抗穗發芽合成小麥改良品系的篩選及遺傳分析

藏天青，劉玉娥，馬春芳，李 瀟，王希友，郝 明，張連全，袁中偉，姜 博，劉登才，甯順腙

（四川農業大學西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室/小麥研究所，成都 611130）

小麥在收獲期遭遇連陰雨或潮濕天氣時，尚未收獲的小麥成熟籽粒會在穗上發芽，這種現象被稱為穗發芽（pre-harvest sprouting，PHS）[1]。小麥穗發芽會導致小麥籽粒內部水解酶活性增加，內部儲藏物質被分解消耗，從而造成籽粒容重和千粒重下降，導致小麥減產和品質劣化[2]。近年來，全球氣候變暖和極端天氣事件頻繁發生，導致小麥成熟至收獲期間穗發芽現象日益普遍，嚴重削減了小麥產量并降低了品質，穗發芽已成為全球性的威脅[3]。中國、美國、澳大利亞、日本和加拿大等國都曾遭受過穗發芽造成的巨大損失[4-8]。

小麥穗發芽是一個復雜的數量性狀，由多個基因控制，其遺傳基礎復雜且易受環境影響，包括內因、外因和內外因互作三個方面的因素[9]。雖然，小麥的穗發芽受多重因素的影響，但是遺傳因素是導致其抗性高低的主要原因[10]。

合成小麥是人工創制的六倍體小麥，可以用來轉移四倍體或二倍體供體中優異基因的重要遺傳資源，提高普通小麥的生產能力[11-12]。利用人工合成小麥成功選育出了具有重穗、抗旱、抗凍等不同特點的多個小麥品種[13]。同時，合成小麥在小麥抗穗發芽育種中具有非常重要的價值[14-15]。因此，多年多環境條件下，篩選抗穗發芽的材料，挖掘其穗發芽抗性基因對培育抗穗發芽新品種非常重要。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

129份合成小麥改良品系及其親本（表1）。合成小麥改良品系根據它們的組合來源，分為3個群體。其中，白皮群體1含有31個品系，組合為Syn-SAU-86/Y11 (綿06-374)//B506 F10及以上世代；白皮群體2含有60個品系，組合為Syn-SAU-26/川07001//B506 F9及以上世代；紅皮群體含有38個品系，組合為Syn-SAU-23/川07005//B2SHW-L1 F9及以上世代。以上材料均保存于四川農業大學小麥所。

表1 本研究所用試驗材料的親本Table 1 Materials of parents used in this study

1.2 試驗方法

1.2.1 田間播種及管理

供試材料在溫江試驗基地（WJ）、崇州現代化農業生產基地（CZ）和四川省農業科學院新都現代農業科技創新示范園（XD），連續2年（2020—2021年和2021—2022年）種植。單行種植，行距1.8～2.0 m，行間距0.3 m，每行種植15～20株。田間管理遵循當地慣例。

1.2.2 Wheat 55K芯片及SNP標記分析

Wheat 55K基因分型由北京中玉金標記生物公司完成。原始的55K數據進行質控，首先計算樣品的Dish QC (DQC)和Call Rate (CR)值，參考基因組為IWGSC_RefSeq_v1.0，質控篩選標準為DQC≥0.82、CR≥5。使用Affymetrix (Thermo Fisher) Axiom Analysis Suite 軟件，通過apt-genotype-axiom、ps-metrics和ps-classification模塊進行基因分型分析，將otv標記進行otv-caller分析，從而得到樣品的原始數字基因型。然后，使用apt-format-result模塊獲得原始基因型數據。為了減少假陽性的發生，原始的基因型數據進一步進行數據質控，使用Plink 進行質控，參數為SNP缺失率>0.2，次等位基因頻率(MAF)≤0.05。

1.2.3 穗發芽表型的鑒定和分析

小麥穗發芽的鑒定采用室內脫粒發芽法[16-17]。在小麥蠟熟末期，每個品系取5～10 個主莖穗，常溫避光通風處理7 d。隨后進行人工脫粒，剔除受損和發育不良的種子，將脫粒后的種子于-20 ℃冷凍保存。

每個品系選取50 顆種子，3 次重復，用15%次氯酸鈉消毒種子10 min，再用無菌水清洗2 次。隨后，將種子置于鋪有濾紙的培養皿中，加入無菌水（3～5 mL）以濕潤濾紙。發芽環境溫度維持在20 ℃±1 ℃，控濕避光。加水當日記為第0 天，之后于第1、3、5和7天分別統計發芽數量。

發芽指數與發芽率計算方式：

（1）發芽率GR (germination rate)=7 d 發芽總數/用于鑒定的種子總數；

（2）發芽指數GI (germination index)=(7×n1+5×n3+3×n5+1×n7)/7×N

(n1、n3、n5、n7為第1、3、5、7 天的發芽數，N為用于發芽的種子總數)。

本研究以前人的研究[14-15,17]為基礎結合根據實際情況，將平均發芽率≤20%且發芽指數低于≤0.1的樣品定為高抗穗發芽，發芽率≤40%且發芽指數低于≤0.2 的樣品定為抗穗發芽，發芽率≤60%且發芽指數低于≤0.3 的樣品定為中抗穗發芽。發芽率和發芽指數統計使用Microsoft Excel 和Spss 16.0 軟件進行分析。相關系數(r)的解釋為：0≤|r|≤0.3 為弱相關，0.3<|r|≤0.5為低相關，0.5<|r|≤0.8為顯著相關，0.8<|r|≤1 為強相關。繪圖結果使用R 軟件(R core team 2014)、ggplot2和OrignPro。

1.2.4 群體遺傳結構分析

使用Structure v2.3.4軟件進行群體結構分析，采用一般線性模型和基于Bayes數學模型進行群劃分。設置參數：Burn-Period 長度為10 000，Burn-in 后的MCMC 重復次數為100 000。選擇Admixture Ancestry 模型和Dependent Allele Frequencies 模式。K值（群體數量）選擇，從K=1到K=10進行分析，每個K值重復運行5次。通過分析最優K值來確定最合適的分群方案，并估計群體結構，結果上傳到Structure Harvester[18]在線網站使用TASSEL 5.0 軟件分析，結果圖表繪制使用R軟件(R Core Team 2014)。

1.2.5 全基因組關聯分析和連鎖不平衡分析

基于高質量SNP標記，使用TASSEL 5.0軟件建立廣義線性模型(GLM)進行全基因組關聯分析(GWAS)，判斷SNP 標記與表型之間的關聯顯著性，并繪制Manhattan 圖和QQ Plot 圖。在GWAS 分析中，一般當P值≤0.001時，被認為該標記與性狀具有顯著關聯。在關聯結果中，標記的-log10(P)≥3 可以被視為顯著關聯的分子標記[19]。為了確定目標位點，需要選擇那些在至少2 個環境或年份都能檢測到，或者染色體上重復頻次較高且R2和P值都較高的相鄰位點作為顯著關聯的位點。

使用位點間的相關系數平方（R2）作為衡量多態性位點之間連鎖不平衡（linkage disequilibrium,LD）的參數。首先，使用Plink 軟件整理基因型格式，并利用PopLDdecay 工具進行LD 衰減的計算。對LD 衰減距離的估算有以下選擇標準：LD 系數降低到最大值的一半、LD 系數降低到0.5 以下、LD 系數降低到0.1以下，或者LD系數降低到基線水平[20]，結果使用R軟件可視化處理，繪制LD衰減圖。

1.2.6 潛在候選基因分析

通過GWAS 分析，獲得了一些可能的關聯性QTL 位點，與目標性狀存在關聯性。利用中國春參考基因組IWGSC RefSeq v1.0 以及基因組注釋文件RefSeq Annotation v1.1[21]，使用在線網站Ensembl 和JBrowse，對相關基因位點進行功能注釋和檢索，以確定可能的目標候選基因。

2 結果與分析

2.1 穗發芽表型的鑒定

合成小麥Syn-SAU-23、Syn-SAU-26、Syn-SAU-86和SHW-L1 的發芽指數分別為0.26～0.33、0.11～0.18、0.61～0.78 和0.33～0.37（表2）。其中，Syn-SAU-26 的發芽指數最低，低于0.2。這4 個合成小麥的發芽率分別為40%～53%、24%～26%、75%～90%和40%～52%（表2），其中Syn-SAU-26 的發芽率也是最低?？梢钥闯鯯yn-SAU-26在穗發芽方面具有優異的抗性，其2 個指標的平均評級為抗（GI≤0.2；GR≤40%），Syn-SAU-23 和SHW-L1 的評級為中抗（GI≤0.3；GR60%），而Syn-SAU-86的穗發芽抗性較差（圖1）。

圖1 合成小麥改良品系親本發芽情況(發芽第3天)Figure 1 Germination status of parents and their improved strains (The 3rd day of germination)

表2 親本材料發芽指數及發芽率Table 2 Germination index and germination rate of parents

品系Y11、B506、川07001 和川07005 的發芽指數分別為0.67～0.88、0.37～0.46、0.10～0.27 和0.35～0.46（表2）。四個品系的發芽率分別為93%～97%、46%～60%、30%～57%和82%～83%（表2）。其中，川07001 的2 個指標平均評級為中抗（GI≤0.3；GR≤60%），而其余品系的穗發芽抗性較差（圖1）。

合成小麥Syn-SAU-86 的改良群體1 的平均發芽指數和平均發芽率顯著高于其他2個群體，表明其對穗發芽抗性較弱（圖2）。剩下的2個群體具有好的穗發芽抗性（圖2），均表現為中等抗性水平（GI≤0.3；GR≤60%）。

圖2 多環境下發芽指數與發芽率的箱線圖Figure 2 Box line diagram of germination index and germination rate in multiple environments

成功篩選出了3 份抗穗發芽品系（圖3），分別是品系L2741、L3006和L5861。它們的發芽指數分別在0.12～0.19、0.09～0.19 和0.1～0.21 之間，相應的發芽率范圍為36%～43%、23%～45%和24%～52%（表3）。3 份品系在多個環境中指標平均值達到抗穗發芽的水平（GI≤0.2；GR≤40%）。品系L2741 和L3006 的抗性基因推測來源于親本Syn-SAU-23 或B2SHW-L1，而L5861 的抗性基因推測來源于Syn-SAU-26或川07001。

圖3 抗穗發芽品系及部分親本發芽情況 (發芽第3天)Figure 3 Strains with PHS resistance and partial parents (The 3rd day of germination)

表3 不同環境下抗穗發芽品系的發芽指數(GI)和發芽率(GR)Table 3 GI and GR of improved strains with PHS resistance in multiple environments

2.2 SNP標記的多樣性及群體結構分析

從49 063 個55K 分子標記中共篩選出26 955個高質量的標記。其中，A基因組上有7 974個SNP標記，B 基因組上有11 185 個標記，D 基因組上有7 015個標記。進一步分析，SNP標記在第3同源群上分布最多，共計4 423 個，而第2 同源群上的分布最少，共計3 113個。另外，4B染色體上的SNP標記最多，共計2 277 個，而6A 染色體上的SNP 標記最少為647個（表4）。

表4 SNP標記等位變異在基因組的分布情況Table 4 Distribution of SNP marker allelic variation in the genome

群體結構分析，當K=3時，ΔK出現峰值（圖4），K=3 是最優的群體數目。改良品系分為3 個亞群（圖4），符合預期結果。

圖4 抗穗發芽品系群體結構分析Figure 4 Population structure analysis of strains with PHS resistance

2.3 群體的全基因組關聯分析

在6個環境中，有2個環境檢測到顯著性位點，分別是2021年新都位于2B、5D、7D染色體上，2022年崇州位于2B、4A、5D、6B染色體上（圖5）。結合2個環境的數據，分析了2B及5D上的顯著性位，發現有2 個顯著標記在2 個環境均能檢測到，分別是位于5D染色體的AX-111317347標記和AX-109336147標記，可以解釋19.69%和20.05%的表型。而位于2B染色體AX-111492645 標記（2022年崇州），該點的P值最高且R2值也比較高，故也視為顯著性位點。

圖5 不同環境的曼哈頓圖及QQ-Plot圖Figure 5 Manhattan diagram and QQ-Plot diagram in multiple environments

根據全基因組連鎖不平衡（LD）系數衰減至基線水平作為判定標準，可以確定連鎖不平衡（LD）衰減距離為0.78 Mb（紅色虛線交會處）（圖6）?；谠撍p距離，將在物理圖譜前后0.78 Mb 區間內的位點視為候選位點。

圖6 連鎖不平衡(LD)衰減圖Figure 6 Linkage disequilibrium (LD) decay diagram

2.4 合成小麥改良品系穗發芽候選基因功能預測

根據LD衰減距離0.78 Mb，挖掘了3個標記上下游各0.78 Mb內的基因，總共有46個基因（附表），通過對連鎖范圍內的基因進行基因注釋，其中有4個基因初步推測與穗發芽有關作為可能的候選基因（表5）。

表5 根據注釋確定的候選基因Table 5 Candidate genes identified based on annotations

3 討論與結論

3.1 抗穗發芽合成小麥改良品系篩選

普通小麥的六倍化起源過程中，僅有少數的原始六倍體個體參與馴化，因此供體物種四倍體小麥和節節麥的大量遺傳變異被排斥在外[26-27]，進而導致原始普通小麥的遺傳多樣性低。作為重要遺傳資源的合成小麥可以轉移四倍體或二倍體供體中優異基因，提高普通小麥的生產能力[11-12]。目前，通過改良人工合成小麥的方式已經成功選育出多個優良的小麥品種[13]。同時，合成小麥在小麥抗穗發芽育種中具有非常重要的價值[14-15]。

本研究使用了129 份合成小麥改良品系，在連續6 個環境(2年3 點)下測定了脫粒種子的發芽率，從而對穗發芽抗性進行了評價和鑒定。共獲得了3份穗發芽抗性穩定的品系，分別為紅皮品系L2741 和L3006，以及白皮品系L5861（圖3）。這些品系的發芽指數分別為0.12～0.19、0.09～0.19和0.1～0.21，發芽率分別為36%～43%、23%～45%和24%～52%（表3），均達到了抗穗發芽的水平(GI≤0.2；GR≤40%)。這3份抗穗發芽品系可在培育抗穗發芽新品種選育中利用。

3.2 穗發芽相關候選基因的功能預測

本研究利用多年多點的全基因組關聯分析，共檢測到了99個顯著關聯的SNP位點，初步將這些關聯位點定位在2B和5D染色體上。為了確定與穗發芽抗性相關的基因，基于普通小麥基因數據庫IWGSC RefSeq v1.0，采用連鎖不平衡的衰減距離0.78 Mb 的標準，在目標位點上下游各0.78 Mb 范圍內進行基因的篩選和注釋。從46個基因中，初步確定了4 個潛在的候選基因。TraesCS2B03G086530 0.1是一個編碼F-box家族蛋白的基因。F-box蛋白參與植物的多個生命過程，例如光合作用中光信號的傳導、植物激素的信號轉導以及花器官的發育[28]。賈琪等[22]在對F-box蛋白家族在抗逆作用中的研究中發現，F-box 蛋白通過介導抗逆相關蛋白的泛素化調控植物對逆境的應答。在逆境條件下，負調控蛋白被泛素化降解，導致正調控蛋白表達增加，從而啟動抗逆反應，其通常會影響脫落酸（ABA）和乙烯等植物激素的信號轉導。脫落酸不僅抑制小麥種子的發芽，還通過抑制α-淀粉酶的活性來抑制小麥發芽，從而實現抗穗發芽的效果[29]。TraesCS5D03 G1120100.1為植物的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)。LOX 是植物十八碳酸代謝的關鍵酶，與種子老化、抗逆境脅迫等生理生化有關[23]。研究表明，水稻中LOX活性的下調可以提高種子的發芽效率[30]。LOX可以催化種子萌發過程中貯藏物質的降解，并合成傳遞生物和非生物脅迫的信號分子。TraesCS5D03 G1120600.1屬于Squamosapromoter-binding-likeprotein(SPL)基因家族，在植物的形態建成中起著重要作用[31]。高新梅等[24]發現該基因在小麥中可能參與光形態建成、葉片生長、胚乳和分生組織的表達、赤霉素、脫落酸等激素信號轉導途徑中，作為干旱和逆境應激信號的順式作用元件起作用。赤霉素和脫落酸在調控籽粒萌發過程中相互拮抗，種子打破休眠時，通常伴隨著脫落酸的下降和赤霉的上升[32-33]。TraesCS5D03G1160900.1是與抗逆性相關的DUF4220基因。通過將DUF4220基因在擬南芥中參與了脫落酸信號途徑，在高溫（45 ℃）處理下，轉基因種子的發芽率明顯低于對照，表明過量表達該基因可能會降低植株的抗逆性[25]。這4個潛在的候選基因是與小麥穗發芽抗性相關的重要位點，有待進一步驗證。