prediction（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）工具查詢DAZL基因的核心啟動子區，MethPrimer 工具（www.urogene.org/methprimer）查詢CpG 島，AliBaba2.1（generegulation.com/pub/programs/Alibaba2/index.html）工具查詢轉錄因子結合位點。

1.3 轉錄組測序及DAZL基因表達量分析

提取BMI 睪丸組織RNA 進行建庫，使用Illumina Hiseq 4000 和Illumina novaseq 6000 平臺分別進行RNA-seq和small RNA測序。利用Fastp軟件對獲得的測序數據進行質量分析，隨后采用bowtie2-2.1.0 軟件將處理后的RNA-seq 數據與豬核糖體數據庫以及豬參考基因組（Sus scrofa 11.1）比對。使用featureCounts[13]和salmon[14]計算DAZL基因的原始表達量和矯正表達量。使用bowtie2[15]軟件去除質控后small RNA 數據中的rRNA、tRNA、snRNA 和snoRNA，將剩余數據與miRBase數據庫中每一個物種的miRNA序列比對，從而得到miRNA的表達量。

1.4 DAZL轉錄調控網絡的構建

利用Uniprot 數據庫對豬DAZL進行功能注釋，使用所測RNA-seq數據分析miRNA和lncRNA的表達量，用miRanda（hhttp://www.mirbase.org）和RNAhybrid2.1.2（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）網站分析調控DAZL的miRNA 和lncRNA，使用Cytoscape 3.9.1[16]將高表達的miRNA和lncRNA可視化。

1.5 DAZL及其鄰近基因的保守同源性分析

利用MegAlign軟件對多物種DAZL氨基酸序列進行相似度分析并用R中的ggplot2包進行可視化，利用WebLoge網站分析DAZL結構域在各物種中的保守性，利用Genomicus-99.01 網站分析DAZL鄰近基因組區域的保守性及同源性。

1.6 DAZL互作蛋白分析

利用String v11.0b 進行互作蛋白分析，并用Cytoscape 3.9.1 可視化。利用R 中clusterProfiler 包將互作蛋白進行GO和KEGG富集分析，并用ggplot2包可視化。利用轉錄組測序數據分析DAZL與這些蛋白編碼基因之間的表達量相關性，并用R 中circlize 包進行結果可視化。

2 結果與分析

2.1 DAZL啟動子序列分析

以BMI 基因組DNA 為模板，PCR 擴增獲得DAZL基因5'側翼區長度為2 378 bp 的啟動子區域（圖1A）。利用MethPrimer 分析發現，在DAZL基因5'側翼區-1 932～-2 272 bp 區存在一個長度為341 bp 的CpG 島（圖1B），其GC 百分比大于50%。核心啟動子分析發現，序列中存在3 個核心啟動子（圖1C 紅色部分），其可信度分別為97%、98%和99%；轉錄因子結合位點預測結果顯示，啟動子區序列上存在Oct-1、HSE-bind、Pit-1a、GCN4、c-Rel、NF-kappa、Sp1、IRF-1、YY1和Krox-20等10種轉錄因子的潛在結合位點，其中Sp1結合位點有5個（圖1C藍色部分）。

圖1 DAZL啟動子序列克隆與分析Figure 1 Cloning and analysis of DAZL promoter sequence

2.2 DAZL基因表達

轉錄組測序結果表明，DAZL基因在BMI睪丸組織樣品中的原始平均表達量為898.67，經過進一步矯正后的平均表達量（TPM）為653.50，其轉錄本與Ensembl數據庫中的DAZL轉錄本ENSSSCT00000078185相一致，定位在豬13 號染色體。DAZL基因在4 個BMI睪丸組織樣品中均具有較高的正表達（圖2）。

圖2 DAZL所處染色體位置，轉錄組測序的外顯子、內含子豐度分析Figure 2 Chromosome location,abundance of exons and introns of DAZL based on transcriptome sequencing

2.3 DAZL功能注釋及ceRNA調控網絡

功能注釋結果發現，DAZL共參與15 個GO：其中生物學過程（Biological process）主要包括翻譯啟動的正向調控（GO:0045948-positive regulation of translational initiation）、3'-UTR 介導的mRNA 穩定（GO:0070935-3'-UTR-mediated mRNA stabilization）、生殖細胞發育（GO:0007281-germ cell development）、細胞分化（GO:0030154-cell differentiation）、翻譯調控（GO:0006417-regulation of translation）和精子發生（GO:0007283-spermatogenesis）等6 個GO；細胞組分（Cellular component）主要包括細胞質（GO:0005737-cytoplasm）、細胞核（GO:0005634-nucleus）和蛋白質復合物（GO:0032991-protein-containing complex）等3 個GO；分子功能（Molecular function）主要包括翻譯激活活動（GO:0008494-translation activator activity）、mRNA 3'-UTR 結合（GO:0003730-mRNA 3'-UTR binding）、核酸結合（GO:0003676-nucleic acid binding）、RNA 結合（GO:0003723-RNA binding）、mRNA 結合（GO:0003729-mRNA binding）、蛋白結合（GO:0005515-protein binding）等6 個GO（圖3）。

圖3 DAZL的功能注釋及ceRNA調控網絡Figure 3 Functional annotation and ceRNA regulatory network of DAZL

ceRNA調控網絡圖顯示，BMIDAZL受ssc-miR-199a-5p、ssc-miR-199b-5p、ssc-miR-17-5p、sscmiR-103、ssc-miR-24-3p 和ssc-miR-107 等6 個miRNAs 靶向調控（圖3）。其中有多個lncRNA 與DAZL競爭性結合其對應的miRNA。

2.4 DAZL 氨基酸序列相似度分析及DAZL 鄰近基因保守性分析

BMI DAZL 與其他9 個哺乳動物的氨基酸序列比對發現它們的相似度均超過90%，其中與貓（XP_006936507）、狗（XP_025304761）、驢（XP_014697651）、馬（XP_005600968）的相似度高達到97%以上（圖4A），WebLoge 圖顯示結構域RRM_DAZL 在各物種中較為保守（圖4B），說明DAZL 在各物種中具有較高的保守性和序列同源性。對各物種基因組中的DAZL相鄰基因進行同基因分析（圖4C），結果表明雖然不同物種的DAZL位于不同染色體，但是豬與其他哺乳動物都具有較高保守的相鄰基因，尤其與偶蹄目動物（山羊、綿羊、駱駝）的相鄰基因以高度保守的方式分布。

圖4 DAZL氨基酸及其鄰近基因的保守性分析Figure 4 Conservation analysis of DAZL and its neighboring genes

2.5 DAZL蛋白互作分析

蛋白互作分析顯示DAZL與多種蛋白相互作用（圖5A），互作緊密程度從高至低分別為PUM2、DAZAP2、SYCE1、SYCE2、PUM1、DDX4、NANOS3、DND1、STRA8 和PABPC1L 等。將這些蛋白進行KEGG 富集分析發現，主要參與細胞過程（cellular processes）、人類疾?。╤uman diseases）、有機系統（organismal systems）和環境信息處理（environmental information processing）等。其中包括調控干細胞多能性的信號通路（ssc04550：signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、卵母細胞減數分裂（ssc04114：oocyte meiosis）、脊髓小腦的共濟失調（ssc05017：spinocerebellar ataxia)、癌癥蛋白聚糖（ssc05205：proteoglycans in cancer）、細胞因子-細胞因子受體的相互作用（ssc04060：cytokine-cytokine receptor interaction）等通路（圖5B）；GO 富集分析發現這些蛋白主要參與有性生殖（sexual reproduction）、精子發生（spermatogenesis）、卵子發生（oogenesis）、超分子復合物（supramolecular complex）、mRNA 結合（mRNA binding）和RNA 結合（RNA binding）等條目（圖5C）。利用轉錄組測序數據分析DAZL與這些蛋白編碼基因之間的表達量相關性，結果顯示在BMI 睪丸組織中，DAZL的表達量與SOHLH1顯著相關（圖5D）。

3 討論與結論

本研究以BMI基因組DNA為模板擴增了DAZL基因5'側翼區長2 378 bp 的啟動子序列，包括3 個核心啟動子以及10 種轉錄因子結合位點。研究表明哺乳動物中大約60%的啟動子與CpG 島共定位[17]，而CpG 二核苷酸上的胞嘧啶甲基化是真核生物中必不可少的表觀遺傳修飾[18]。DAZL基因5'端上游-1 932～-2 272 bp 啟動子序列存在一個CpG島，該CpG島可能參與了DAZL的表觀調控。

轉錄組測序獲得睪丸中DAZL基因原始及矯正后的平均表達量，DAZL基因的轉錄本與Ensembl數據庫中DAZL的ENSSSCT00000078185轉錄本一致，且DAZL在BMI睪丸組織樣品中高度表達。氨基酸序列相似性分析顯示豬DAZL 與其他9個物種的相似度均大于90%，保守結構域分析發現該RRM_DAZL結構域在各物種間十分保守，說明BMI DAZL在各物種世代演化的進程中具有較高的保守性以及序列同源性。對各物種基因組中的DAZL相鄰基因分析表明，雖然不同物種的DAZL位于不同染色體，但是都具有較高保守的相鄰基因，尤其與山羊、綿羊及駱駝的相鄰基因以高度保守的方式分布。

功能注釋結果表明DAZL主要參與翻譯啟動的正向調控、蛋白結合、RNA 結合、mRNA 結合、細胞分化、翻譯調控和精子發生等。靶基因預測表明DAZL被ssc-miR-103、ssc-miR-107、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-199a-5p、ssc-miR-199b-5p 和ssc-miR-24-3p靶向調控，這些miRNAs參與了豬精子發生、結構完整性、運動性和代謝等過程[19]。其中ssc-miR-103參與豬的多種生物學過程，包括大腦發育、脂質代謝、脂肪細胞分化、造血和免疫[20]。ssc-miR-107 參與有性生殖、雄性配子生成、精子發生及GnRH、Wnt和MAPK信號通路[21]。miR-17-5p在睪丸早期精原細胞和精母細胞中表達最低，隨生殖細胞的成熟表達不斷增高，并在精子發生中起重要作用[22]。sscmiR-199a-5p 和ssc-miR-199b-5p 可影響豬的胚胎著床[23]。ssc-miR-24-3p 在豬精子和精漿中表達豐富，并在精子和精漿之間穿梭，與精子運動功能有關[24]。這6個重要的miRNAs可為深入研究DAZL在豬生殖方面的調控機制提供依據和方向。

蛋白互作網絡分析顯示DAZL與PUM2、DAZAP2、SYCE1、SYCE2、PUM1、DDX4、NANOS3、DND1、STRA8 和PABPC1L 等多個蛋白相互作用。這些蛋白幾乎都在與精子發生相關的細胞中表達，并在精子發生過程中發揮重要作用[25-34]。其中SYCE1 和SOHLH1 還與生育能力有關，其突變導致兩性或雄性不育[35-36]。轉錄組測序數據和蛋白編碼基因的表達量相關性分析表明，在BMI 睪丸組織中，DAZL的表達量與SOHLH1顯著相關，為SOHLH1和DAZL的進一步互作研究指明了方向。上述互作蛋白的GO和KEGG 富集分析發現，這些蛋白主要參與精子發生、卵子發生、有性生殖等重要生殖相關通路，為深入研究DAZL在BMI中的功能奠定了基礎。

綜上所述，本研究克隆了豬DAZL基因的啟動子序列并分析了其結構特征；獲得DAZL在睪丸組織中的表達量；注釋基因功能，并構建了ceRNA 轉錄調控網絡；比對各物種DAZL氨基酸序列及DAZL鄰近基因，解釋了其保守同源性；分析蛋白功能，并構建了蛋白互作網絡。研究結果為后期深入研究DAZL在BMI 精子發生過程中的作用機制奠定了基礎。