盤錦地區中華絨螯蟹養殖及越冬期間的“牛奶病”發病特點調查

劉芳　劉乃更　楊占全　梁芳　邢冬飛　李讓　耿丹　孫娜

摘 要：近幾年遼寧盤錦地區河蟹“牛奶病”暴發，給養殖戶造成較大的經濟損失。為了調查“牛奶病”的發病特點及規律，2022年7～9月份對盤錦地區的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）稻田養殖過程進行了“牛奶病”的監測與調查。2022年12月及2023年2月對不同扣蟹越冬暫養密度、不同越冬模式的扣蟹“牛奶病”發病情況進行了調查。結果顯示，在稻田養殖階段9月份為主要的發病時間，且成蟹養殖階段的發病率高于扣蟹養殖階段，扣蟹越冬暫養期間暫養密度越大，“牛奶病”患病率越高。越冬前挑選雌雄的過程會增加“牛奶病”患病率。該研究為中華絨螯蟹養殖及越冬暫養期間的“牛奶病”預防和控制提供數據支持。

關鍵詞：中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）；扣蟹養殖；成蟹養殖；扣蟹越冬；二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）

中圖分類號：S945.6文獻標志碼：A

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）又稱河蟹，是中國重要的淡水養殖經濟品種之一[1]，廣泛分布于湖泊、水庫，深受廣大消費者喜愛。2020年的《中國漁業統計年鑒》顯示，中華絨螯蟹在國內養殖產量達77.5萬t[2]。目前，遼寧省盤錦市已成為中華絨螯蟹重要的養殖中心，養殖面積11.3萬hm2，產品產值40億元。 2019年，其成蟹和幼蟹產量分別為5.2萬t和2.55萬t，分別占中國總產量的6.7%和37.5%。中華絨螯蟹牛奶病是近幾年在中國北方地區河蟹養殖時暴發的病害，患病蟹檢查發現肝胰腺和血淋巴已病變成乳白色，逐漸活力減弱不能攝食，最終死亡，給蟹苗養殖戶造成嚴重的經濟損失[3]。馬紅麗、孫娜等對病蟹進行了組織病理學檢查、病原分離、鑒定，以及人工回感試驗，證實遼寧地區中華絨螯蟹的“牛奶病”是由二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）感染所致[4]， 2021年Bao等的研究也證明了河蟹“牛奶病”是由二尖梅奇酵母感染引起的[5]。目前盤錦地區的“牛奶病”感染率逐年上升，嚴重威脅著河蟹產業的發展[6-7]。孫娜等[3]研究表明，冬季越冬期是河蟹牛奶病的高發期，為了找到越冬期間河蟹的發病特點以及與其相關的因素，2022年對盤錦地區的扣蟹及成蟹養殖過程進行了牛奶病的監測與調查，特別是對不同暫養密度、不同越冬模式的扣蟹發病情況進行了調查，旨在為扣蟹稻田養殖及越冬期間的牛奶病預防和控制提供依據。

1 材料方法

1.1 牛奶病調查與樣品采集

2022年7月至2023年2月，在遼寧盤錦稻田河蟹養殖及越冬期間進行調查，采樣地點分布在盤錦的王家、壩墻子、新興、新開、甜水、胡家、唐家、東風、西安、清水10個鄉鎮（見圖1），主要調查內容為不同養殖階段、不同冬儲模式中華絨螯蟹的“牛奶病”發病特征、發病時間和發病率等情況。

1.2? 中華絨螯蟹牛奶病調查內容

1.2.1 扣蟹養殖階段牛奶病調查

于2022年7月至2023年2月進行扣蟹的稻田養殖及越冬期間暫養扣蟹的牛奶病取樣調查。取樣地點為盤錦市王家鎮等10個鄉鎮的稻田養蟹區與越冬池，取樣地點見圖1。通過對采集的扣蟹進行“二尖梅奇酵母”涂板檢測，統計不同月份各取樣地點扣蟹牛奶病患病情況。

1.2.2 成蟹養殖階段牛奶病調查

于2022年7月至9月進行成蟹稻田養殖期間牛奶病取樣調查。取樣地點為盤錦市王家鎮等10個鄉鎮的成蟹稻田養殖區。通過對采集成蟹進行二尖梅奇酵母的培養檢測，統計出不同月份各取樣地點成蟹牛奶病患病情況。

1.2.3 扣蟹冬季不同暫養密度及不同越冬模式調查

為了調查越冬暫養密度對扣蟹牛奶病的影響，于2023年2月份對5個不同暫養密度的15戶養殖戶扣蟹越冬暫養情況進行了采樣調查。通過對不同暫養密度的扣蟹采集進行牛奶病檢測，統計出不同密度暫養的扣蟹牛奶病患病情況。由于雌蟹價格高于雄蟹，為了提高冬季暫養的效益，盤錦地區大部分扣蟹越冬農戶在越冬前會進行雌雄挑選，選擇雌蟹越冬暫養。為了調查挑選操作是否會對“牛奶病”發病產生影響，于2023年2月份對盤錦6個地區進行了挑選與未挑選兩種方式的越冬扣蟹患牛奶病情況的調查。通過對越冬前挑選與未挑選的暫養扣蟹取樣進行“牛奶病”檢測，統計出暫養前挑選對扣蟹越冬牛奶病患病的影響。

1.3 病原檢測及鑒定方法

1.3.1 檢測方法

將取回的蟹樣本在無菌條件下解剖，無菌操作下取肝胰腺接種于孟加拉紅培養基 27℃培養 48hrs后，平板上生長出均一菌落，顯微鏡下表現為酵母形態。

1.3.2 鑒定方法

二尖梅奇酵母鑒定所用特異性引物F： 5’-AGCCTGGTCTTTGTAATG-3’；R： 5’-ACTCCCTTGTTGGTGATA-3’。試劑盒的 PCR反應條件為：預變性94℃，10mins；變性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；終延伸72℃，10mins；其中，變性、退火和延伸為35個循環。待PCR反應結束后，取5μL PCR產物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析。目的片段大小460bp。

2 結果

2.1 患病癥狀

牛奶病患病情況分為兩種，嚴重有明顯病癥的扣蟹運動能力下降，對刺激的反應較弱，殼色變為淡黃色（如圖2a）。打開明顯病癥蟹頭胸甲，患病蟹體內蓄積大量牛奶狀液體（如圖3c），無菌操作分別下取肝胰腺接種于孟加拉紅培養基 28℃培養 48hrs后，平板上生長出均一菌落（如圖4） ，進一步進行分子生物學鑒定。提取肝胰腺 DNA，進行聚合酶鏈式反應（PCR） 鑒定，在 460bp處顯示為目標條帶清晰可見（如圖5）。也定義為患病蟹。

2.2 扣蟹養殖階段牛奶病調查結果

夏季稻田養殖扣蟹的牛奶病情況如表1所示，整體感染率很低，7～9月份的三次取樣的扣蟹感染率分別是0%、0%、18%。7月份和8月份取樣扣蟹的10鄉鎮均未檢測到病原菌。9月份10個鄉鎮中，只有王家鎮1個稻田發現2只扣蟹感染。

越冬期間池塘扣蟹牛奶病情況如表2所示，整體感染率增加。10個越冬池均有受到感染的扣蟹，感染率最低為4%，最高為40%，12月份扣蟹平均總感染率為13.67%，2023年2月份扣蟹平均總感染率為18.33%，感染率隨著越冬時間的延長有升高的趨勢。

2.3 成蟹養殖階段牛奶病調查結果

夏季稻田養殖成蟹的牛奶病情況如表3所示，夏季7月、8月、9月的三次取樣的成蟹感染率分別為0.51%、0.68%、5.56%。7月份只有甜水鎮一個稻田發現3只成蟹患病，8月份新興鎮一個稻田發現2只成蟹患病，胡家一個稻田發現2只成蟹患病，9月份取樣時，王家鎮和壩墻子鎮的感染率最高，分別為16.13%和10.23%，9月份取樣患病戶數與患病率均高于7月份和8月份。

2.4 冬季不同暫養密度及不同越冬模式調查

對不同越冬暫養密度的扣蟹患牛奶病情況進行了養殖回訪調查，結果如表4所示，發現養殖密度在240kg/畝～260kg/畝時牛奶病患病率最低，平均為7.81%，在養殖密度在1200kg/畝～1300kg/畝時，牛奶病患病率最高，平均患病67.20%，牛奶病患病率與越冬密度呈正相關。

對越冬前挑選與未挑選兩種方式的越冬扣蟹患牛奶病情況的調查結果如圖5所示，挑選過后的扣蟹患牛奶病率平均為37.21% 未經過挑選扣蟹牛奶病患病率平均為14.71% 。

3 討論

調查研究表明，室外稻田夏季高溫情況下，牛奶病患病率低于越冬期間，這可能是由于夏季6-9月份是河蟹重要的生長期，水體中含有豐富的浮游植物和底棲動物，河蟹通過攝食大量天然餌料，不斷吸收營養積累能量，此階段河蟹的免疫力增強，不易患病，而冬季越冬期河蟹不攝食，免疫力低下，且越冬暫養階段密度大，更加導致牛奶病傳播速度加快。根據朱必陸等[8]多年實踐檢驗表明如果扣蟹在冬季得到較好的培育，來年蛻第一殼、第二殼成活率和增重率都較好，養殖大規格的河蟹比率大，增值效益也較明顯。所以怎樣降低越冬暫養扣蟹的患病率是對來年稻田養殖成蟹養殖效益非常關鍵的。

該研究中成蟹在夏季患病率高于扣蟹，同樣，LU C C等人[9]研究表明，二尖梅奇酵母在羅氏沼蝦中的流行率在成年對蝦中最高（73%），其次是幼蝦（25%）和后期幼體（2%），并且在幼體中沒有發現酵母感染。CHEN S C等[10]認為，雖然成年個體的免疫系統比幼年個體強健，但體型大的個體由于活動力強、生長期長，更容易接觸到水體和沉積物中的病原體，這可能是成蟹的牛奶病患病率高于扣蟹的原因。

養殖密度是影響水生動物健康生長和養殖利潤的最直接因素，該研究中越冬暫養扣蟹密度越大牛奶病的患病率越高。JUAN P Apún-Molina等人[11]，WU J L等人 [12]也發現高密度的暫養可能是疾病快速傳播的原因。 LIU Gang等人表明[13]，高密度培養的南美白對蝦對哈維氏弧菌的抗性力顯著下降。 同樣LIN Yongchin等人（2015年）[14]結果表明，在高密度下養殖的蝦中溶藻弧菌的生化活性和清除效率顯著降低。閻儉等[15]針對扣蟹的越冬與管理進行論述，扣蟹越冬的密度，應根據越冬池的條件而定。如果池塘底質較好，補水方便，可畝放 450kg～500kg，有經驗儲戶可增加到800kg。而該研究回訪了解到盤錦越冬池塘的扣蟹密度為250kg/畝～1250kg/畝，高密度的扣蟹越冬暫養也是導致牛奶病患病率高的重要原因。過高的密度會增加水產動物的對空間和食物競爭，導致生長緩慢，存活率降低[16]，水質惡化，細菌滋生[17]。此外，高密度養殖還會引起水產動物擁擠脅迫，導致免疫應激和氧化損傷[18]。我們之前未發表的研究發現，同類相食會導致健康螃蟹感染。因此，我們提出在高密度培養下，河蟹會通過自相殘殺，同類相食和其他接觸增加了感染風險造成交叉感染。因此，越冬期間避免扣蟹之間的感染傳播是至關重要的。

由于雌蟹價格高于雄蟹，為了提高冬季暫養的效益，大部分扣蟹越冬農戶在越冬前會進行雌雄挑選，選擇雌蟹越冬暫養。該研究表明，經過挑選后的扣蟹患牛奶病率（37.2%）高于未挑選的扣蟹牛奶病率（14.7%），可能是由于挑選環節對扣蟹損傷危害，引起了應激反應，造成扣蟹免疫力降低與交叉感染。Vermeersch等[19] 研究表明，經過捕獲、分揀和運輸過程中對褐蝦的翻滾、堆疊會導致蝦的重要器官損傷或丟失，并出現很高的死亡率（32.8%～69.8%）。因此，在越冬存儲扣蟹前應減少挑選雌雄環節，減輕河蟹的應激反應，降低因挑選導致的扣蟹應激創傷增加的感染牛奶病情況。

4 改進越冬模式的建議

選擇越冬暫養的扣蟹在秋季起捕前一個月開始強化營養，投喂玉米、高粱、雜魚等，以增加扣蟹體內的脂肪積累，使扣蟹體內存儲足夠的能量，提升免疫力?？坌吩谌朐蕉厍耙獜氐浊逄?，避免混有養殖生物的天敵和殘留的致病菌危害扣蟹安全越冬。選擇暫養扣蟹前應該進行牛奶病檢測抽檢，選擇病原較少的扣蟹進行越冬，盡量不要對扣蟹進行雌雄篩選，降低因挑選引起的扣蟹“牛奶病”的交叉感染。越冬暫養應控制密度，越冬密度建議不超過750kg/畝。

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A survey on the characteristics of ‘milk disease’ in Eriocheir sinensis farming and overwintering in Panjin region

LIU Fang， LIU Naigeng， YANG Zhanquan， LIANG Fang， XING Dongfei， LI Rang， GENG Dan， SUN Na

（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）

Abstract：In recent years， the outbreak of? “milk disease”? in Eriocheir sinensis in Panjin， Liaoning Province， has caused large economic losses to farmers. In order to investigate the characteristics and pattern of “milk disease”， the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in July-September 2022 on the paddy culture process of Eriocheir sinensis in Panjin area， and the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in December 2022 and February 2023 on different snap crabs with different overwintering densities and different overwintering modes. In December 2022 and February 2023， we investigated the incidence of “milk disease” in snap crabs with different overwintering densities and different overwintering patterns. The results showed that September was the main time for the onset of the disease in the paddy field culture stage， and the incidence rate was higher in the adult crab culture stage than in the snap Eriocheir sinensis culture stage， and the higher the stocking density of snap crabs during the over-wintering period， the higher the prevalence of "milk disease". The prevalence of "milk sickness" increased with higher density during the over-wintering of button crabs. This study provides data support for the prevention and control of milk sickness during Eriocheir sinensis culture and overwintering.

Keywords：Eriocheir sinensis; juvenile crab culture; adult crab culture; juvenile crab overwintering; Metschnikowia bicuspidate

文章編號：1674-2419（2023）06-0409-07

基金項目：遼寧省科學技術基金項目（編號：2022-PJLH-01）；2021年遼寧省“揭榜掛帥”科技攻關項目（2021JH1/10400040）。

作者簡介：劉芳（1993.5-），女，遼寧盤錦人，盤錦光合蟹業有限公司研發中心工程師。主要從事水產養殖中水質調控工作。E-mail：910288277@qq.com。

通訊作者：孫娜（1983.9-），女，山東濱州人，盤錦光合蟹業有限公司研發中心主任、高級工程師。主要從事水產苗種育苗中的水質與藻類調控工作。E-mail：sunna0911@163.com。