雞circSFMBT2 克隆及對DF-1 細胞增殖的影響

焦振海，王府建，張 麗，李 國，賓乘鋒，張為露，郭東雪，王曉彤，林樹帶

(廣東海洋大學 濱海農業學院，廣東 湛江 524088)

環狀RNA(circRNA)是一種共價閉合環狀內源性RNA，廣泛存在于真核生物中[1]。由于反向剪接效率不高，因此表達水平較低[2]。然而一旦形成circRNA 就穩定存在，并且具有高度保守性[3]。與線性RNA 相比，circRNA 不含5′帽子和3′尾巴，半衰期更長，不易被RNase R 降解[4]。此外，circRNA 還具有組織、時間和疾病表達特異性等特點[5-6]。近年來的研究發現，circRNA 具有多種生物學功能，主要包括調控基因轉錄，充當miRNA 海綿，與蛋白質結合參與調控和編碼蛋白質等生物學功能[7-8]。研究發現，circRNA 在肌肉發育過程中發揮作用，如circFUT10 可作為miR-133a 的海綿，在牛原代成肌細胞增殖分化中發揮功能[9]，而circZNF609 存在開放閱讀框，并能翻譯成多肽發揮促進成肌細胞增殖的作用[10]。

SFMBT2(Scm-like with four MBT domains 2)是多梳基因，可以編碼具有MBT 結構域的染色質調節蛋白，在多種基因的遺傳調控中發揮作用[11-12]。雞SFMBT2基因定位于1 號染色體，含有21 個外顯子。廣東海洋大學家禽育種團隊的高通量測序(BioProject 登錄號：PRJNA554754)發現SFMBT2存在環狀轉錄本，本研究通過PCR 和測序技術手段驗證circSFMBT2 的環狀結構，分析其結構特征和表達規律，并在DF-1 細胞中初步研究其對細胞增殖的影響，以期為后續深入分析circSFMBT2在雞骨骼肌發育過程中的作用及機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麒麟雞種蛋采購于廣東省高州市萬農種雞場。DF-1 細胞系由華南農業大學家禽遺傳育種團隊贈送。RNA 抽提試劑盒、RNA 反轉錄試劑盒、無內毒素質粒抽提試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；熒光定量PCR 酶、大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α 感受態細胞購自北京全式金公司；環狀RNA 過表達載體pCD2.1-ciR 購自吉賽生物科技有限公司；KpnI、BamH I 購自TAKARA公司；DMEM 高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與細胞培養 將麒麟雞種蛋放在37 ℃、濕度為70%的自動孵化箱中孵化，分別采集14 胚齡、16 胚齡、18 胚齡以及1～6 周齡麒麟雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌等組織，液氮速凍后迅速保存于-80 ℃冰箱中，用于組織表達規律和時序表達規律分析。

DF-1 是可以無限增殖的成纖維狀細胞系，在完全培養基(DMEM 高糖+體積分數為10%的胎牛血清+體積分數為1%的雙抗)37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。

1.2.2 引物設計與circSFMBT2 驗證 針對circSFMBT2 的成環位置，在接頭兩端設計特異性引物circSFMBT2-D，用于circSFMBT2 環分子的驗證，設計全長擴增引物circSFMBT2-full，用于克隆circSFMBT2 的全長序列，內參基因選用GAPDH。引物通過primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計。為驗證circSFMBT2的連接位置，使用RNase R 外切酶在37 ℃條件下處理RNA 樣品30 min，反轉錄成cDNA，分別使用circSFMBT2-D 和circSFMBT2-full 引物進行PCR 擴增，將擴增產物送生工生物技術有限公司測序。引物信息見表1。

表1 引物序列及用途Table 1 Sequences and uses of primers

1.2.3 組織和細胞RNA 提取及qPCR 試驗 組織和細胞總RNA 的提取方法參考HiPureUnivesal RNA Mini Kit 試劑盒說明書。依據PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒說明書，使用隨機引物(N9)和Oligo-d(T)18將總RNA 反轉錄為cDNA，反應程序為25 ℃，10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，30 s。以反轉錄生成的cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR，PCR 反應體系：cDNA 模板1 μL、上、下游引物各0.4 μL、2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、雙蒸水8.2 μL。PCR 反應條件為94 ℃，3 min；94 ℃，15 s，60 ℃，15 s，72 ℃，20 s，40 個循環。溶解曲線程序為95 ℃，15 s；60 ℃ 1 min；9 5 ℃，1 s。以GAPDH作為內參基因，檢測circSFMBT2 的表達。

1.2.4 雞circSFMBT2 過表達載體構建 根據circRNA 的測序數據，通過PCR 擴增circSFMBT2的全長序列，并在其兩端加上保護序列和酶切位點，使用KpnI 和BamH I 酶切PCR 擴增產物和pCD2.1-ciR 載體，酶切產物純化后利用T4DNA 酶連接，16 ℃過夜。取連接產物轉化至大腸埃希菌感受態細胞中，轉化完成后涂板，37 ℃恒溫培養14～16 h，挑取單克隆菌落，陽性鑒定后送測序，選取測序結果與circSFMBT2 基因序列吻合的單克隆菌液留用。

1.2.5 細胞轉染試驗 將DF-1 細胞系接種于12 孔板，使用DMEM 完全培養基培養細胞至匯合度達80%時，使用脂質體轉染試劑Lipofectamine@3000 轉染空載體pCD2.1-ciR 和過表達載體pCD2.1-circSFMBT2，轉染48 h 后收獲細胞。

1.2.6 Edu 和CCK-8 檢測細胞增殖 轉染空載體pCD2.1-ciR 和過表達載體pCD2.1-circSFMBT2 至48 h，參考Edu 試劑盒說明書對細胞進行孵育、固定、通透、染色等處理，最后在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

CCK-8 試驗：將細胞接種于96 孔板，轉染空載體pCD2.1-ciR 和過表達載體pCD2.1-circSFMBT2，分別在0、12、24、36、48 和60 h 使用CCK-8 試劑37 ℃孵育2 h 后，檢測細胞的D450nm。

1.2.7 生物信息學分析 利用RNAhybird 網站在線預測circSFMBT2 中潛在的miRNA 結合位點，使用SnapGene 軟件預測circSFMBT2 編碼蛋白質的能力。

1.2.8 統計學分析 Edu 試驗與基因定量檢測中每個分組包含4 個重復，CCK-8 試驗中每組包含8 個重復，使用GraphPad Prism9 軟件進行統計學分析，采用t檢驗分析數據。CircSFMBT2 時序表達規律和組織表達規律數據采用LSD 多重比較進行分析。

2 結果與分析

2.1 雞circSFMBT2 成環驗證

根據華南農業大學家禽遺傳育種與繁殖實驗室前期高通量測序結果，發現雞SFMBT2基因可能產生一個環狀轉錄本，為此，本研究首先對circSFMBT2 連接成環位置設計發散引物，以1 周齡麒麟雞肝臟組織RNA 反轉錄的cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 電泳結果產生了預期目的條帶(圖1A)，測序結果顯示，circSFMBT2連接成環的片段來源于SFMBT2基因外顯子12 和外顯子18(圖1B、1C)。

圖1 雞circSFMBT2 成環驗證Fig.1 Validation of the junction of chicken circSFMBT2

線性RNA 在RNase R 外切酶的作用下很容易降解，但circRNA 具有RNase R 耐受性。為了進一步驗證circSFMBT2 的環形結構，對麒麟雞肝臟組織的RNA 分別以RNase R 未處理和處理后，采用實時熒光PCR 定量circSFMBT2 和SFMBT2mRNA的相對表達量，試驗結果表明，使用RNase R 處理后，SFMBT2mRNA 的相對表達量顯著下降，而circSFMBT2 的相對表達量無明顯變化(圖2A)。另外，分別使用Oligo-d(T)18和隨機引物(N9)反轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR 結果表明，SFMBT2mRNA 在Oligo-d(T)18和隨機引物組中的表達量無顯著變化，而采用O l i g o-d(T)18反轉錄的circSFMBT2 的表達量顯著低于隨機引物組(圖2B)。進一步證實circSFMBT2 具備環狀分子的特點。

圖2 circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 對RNase R 耐受性和反轉錄分析Fig.2 Tolerance of the chicken circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA to RNase R and reverse transcription analysis

2.2 雞circSFMBT2 的組織表達譜

分別提取麒麟雞14 胚齡和1 周齡心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肺臟、胸肌和腿肌等組織RNA，反轉錄成cDNA 后，通過熒光定量PCR 對circSFMBT2和SFMBT2mRNA 的表達量進行對比分析。發現circSFMBT2 和SFMBT2mRNA 的組織表達規律存在一定的相似性，兩者都在14 胚齡和1 周齡脾臟和肺臟中高表達，而在胸肌和腿肌中低表達(圖3)。

圖3 麒麟雞 circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 組織表達譜Fig.3 circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA expression profiles in tissues of Kirin chickens

2.3 雞胸肌和腿肌circSFMBT2 時序表達規律

提取麒麟雞不同發育階段胸肌和腿肌組織RNA，反轉錄后定量分析的結果 (圖4)表明，circSFMBT2與SFMBT2 在胚胎時期的表達量相對較高，而出生后兩者的表達量急劇下降，同時circSFMBT2 在胸肌的表達量下降趨勢更為明顯。

圖4 麒麟雞circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 的時序表達規律Fig.4 Temporal expression pattern of circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA of Kirin chickens

2.4 雞circSFMBT2 對DF-1 細胞增殖的影響

2.4.1 CCK-8 試驗結果 在雞DF-1 細胞中過表達circSFMBT2，熒光定量PCR 結果證實過表達效果顯著(圖5A)，pCD2.1-circSFMBT2 過表達質?？捎糜诤罄m試驗。為了驗證過表達后circSFMBT2對細胞增殖的影響，通過轉染pCD2.1-circSFMBT2和 pCD2.1-ciR，收集轉染后24、36、48 和60 h 的細胞，進行CCK-8 試驗，結果顯示，與pCD2.1-ciR組相比，circSFMBT2 過表達48 h 后，DF-1 細胞活力上升(圖5B)。

圖5 過表達雞circSFMBT2 對DF-1 細胞增殖的影響Fig.5 Effect of chicken circSFMBT2 overexpression on proliferation of DF-1 cells

2.4.2 Edu 試驗結果 為進一步分析circSFMBT2對細胞增殖的影響，在DF-1 細胞中同時轉染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 質粒，培養48 h 后對滲入細胞總數進行分析，結果表明過表達組Edu 細胞滲入總數高于對照組(圖6、7)，circSFMBT2過表達后可以促進DF-1 增殖。

圖6 轉染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 后熒光顯微鏡下的細胞狀態(標尺=250 μm)Fig.6 Cell state under fluorescence microscope after transfected with pCD2.1-ciR and pCD2.1-circSFMBT2(Scale bar=250 μm)

圖7 Edu 中陽性細胞統計結果Fig.7 Statistical results of positive cells in Edu

2.4.3 circSFMBT2 對細胞增殖標記基因表達的影響 在CCK-8 和Edu 試驗基礎上，為了進一步驗證circSFMBT2 對DF-1 細胞增殖的影響，在轉染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 質粒24、36、48和60 h 后，qRT-PCR 檢測對照組和過表達組增殖標記基因PCNA、CDK2和CCND1表達趨勢。結果顯示試驗組中增殖標記基因CCND1在36 和48 h 表達量高于對照組，并且CCND1和PCNA的表達量在48 h與對照組差異顯著，CDK2的表達量無明顯變化(圖8)。

2.4.4 circSFMBT2 生物學功能預測 利用RNAhybird 在線預測 circSFMBT2 潛在的靶標位點，發現circSFMBT2 存在miR-103、miR-107 和let-7b 等靶標位點，另外，使用SnapGene 軟件預測circSFMBT2 存在1 個開放閱讀框，編碼蛋白質能力得分為0.936 0，推測其具有較強編碼小肽的潛能。

3 討論與結論

在華南農業大學家禽遺傳育種與繁殖實驗室前期研究的基礎上，本研究驗證了雞 circSFMBT2由SFMBT2基因外顯子12 至外顯子18 反向剪切形成。查閱circBase(http://www.circbase.org)發現，人SFMBT2也存在環狀RNA，人circSFMBT2 由親本基因的外顯子5 至外顯子8 組成。研究發現，人circSFMBT2 可作為miR-182-5p 海綿調控胃癌細胞的增殖[13]，也可通過靶向miR-7-5p 對肺癌細胞產生影響[14]。

由于環狀RNA 的閉環結構，不易被RNase R 降解，具有較強的穩定性。本研究發現，與線性SFMBT2相比，雞circSFMBT2 具有較強的RNase R 耐受性，并且隨機引物(N9)相比于Oligo-d(T)18引物具有更高的反轉錄效率，進一步說明雞circSFMBT2 具備環狀分子的基本特征。雞circSFMBT2 還具有時空表達的特異性，本試驗通過熒光定量發現，雞circSFMBT2 與線性轉錄本在胸肌和腿肌時序表達規律相似，其在胚胎時期表達量較高，而出生后(1～6 周)表達量迅速下降，推測可能與線性轉錄本低表達有關。雞circSFMBT2 在組織中的表達具有差異性，circSFMBT2 在14 胚齡與1 周齡雞肺臟組織表達量最高，在肌肉組織表達量極低。

目前，已有大量文章報道circRNA 在細胞中發揮調控作用，如在牛原代成肌細胞中，發現circLMO7能抑制成肌細胞分化促進細胞增殖[14]。在家禽中，circSVIL 可以通過結合miR-203 從而促進成肌細胞的增殖和分化[15]。在細胞增殖試驗中，我們發現過表達circSFMBT2 48 h 后，增殖標記基因PCNA和CCND1的表達量升高，但CDK2的表達量無明顯變化。CCK-8 與Edu 試驗表明，過表達cicrSFMBT2 可促進DF-1 細胞的增殖。

研究發現，circRNA 具有多種生物學功能。一些circRNA 含有miRNA 應答原件，競爭性與miRNA 結合，發揮miRNA 海綿作用[16]，circRNA也可在轉錄后調控親本基因的表達[17-20]。一些定位在細胞核中的circRNA 可以與RNA 聚合酶 Ⅱ 結合調控親本基因的轉錄活性[7]，含有內含子序列的circRNA 通過RNA-RNA 相互作用與U1 小核核糖體蛋白結合，進一步與RNA 聚合酶 Ⅱ 結合促進親本基因的轉錄[21]，也可以與DNA 結合形成RNADNA 雜交環，在剪接過程中調控親本基因的表達[22]。

隨著circRNA 的研究深入，人們發現有些circRNA 具有開放閱讀框，能編碼蛋白質[23]。circSFMBT2 含有8 個外顯子，利用RNAhybird 在線預測發現circSFMBT2 存在miR-103 和miR-107 等靶標位點，另外，使用SnapGene 軟件預測發現circSFMBT2 存在1 個開放閱讀框。我們期待更深入的研究，驗證circSFMBT2 能否作為miRNA的海綿或編碼小肽，是否調控線性基因轉錄，并驗證其是否參與調控雞肌肉生長發育。