酶抑制法檢測有機磷農藥殘留研究

張挺

（廣州城市職業學院，廣東 廣州 510405）

近年來，食品安全問題已經嚴重威脅著人類的健康，而果蔬中由于過量使用或濫用農藥而導致的農藥殘留及其急慢性中毒已經引起了社會的高度重視。目前，我國常用的有機磷，氨基甲酸酯類農藥如甲胺磷、對硫磷、馬拉硫磷、樂果等幾十種高毒農藥占總農藥用量的70%以上。對農藥殘留的檢測方法主要有色譜分析法[1-3]、酶免疫技術[4、5]、生物技術、酶抑制法[6-8]、毛細管區帶電泳等方法，但傳統方法費時、繁瑣、成本高。本文研究的酶制劑抑制法是一種簡便、靈敏、快速、成本低廉的檢測方法，特別適合現場檢測及大批量樣品的篩選，尤其適合集體食堂和賓館、飯店等采購員使用，保證蔬菜食用的安全性。

一、研究方法

（一）實驗材料與儀器

1.實驗材料

（1）試劑

鹽酸、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、碘化硫代乙酰膽堿、5,5`-二硫雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)均為分析純試劑。

丙酮色譜純試劑；無水硫酸鈉；磷酸鹽緩沖溶液（15.0 g 磷酸氫二鉀與1.59 g 無水磷酸二氫鉀500 mL 蒸餾水溶解）；甲胺磷、毒死蜱均購于國家農藥質檢中心；農藥速測卡，廣州天河綠洲生物化學研究中心；農藥標準溶液：有機磷農藥標準品和丙酮配制成儲備液（1000 μg/mL），置于冰箱中；農藥標準使用液：水稀釋農藥標準溶液使濃度分別為1、3、5μg/mL 的使用液，體積1000 mL。

（2）食品材料

烏魚、黃鱔、草魚、塘鲺和豆角購于華南農業大學三角市菜市場，底物和顯色劑由華南農業大學食品質量與安全實驗室提供。

2.實驗儀器

6890GC氣相色譜儀，美國Aglient公司；HR2838/39搗碎機，PHLIPS 家用電器公司；752 型紫外光柵分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TDL-5 型低速臺式大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；LGJ-10N 冷凍干燥機，北京亞星儀科科技有限公司。

（二）檢測方法

1.膽堿酯酶制劑的制備及保藏

試驗配制0.2 mol/L 的三羥甲基氨基甲烷溶液和0.1mol/L 鹽酸溶液，分裝于棕色瓶中。用時再將兩者按一定比例配成pH 為8.2 的緩沖液作為膽堿酯酶的提取液。

將魚背肉洗凈，取背肉，稱量，置于搗碎機中并加一定量的4℃的提取液，搗成勻漿。將勻漿置于離心機中，4000 r/min 離心10 min，取上清液即膽堿酯酶提取液，于冷凍干燥機冷凍干燥成粉，平均分裝到6 至8 個離心管中，用錫紙包裹，避光分別放置于-18℃、4℃、干燥器中室溫下保藏。

2.底物和顯色劑的保藏

將底物溶液和顯色劑溶液避光存放并分別置于4℃、干燥器中室溫下保藏，通過酶與底物和顯色劑的反應，于420 nm 波長下測定其吸光值，根據吸光值的變化反映底物和顯色劑的穩定性。

3.酶制劑活力的測定

往裝有膽堿酯酶酶粉的離心管中加入4 mL 蒸餾水，取酶液50μL，用2.8 mL Tris-HCl 緩沖液稀釋后，加入25μL 75 mmol/L 的碘化硫代乙酰膽堿溶液，然后再加入25μL 20 mmol/L 5,5`-二硫雙(2-硝基苯甲酸) 溶液，記錄時間，在420 nm 波長下測定吸光值。每隔10 d 測一次不同保藏條件下的酶活力，每個樣品測五次，取其平均值。酶活力以膽堿酯酶與底物和顯色劑反應5 min 時420 nm 波長下的OD.值表示，酶活力下降百分率公示為：

4.酶制劑測定豆角中有機磷農藥

試驗稱取150.00 g 豆角三份，分別放入體積為1000mL 濃度為1、3、5 μg/mL 的甲胺磷（毒死蜱同）水溶液中，浸泡1 h，撈出瀝干，裝入保鮮袋中冰箱儲存備用。稱取預處理豆角樣品可食用部分2.00 g，切碎置于小燒杯中，加5 mL 水，浸泡2 min，洗脫液即樣液置于燒杯中備用。吸取樣液2 mL，加入酶制劑試管中，再加2 mL 蒸餾水，搖勻；加底物，振搖2 min；加顯色劑，搖勻，靜置5 min；于420 nm 波長下測讀反應液在5、8、10 min 的OD.值，并計算抑制率[9、10]。

空白樣的測定，取出一根酶管，加入4 mL 蒸餾水，搖勻，加入底物，振搖2 min，再加入顯色劑，搖勻，放置5 min，于420 nm 波長測定反應液在5min、8min、10min 的吸光度。

5.氣相色譜法檢測豆角樣品中有機磷農藥

樣液制備與 “4.酶制劑測定豆角中有機磷農藥” 方法相同，測定方法參照文獻[11]。色譜柱：DB-1701 14%-氰丙基苯-86%二甲基硅氧烷共聚物型毛細管柱；長度：30 m；內徑：0.32 mm；膜厚：0.25μm；載氣：N2；進樣口溫度：250℃；進樣方式：脈沖不分流進樣，60 mL/min，0.75 min；進樣方式：自動；進樣體積：1μL；檢測器：FPD；溫度：250℃；尾吹氣：60 mL/min；空氣流量：110 mL/min；氫氣流量：150 mL/min；爐初始溫度：100℃；初始時間：0 min；升溫速率：20 ℃/ min；最后溫度：230 ℃；保留時間：3 min，即100℃～230 ℃（20℃/ min，保留3 min）。

根據儀器靈敏度配制一系列不同濃度的農藥標準溶液。將各濃度的農藥標準溶液2μL～5μL分別注入氣相色譜儀中，測得不同濃度有機磷農藥標準溶液的峰面積，繪制有機磷農藥標準曲線。同時取樣品溶液2μL～5μL 。分別注入氣相色譜儀中，由測得的峰面積從標準曲線上算出相應的農藥含量。

6.酶制劑定性檢測有機磷農藥

測定甲胺磷溶液濃度分別為0.165、0.385、0.540、0.780、2.015、3.015 mg/kg，和毒死蜱溶液濃度分別為0.100、0.140、0.365、0.405、0.585 mg/kg；將上述不同濃度的農藥溶液分別加入酶管中，搖勻；加底物，振搖2 min；加顯色劑，搖勻，放置；觀察在3 min、5 min、8 min 的顏色變化。與空白實驗管對照，反應液顏色為黃綠色或黃色，說明酶被有機磷農藥抑制，判斷為陽性(+)；反應液顏色為紫紅色或淺紫紅色，說明酶未被有機磷農藥抑制，判斷為陰性(-)。

7.農藥速測卡檢測有機磷農藥

取3 片農藥速測卡，把制備好的樣液滴到白色藥片上，靜置10 min；將速測卡對折，使紅色藥片與白色藥片疊合發生反應[12]，捏3 min；與空白實驗對照[13]，酶被有機磷農藥抑制 (白色藥片不變色或略有淺藍色) 為陽性(+)，未抑制(白色藥片變為天藍色或與空白對照相同)為陰性(-)。

二、結果與分析

（一）保藏過程中膽堿酯酶的活性變化

制備獲得4 種魚的膽堿酯酶，測定其活力，在0 min～7 min 反應的活性的高低順序為：烏魚的膽堿酯酶＞草魚的膽堿酯酶＞塘鲺的膽堿酯酶＞黃鱔的膽堿酯酶，其中烏魚的膽堿酯酶和黃鱔的膽堿酯酶與底物和顯色劑反應5 min 后趨于平緩（圖1），酶活性無多大變化。

圖1 凍干前4 種魚的膽堿酯酶的活性變化

4 種魚的膽堿酯酶活力在-18℃下保藏20 d，活力在一定程度上有所增加（圖2），之后活力下降，至保藏的40 d，活力下降幅度在6.23%～31.34%之間（見表1），其中以黃鱔的膽堿酯酶酶活力下降幅度最低其次是烏魚，但是烏魚的膽堿酯酶酶活力較高。

表1 4 種魚的膽堿酯酶酶活性在保藏中的下降百分比

圖2 膽堿酯酶酶制劑于-18℃下保藏過程中活力變化

在不同保藏條件下，對比了黃鱔的膽堿酯酶活力變化，實驗表明冷藏和冷凍保藏對酶活力影響較小。冷藏和冷凍保藏條件下，前20 d 內隨著保藏時間的延長，膽堿酯酶酶活力的保持較好，且活力測定值比之前高；20 d 之后酶活力逐漸緩慢下降。在室溫和干燥器中保藏，前20 d 保藏于干燥器中的膽堿酯酶酶活力變化比室溫下保藏的酶活力略高(見表2)。

表2 保存于不同條件下黃鱔膽堿酯酶酶活力的OD.值變化

（二）底物和顯色劑保存的穩定性

底物和顯色劑于4℃、干燥器和室溫下保藏40 d，三種保藏條件下的底物和顯色劑的穩定性都有所降低，表現為所測得的膽堿酯酶酶活力不斷下降。其中，保藏于4℃下的底物和顯色劑的測定酶活力降低15.60%，穩定性最好；干燥器中和室溫下保藏下酶活力分別降低25.31%和28.40%（見表3）。

表3 不同保藏條件下底物和顯色劑與酶反應的OD.值變化

（三）酶制劑法檢測有機磷農藥的準確性

通過對比表4 中對浸泡豆角的農藥殘留酶抑制法分析和表5 中對純農藥的酶抑制法分析的吸光值和抑制率，1μg/mL 甲胺磷浸泡的豆角樣品檢測的抑制率下降率為11.40%，1μg/mL 毒死蜱浸泡的豆角樣品檢測的抑制率下降率為15.58%，表明同一農藥同一濃度的吸光值隨時間延長而增大（抑制率減?。?；甲胺磷檢測的抑制率下降率為4.50%～11.40%，毒死蜱檢測的抑制率下降率為8.70%～15.58%，表明同一農藥不同濃度的吸光值隨濃度增大而減?。ㄒ种坡试龃螅?。通過酶抑制法和氣相色譜法測定樣品中殘留農藥的吸光值和抑制率，酶抑制法測定有機磷農藥其分析檢測結果與國家標準法測定結果相接近，酶抑制法測定農藥殘留有較高的準確度。

表4 用提純酶液測定豆角樣品中殘留農藥的吸光值和抑制率

表5 提純酶液測定豆角樣品實際所含純農藥的吸光值和抑制率

（四）酶抑制法定性檢查分析

通過酶制劑定性檢測有機磷農藥和農藥速測卡檢測有機磷農藥的實驗方法對檢測結果進行判斷，結果顯示（如表6 所示），本實驗檢測的靈敏度根據農藥種類的不同而不同，實驗中甲胺磷的檢出限為0.10 mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.20 mg/kg，范圍一般在0.08mg/kg～0.20 mg/kg 之間。而速測卡的檢測靈敏度要比酶抑制法的靈敏度低（見表7），甲胺磷的檢出限為0.40mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.40 mg/kg，范圍在0.10mg/kg～10 mg/kg 之間。實驗表明酶抑制法比速測卡法對有機磷農藥殘留檢測靈敏度高，更為準確。

表6 氣相色譜法檢測豆角中農藥殘留結果

表7 酶抑制法和速測卡法靈敏度檢測對比（顯色判斷）

三、結論

本文通過對烏魚、草魚、塘鲺和黃鱔4 種魚肉提取的膽堿酯酶在不同保藏條件下的活力分析，表明該酶制劑在4℃以下冷藏或凍藏其活力保存較穩定，保藏20 d 內酶活力略有升高，保藏30 d 活力下降為6.23%～31.34%；底物和顯色劑在4 ℃下保藏對酶抑制法檢測結果影響較小。本文中膽堿酯酶抑制法，其檢測農殘濃度的準確度比氣相色譜法測定準確度稍低，對甲胺磷和毒死蜱的檢出限分別為0.10 mg/kg 和0.20 mg/kg，對豆角樣品農殘濃度測定值的絕對誤差值在0～0.029 mg/kg，相對誤差值在0～17.6%，同種農藥抑制率下降值的絕對誤差值非常接近，差值僅為0.5%～1.0%；酶抑制法對實驗樣品的農殘檢出限為0.2 mg/kg，實驗中農藥速測卡對甲胺磷和毒死蜱的檢出限均為0.40 mg/kg，酶抑制法檢測限低，且較為穩定和準確。綜上，本文研究的膽堿酯酶抑制法測定有機磷農藥殘留對實際樣品大量篩查檢測具有一定借鑒作用。