基于核苷酸序列的羅非魚羅湖病毒分子流行病學分析

劉助紅　張璜　唐玲　劉賢旭　林潔文　吳林

摘 要：通過對NCBI數據庫里的羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）核苷酸序列進行生物信息學分析，了解羅湖病毒在全球的流行情況和中國羅非魚（tilapia）養殖中羅湖病毒的感染情況。該研究將第3個片段的序列比對結果中的羅湖病毒分成12個簇群，通過對片段進行motif序列富集，顯示motif序列每個位點的堿基。對從廣東各地區羅非魚養殖場采集到的302份樣本進行檢測，結果顯示，均未檢測出羅湖病毒陽性，并且顯示motif序列位點的堿基非常穩定。通過對羅湖病毒進行分子流行病學分析，中國雖未有羅湖病毒流行的趨勢，但在進出口貿易中仍要嚴格防控羅湖病毒的輸入，并應對這些非常保守的motif的相關功能進行深入研究。

關鍵詞：羅非魚（tilapia）；羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）；分子流行病學

中圖分類號：S965.125文獻標志碼：A

羅非魚（tilapia）因價格實惠、富含蛋白質、抗病能力強和耐高密度養殖而成為世界上主要養殖魚類[1-2]。中國是世界上最大的羅非魚養殖國，已先后從國外引入多個羅非魚品種，年產量超過160萬t，羅非魚的養殖一般是采用土塘等養殖模式，伴隨著高密度和不可控的養殖條件，導致羅非魚養殖過程中各種疾病不斷出現[3-4]。近年來，羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）的出現給羅非魚的養殖造成了極大的威脅[5]。早在2009年，以色列就報道了養殖羅非魚的大量死亡的現象，隨后在厄瓜多爾、埃及、馬來西亞、哥倫比亞、泰國、印度等國家以及中國臺灣地區相繼發現有TiLV感染的情況[6-12]。但直到2014年，羅湖病毒才被正式鑒定新的羅湖病毒科[13]。羅湖病毒目前基本形成了以菲律賓、印度、泰國及以色列等4個國家為中心的流行圈，調查顯示中國的羅湖病毒顯示來自厄瓜多爾。同時，不同地區的序列間堿基存在一定的突變，但從氨基酸水平來看，絕大部分的突變是無益突變。羅湖病毒為單鏈RNA病毒，其基因組含有10個片段，除了第1片段跟其他病毒有弱同源性外，其他9個均找不到同源序列[2]。據報道，它可以感染所有生長階段的羅非魚[14]。2017年5月，世界動物衛生組織（OIE）、亞太地區水產養殖中心網（NACA）、聯合國糧農組織（FAO）等國際組織均針對TiLV發布公告或預警，要求所有成員國在羅非魚的養殖和進出口過程中加強檢疫和防范[15-16]。目前，關于羅湖病毒的來源和傳播途徑還沒有一個確切的結論，Dominique等人分析了2017年導致孟加拉國羅湖魚大量死亡的羅湖病毒疑似來源于與泰國羅非魚孵化場頻繁的進出口貿易[17]。文章通過對全球已有羅湖病毒的保守核苷酸序列進行系統發育樹的分析和對廣東省羅非魚養殖相關養殖場的羅非病毒樣本進行分子檢測，從分子水平分析羅湖病毒在全球范圍的流行和進化情況，為羅湖病毒在中國的防控提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據前期序列分析，選取羅湖病毒的保守序列第3個片段序列（GenBank：KJ605629）進行生物學信息分析，從GenBank數據庫中下載與第3個片段序列的相關序列共93條。具體序列的相關信息見表1。另外，從廣東省各地區羅非魚養殖場采集了302份相關的樣本用于感染情況分析，具體的樣本信息見表2。

1.2 試驗方法

用生物信息學軟件DNASTAR對上述序列及其編碼的蛋白質進行同源性比較和分析，采用MEGA 4.0進行遺傳進化樹繪制、堿基和氨基酸殘基突變位點統計，對序列進行選擇壓力和保守位點的分析。另外，采用“SC/T 7024-2021 羅非魚湖病毒病監測技術規范”推薦的檢測步驟對采集的樣本進行處理和實時熒光RT-PCR檢測，以便具體分析羅湖病毒在廣東省的實際感染情況。

2 結果與分析

2.1 羅湖病毒的分布情況

根據數據庫比對，發現第三個核酸片段在數據庫中沒有任何同源序列，該序列編碼的蛋白功能目前還未了解清楚，序列統計結果如表1所示。由于羅湖病毒最早發生在以色列，對其研究也較多，故從該國分離鑒定上傳的序列是最多的，達到了近30%，其次為印度和泰國。泰國自發現以來，每年都有羅湖病毒被從不同地區分離鑒定。隨著羅湖病毒的流行，數據庫顯示全球總共有14個國家先后發現了羅湖病毒的存在，并且病毒的分布呈現區域化的趨勢，尤其是在東南亞區域（圖1）。中國雖然羅非魚養殖面積大，但目前還沒有發現該病大規模的流行，深圳海關和廈門海關在中國進出口的羅非魚及相關產品中均未檢出羅湖病毒。

2.2 系統進化分析

2.2.1 系統發育樹分析

基于羅湖病毒的第3個核苷酸片段序列采用最小快速進化法構建系統發育樹得到圖2所示的結果，發現可以將已鑒定的毒株歸類為12個簇群：（1）2018年從越南分離到的羅湖病毒株ON376584（2018）為單獨進化的毒株（Group 1），該毒株與其他毒株親緣關系較遠。泰國鑒定的KY381578（2016）及MN687697（2014）雖然與其他毒株有共同的進化祖先，但在后期的演化中也分別單獨進化成了一個簇群（Group 7和8）。（2）2019年從菲律賓發現的兩個LC504279（2019）OK274115（2019）成為一個簇群（Group 2）。（3）2019年從菲律賓分離的另外兩個毒株OK274114（2019）、OK274113（2019）自成一個簇群（Group 3）。（4）菲律賓剩下的3個毒株OK274111（2018）、OK274112（2019）、OK274110（2020）與埃及的2個KY817384（2015）、KY817385（2015）成為一個簇群（Group 4）。（5）泰國不同年份分離的11個毒株與越南2020年鑒定的毒株ON376574（2020）成為一個簇群（Group 5）。（6）哥倫比亞唯一毒株OL539823（2018）、印度的MK752932（2019）、MN094791（2019）、馬來西亞MN970195（2019）和泰國的OL539818（2018）成為一個簇群（Group 6）。（7）以色列2018年鑒定的毒株與印度尼西亞、泰國、孟加拉國及美國鑒定的共25個毒株成為一個簇群（Group 9）。（8）印度鑒定的12個毒株成為一個簇群（Group 10）。（9）中國、厄瓜多爾、印度、以色列、馬來西亞、秘魯等組成一個簇群（Group 11）。（10）泰國鑒定的其他12個毒株成為一個簇群（Group 12）。從分布的國家來看，印度和泰國的毒株型是最多的，都達到3種。這兩個國家也是羅湖病毒疾病大量流行的國家。以色列雖然也是大面積爆發羅湖病毒疾病的國家，但毒株比較單一，病毒變異較小。從每個簇群所分布的國家來看，第11個簇群的羅湖病毒類型分布最為廣泛，在全球六個國家均有涉及，其次是第6個簇群，分別分布在全球四個國家。在進化程度上，中國的毒株與厄瓜多爾和秘魯等國家的毒株有較近的親緣關系，系統發育樹顯示中國的毒株是從厄瓜多爾的毒株進化而來，這與中國在水產行業上與這些國家有較多的貿易關系是分不開的。另外，要特別留意的是越南新出現的毒株，它與以往的毒株在進化上沒有相互關系，極有可能是通過病毒重組或變異形成的新的毒株，目前，關于它的毒力和傳染性等情況都沒有太多的研究。

2.2.2 羅湖病毒在全球的流行分析

從系統發育樹來看，羅湖病毒雖然最早在以色列被報道，但從分子進化水平上來看，它不是最早出現的。羅湖病毒最開始起源于菲律賓，因此，以發育樹的結點作為地理位置的代表國家，可繪制如下羅湖病毒在全球的傳播路徑圖（圖3）。傳播網絡顯示，羅湖病毒目前基本形成了以菲律賓、印度、泰國及以色列等4個國家為中心的流行圈，從這些國家向外圍擴散，中國發現的羅湖病毒顯示來自厄瓜多爾。

2.2.3 堿基突變分析

對該序列中所有的堿基突變進行統計，結果如

圖4所示，A、C、G、T四種堿基的突變率為31%、40%、29%、32%。在所有的突變中，大部分為C與T之間的突變，其次為G與C之間的突變。堿基的突變往往帶來的是蛋白質氨基酸的改變，從而改變蛋白質的結構，進而改變病毒的致病力或者傳播能力。

2.3 氨基酸序列分析

羅湖病毒的第三個片段編碼的蛋白質在病毒增殖的過程中發揮的作用目前尚不清楚，該片段共編碼420個氨基酸，通過對從各地分離毒株的該片段編碼的氨基酸序列進行比較，發現各國毒株的該氨基酸序列非常保守（圖5），相似性最低也達96.9%，這可能與該蛋白自身的功能有非常重要的關系。因此，從氨基酸水平分析已有毒株的進化程度是分不開的。

2.4 基因序列的保守位點分析

應用在線軟件https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html對該基因片段的motif序列進行查找富集，獲得如下結果（圖6），在找到的5個motif序列中，每個位點的堿基基本上都是非常穩定的。然而，關于這些motif序列的功能在數據庫中尚未發現。

2.5 羅湖病毒檢測結果

通過對廣東各地區采集的302份羅湖病毒樣本進行檢測，發現羅湖病毒的檢測結果均為陰性，進一步說明羅湖病毒在中國尚未造成大面積的流行，與前期的分子流行病學分析結果是一致的，這與中國出入境管理部門在進出口中的對羅湖病毒的嚴格管理和檢疫是分不開的。

3 討論

根據全球已有的羅湖病毒的報道，目前羅湖病毒主要在印度、泰國、以色列等國家流行，病毒的流行往往具有區域性，同時會隨著進出口貿易等在不同國家之間流行，羅湖病毒從2009年發現至今，已經過了十余年的進化和重組，每個地區的病毒株已經呈現出明顯的分子水平差異，重組往往會產生新的毒株。羅湖病毒雖然不會對人類的健康造成威脅，但是所造成的羅非魚的死亡嚴重影響了人類的食品安全和健康。對于水產動物類的大部分病毒，都沒有合適的藥物可以治療，因此，如何預防成為控制羅湖病毒肆意傳播的關鍵。

Chaput等人分析了羅湖病毒BD-2017毒株的10個片段的保守性，發現片段8、9、10是變異最小的，但是這三個片段的長度均在500bp以下，不利于系統進化樹的構建和流行性分析[17]。在Chaput關于羅湖病毒的分析中，作者只分析了孟加拉國、泰國、秘魯、厄瓜多爾及以色列7個毒株的親緣關系，通過系統進化樹分析得知孟加拉國的毒株可能來自泰國，南美洲的毒株和以色列的成為一個簇群，作者推測是由于孟加拉國在2012至2017年期間頻繁從泰國的孵化場進口魚苗導致的，這與文章分析的結果也是一致的。但是，文章采取全球廣泛使用的羅湖病毒第3個片段進行分析，在數據庫里關于羅湖病毒的信息也是最全面的，分別對全球14個國家或地區的93個羅湖病毒進行分析，這對于從全球水平分析羅湖病毒的流行情況更加準確和具有代表性。

對于功能性分析來說，氨基酸序列的比對比核苷酸的序列比對更加可靠，因為某個氨基酸的改變或替換對蛋白質的結構和功能有著重要的影響，但是，羅湖病毒的第三個片段的氨基酸序列比對卻顯示，氨基酸的序列非常保守，說明大部分的堿基突變是無義突變。無義突變增加表明生物選擇壓力增大，但是突變本身并不會改變翻譯蛋白質的氨基酸序列。非同義突變則表明蛋白質氨基酸序列會發生改變，病毒可能獲得新的抗原特征從而造成暴發流行。通過數據庫比對，該氨基酸序列未發現與其他病毒的氨基酸序列有相似性，因此，關于該蛋白的功能需要進一步的研究。

目前，針對羅湖病毒的不同核苷酸片段已經建立了PCR、LAMP等很多方法，為羅湖病毒的鑒定奠定了技術基礎，中國也針對羅湖病毒建立了分子生物學檢測方法[18-20]。盡管通過某個單一的保守核苷酸片段對羅湖病毒開展分子流行病學分析，并以此推斷其起源及地理流行傳播情況不一定十分準確，但大范圍的分子流行病學分析仍能為病毒的預防控制提供了很好的依據。

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Molecular epidemiological analysis of tilapia lake virus based on nucleotide sequence

LIU Zhuhong1， ZHANG Huang2， TANG Ling1， LIU Xianxu1， LIN Jiewen1， WU Lin1

（1.Guangdong Polytechnic of Science and Trade， Guangzhou 510430， Guangdong China; 2.Guangzhou Double Helix Gene Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510430， Guangdong China）

Abstract：In this paper， the nucleotide sequence of tilapia lake virus（TiLV） in NCBI database was analyzed by bioinformatics to understand the global epidemic of tilapia lake virus and the infection status in tilapia aquaculture in China. According to the sequence of the third segment alignment results， tilapia lake virus searched so far in NCBI database could be divided into 12 groups. The tilapia lake virus had basically formed an epidemic circle centered around four countries， including the Philippines， India， Thailand， and Israel， while the tilapia lake virus in China shows that it comes from Ecuador. There were some base mutations between sequences in different regions of the third segment， but from the amino acid level， most of the mutations were non-sense mutations. Through motif sequence enrichment on the sequence， it was found that the bases at each site of the motif sequence were also very stable. However， the related functions of these highly conserved motifs need to be studied. The 302 clinical samples collected from various regions in Guangdong were tested and none of them detected positive for tilapia lake virus. Through molecular epidemiology analysis of tilapia lake virus， although there is no epidemic trend of tilapia lake virus in China， we should strictly prevent and control the import of tilapia lake virus in our import and export trade.

Keywords：tilapia; tilapia lake virus（TiLV）; molecular epidemiology

基金項目：廣東省青年創新人才項目（2018GkQNCX069）；清遠市科技計劃項目（220804107510735）；廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室開放基金（PBEA202009）

作者簡介：劉助紅（1985-），男，漢族，碩士研究生，副教授。研究方向：水生動物疫病研究，E-mail：290415174@qq.com。