一種用于過氧亞硝酸根檢測的近紅外比率熒光探針的研制

韓志湘, 代曉婷, 熊 杰

(江蘇大學 環境與安全工程學院, 江蘇 鎮江 212013)

過氧亞硝酸根(ONOO-)是由一氧化氮自由基(NO·)與超氧陰離子自由基(·O2-)反應生成的一種重要活性氧(ROS).由于其非凡的氧化能力和強大的親核特性,ONOO-可直接與富電子部分發生反應,進而破壞包括DNA、脂質和蛋白質在內的多種生物分子.研究[1]發現,ONOO-的硝化活性可通過硝化酪氨酸以及免疫原性應答刺激細胞之間信號進行轉導.由于ONOO-的生物半衰期非常短,導致其穩態濃度較低,并無法使其在生物體內直接分離和檢測,這就對ONOO-熒光探針的研發提出了更高要求[2].因此研發性能優異的熒光探針,用以檢測生物體內ONOO-的產生、分布及濃度變化對深入理解ONOO-的分子作用機制具有重要意義.

近年來,科研人員利用ONOO-的強氧化性研發了一系列基于氧化酮類化合物[3-4]、硼酸或硼酸酯化合物[5-8]、硫族(硫、硒、碲等)化合物[9-11]、N-苯丙氨酸[12-14]等機理的熒光探針.但是這部分探針仍存在選擇性差、靈敏度低、響應時間長等缺點.同時,僅依靠熒光強度變化的OFF-ON型探針,易受儀器參數、探針分子周圍微環境、探針分子局部濃度、光漂白、激發光強度、溫度等因素的影響,從而干擾了檢測結果[15-16].相比之下,比率熒光探針可同時調節2個發射信號,具有自我校準的功能,可以極大地消除上述干擾,并獲得更為精確的結果[17].而較大的發射位移有利于提高信噪比,具有更高的靈敏度.基于熒光共振能量轉移(FRET)的探針需要2種熒光團,它們可以顯示出合適的發射位移(100～200 nm),但其合成比較復雜[18-19]. 因此,開發合成簡單、大發射位移、可用于過氧亞硝酸根準確檢測的比率熒光探針仍然具有挑戰性.

為此,筆者擬設計一種基于半花菁的近紅外比率熒光探針分子Cy-P,并將其用于ONOO-的近紅外比率檢測,同時與其他各種可能干擾的生物分析物相對比,研究該探針對ONOO-的識別特點.

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

氯化亞錫購自上海泰坦科技有限公司.DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、脂多糖(LPS)購自合肥博美生物有限公司.其他所有化學藥品均為市售分析純試劑,無需進一步純化即可直接使用.層析柱所用硅膠(100～200目)購自上海泰坦科技有限公司.硅膠板購自山東煙臺江友硅膠開發有限公司.整個試驗所需用水均由優普超純水器(UPH-111-10T)制得.

核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)分別在400 MHz和100 MHz的Varian INOVA-400光譜儀上獲得.高分辨率質譜(HRMS)在Bruker Daltonics Autoflex II MALDI-TOF MS光譜儀上測定.所有的熒光分析試驗均在Thermo Scientific Lumina 熒光分光光度計上進行.使用瑞士Mettler Toledo Five Easy Plus FE28型精密pH計進行溶液的pH值測定.HeLa細胞或RAW 264.7細胞通過FBS質量分數為10%的完全培養基進行傳代培養.采用Synergy H5酶標儀進行探針細胞毒性測量.

1.2 近紅外比率熒光探針分子Cy-P的合成

圖1為探針分子Cy-P的合成路線示意圖.

圖1 探針分子Cy-P的合成路線示意圖

氮氣保護下,將溶解于4.0 mL濃鹽酸中的氯化亞錫(3.80 g,20.0 mmol)溶液加入化合物1(0.75 g,0.9 mmol)的甲醇溶液中,加熱至70 ℃,并攪拌過夜.冷卻后,用飽和NaHCO3溶液中和,抽濾并用CH2Cl2溶液洗滌.將收集的濾液和洗滌液用水洗滌3次,使用無水Na2SO4進行干燥.減壓旋除溶劑,殘余物以V(CH2Cl2)/V(CH3OH)=50 ∶3的溶液作為洗脫劑,在硅膠柱上進行柱層析,得到0.45 g深藍色固體產物Cy-P,產率為88%.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：1.36 (t, 3H,J=6.8 Hz) , 1.83 (m, 2H), 1.98 (s, 6H), 2.71～2.70 (m, 4H), 4.41(q, 2H,J=6.4, 6.8 Hz), 6.32 (d, 1H,J=14.4 Hz), 6.73～6.76 (m, 2H), 7.40 (d, 1H,J=8.4 Hz), 7.55 (t, 1H,J=7.6 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.70 (t, 1H,J=7.2 Hz), 7.82 (d, 1H,J=8.8 Hz), 8.09～8.15 (m, 2H), 8.25 (d, 1H,J=8.4 Hz), 8.56 (d, 1H,J=14.4 Hz).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：12.890, 20.717, 24.191, 27.835, 28.433, 52.388, 97.973, 100.137, 112.099, 113.241, 114.281, 114.873, 122.507, 123.048, 125.615, 127.872, 128.359, 130.181, 130.482, 131.047, 132.065, 134.187, 138.274, 139.656, 141.721, 155.211, 156.036, 162.554, 175.176.HRMS(C31H31N2O+)m/z的計算值為 447.243 1, 測定值為447.241 8.

1.3 測量過程

稱取一定質量的探針分子Cy-P,溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,得到濃度為1 mmol/L的探針儲備液.將20 μL的探針分子Cy-P儲備液加入磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)中,再加入一定體積的ONOO-儲備液,用磷酸鹽緩沖液定容至2 mL,得到含有濃度為10 μmol/L的熒光探針Cy-P溶液和濃度為0～15 μmol/L的ONOO-混合待測溶液.所有的光譜測試均在磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)中進行.在波長為380 nm和680 nm激發光的激發下測量熒光發射光譜,發射波長分別為400～550 nm和710～800 nm,激發狹縫和發射狹縫均設置為10 nm.

使用超純水配制K+、Ca2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)、HS-、 HSO3-、H2O2、ClO-、·OH和ONOO-的儲備溶液.將分析物樣品添加到含有10 μmol/L探針Cy-P的PBS溶液中,通過熒光光譜進行檢測.

1.4 細胞試驗

HeLa細胞和RAW264.7細胞在添加有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基(37 ℃,5%CO2)中進行培養.然后將細胞轉移到35 mm細胞培養皿上,放置24 h,使其貼壁.外源性和內源性ONOO-的熒光成像試驗分別以HeLa細胞和RAW264.7細胞為研究對象.將所有細胞在37 ℃下孵育,并在熒光成像前用PBS溶液洗滌3次.所有圖像均通過激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS SP5)獲得.

2 結果與討論

2.1 設計與合成

由于花菁染料熒光量子產率高,摩爾吸光系數大,且吸收和發射波長相對較長,因而被廣泛用于熒光探針分子的設計[20].筆者通過還原硝基取代的花菁染料得到氨基取代的新型近紅外熒光探針分子Cy-P,并通過對其1H NMR、13C NMR和HRMS進行表征而得到確認.該方法合成步驟簡便,收率高.

2.2 光譜性質

研究了在PBS溶液中隨著ONOO-濃度c(ONOO-)的增加,濃度為10 μmol/L的探針分子Cy-P的熒光光譜變化情況如圖2所示,其中F為熒光強度,λ為波長.

圖2 與不同濃度ONOO-作用后的Cy-P熒光光譜

由圖2可知：探針Cy-P自身在發射波長為726 nm(激發光波長λex=680 nm)處顯示熒光發射峰;加入ONOO-后,在726 nm處的發射峰強度逐漸減小,在458 nm(λex=360 nm)處出現的新熒光發射峰強度逐漸增加.這表明加入ONOO-后,探針分子自身的共軛結構遭到了破壞,生成了新的物質.在濃度為0～15 μmol/L的ONOO-作用下,在458 nm和726 nm處熒光強度比值F458/F726從1.37增加至19.81,增加了13.46倍,熒光最大發射波長移動了268 nm.此外,在0～15 μmol/L的ONOO-濃度范圍內可獲得極好的線性關系,如圖3所示,計算出的檢測下限為13 nmol/L.這些結果表明,該探針具有良好的靈敏度和定量檢測ONOO-濃度的功能.

圖3 Cy-P在458 nm和726 nm處熒光強度比值與ONOO-濃度的線性關系

2.3 選擇性試驗

為了評估探針分子Cy-P對ONOO-的選擇性,測試了Cy-P對各種潛在干擾分析物的響應性能,這些干擾分析物包括陽離子、陰離子、活性氧(ROS)和活性硫(RSS).研究了濃度為10 μmol/L的熒光探針對濃度為40 μmol/L干擾物的熒光響應情況.圖4為360 nm和680 nm激發光激發下,在458 nm和726 nm處熒光強度比值F458/F726的對比,圖中橫坐標數值1-16分別代表探針Cy-P、K+、Ca2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、GSH、Hcy、Cys、HS-、HSO3-、H2O2、ClO-、·OH和ONOO-,其中ONOO-濃度為10 μmol/L,其他分析物濃度為40 μmol/L.

圖4 ONOO-及干擾分析物熒光強度比值的對比

由圖4可知,相同的條件下,只有ONOO-會引起熒光強度比值F458/F726的顯著增加,Cys、ClO-和HSO3-僅僅引起了溶液產生較小的熒光強度比值增加.由此可知,Cy-P對ONOO-具有優異的選擇性,這使其能夠在復雜的生物系統中檢測到ONOO-.

2.4 pH的影響

考慮到pH對探針性能及后續生物體內的分析檢測應用有重要影響,研究不同pH條件下,濃度皆為10 μmol/L的探針分子Cy-P與ONOO-反應前后熒光強度比值的變化,結果見圖5.由圖5可知：探針自身在pH=2～12時沒有熒光;將ONOO-添加到Cy-P溶液中后,pH=7～12時觀察到探針Cy-P在波長458 nm和726 nm處熒光強度的比值F458/F726顯著增加,這個pH范圍涵蓋了細胞內生理溶液的pH.可見,該探針適用于細胞內ONOO-的檢測.

圖5 未含和含有ONOO-時Cy-P的熒光強度比值隨pH變化的曲線

2.5 響應時間的影響

監測了加入濃度為10 μmol/L的ONOO-后,濃度為10 μmol/L的Cy-P熒光強度比值F458/F726隨反應時間t變化的情況(見圖6).由圖6可知,反應16 min后熒光強度比值達到最大值,且基本保持穩定.因而,探針Cy-P可用于ONOO-的快速檢測,且該特性有利于探針Cy-P在活細胞內的應用.

圖6 與ONOO-溶液作用后Cy-P熒光強度比值隨反應時間變化的曲線

2.6 反應機理

圖7 Cy-P和ONOO-的可能反應機理示意圖

2.7 細胞內熒光成像

鑒于采用探針Cy-P檢測ONOO-的方法具有信噪比高、響應速度快、選擇性強和能夠在生理條件下響應等優點,將探針Cy-P進一步應用于細胞中內源性和外源性ONOO-的可視化檢測.在熒光成像之前,通過常規MTT測定法評估了活細胞中Cy-P的細胞毒性.圖8為濃度為0～20 μmol/L的Cy-P與HeLa細胞、RAW264.7細胞培養12 h后的細胞存活率k的情況.圖9為不同培養時間下,濃度為10 μmol/L的Cy-P與HeLa細胞、RAW264.7細胞作用后細胞存活率k的情況.由圖8和圖9可知：細胞在探針分子Cy-P溶液中培養12 h后,仍可保持大于 80%的細胞存活率;在10 μmol/L探針溶液中培養48 h后,細胞存活率也大于 80%.可見,Cy-P在HeLa細胞和RAW264.7細胞中細胞毒性較小,因而適用于活細胞內的熒光成像.

圖8 Cy-P與HeLa細胞、RAW264.7細胞作用后細胞存活率隨ONOO-濃度變化的情況

圖9 Cy-P與HeLa細胞、RAW264.7細胞作用后細胞存活率隨時間變化的情況

圖10 Cy-P在HeLa細胞中檢測ONOO-的熒光圖像

進一步評估探針Cy-P用于內源性ONOO-檢測的可行性.已知RAW264.7細胞可通過LPS刺激產生更高濃度的內源性ONOO-.采用Cy-P檢測RAW 264.7細胞中內源性ONOO-的熒光圖像如圖11所示.

圖11 采用Cy-P檢測RAW264.7細胞中內源性ONOO-的熒光圖像

圖11d、h為紅色通道和藍色通道疊加圖像.紅色通道中,λex=680 nm,λem=690～850 nm;藍色通道中,λex=360 nm,λem=370～670 nm.圖11a-d為RAW264.7細胞與Cy-P(10 μmol/L)培養30 min的熒光圖像;圖11e-h為LPS(1 μg/mL)刺激RAW264.7細胞12 h,然后與Cy-P(10 μmol/L)培養30 min的熒光圖像;圖11i為量化每組圖像藍色通道與紅色通道的平均熒光強度比值隨處理方式不同而變化的情況.

由圖11可知：當僅用Cy-P處理細胞時,紅色通道中熒光較強,而藍色通道中的熒光幾乎觀察不到;與LPS(1 μg/mL)培養12 h,然后用Cy-P處理的細胞在藍色通道中熒光顯著增強,而在紅色通道中的熒光有所降低.可見,Cy-P適合用于檢測活細胞中內源性ONOO-.

3 結 論

1) 設計并合成的基于半花菁的近紅外比率熒光探針分子Cy-P結構簡單,可以通過簡單的合成方法獲得.探針分子Cy-P對ONOO-的光譜響應性能良好,并且觀察到熒光最大發射波長藍移了268 nm,這有利于提高信噪比.

2) ONOO-的濃度為0～15 μmol/L時,探針Cy-P在458 nm和726 nm處熒光強度的比值F458/F726與ONOO-的濃度有很好的線性關系,檢測下限為13 nmol/L.

3) 探針在生理條件下對ONOO-具有特異性識別能力,而對常見陽離子、陰離子、ROS和RSS幾乎沒有熒光響應.探針對ONOO-的響應速度快,響應的pH范圍寬.

4)Cy-P具有較小細胞毒性,適用于活細胞中外源性和內源性ONOO-比率可視化熒光成像檢測.