壟作灌溉和減施氮肥對稻田CH4 排放、土壤有機酸含量和酶編碼基因表達量的影響

李熠凡，李伏生，羅維鋼，黃 挺

(1 廣西大學 農學院,廣西 南寧 530005；2 南寧市灌溉試驗站,廣西 南寧 530001)

甲烷(CH4)是僅次于二氧化碳(CO2)的第二大溫室氣體，其增溫效應對全球溫室效應的貢獻率高達17%[1]。稻田系統是農田土壤CH4的重要排放源，而合理灌溉方式和施肥管理是降低稻田溫室氣體排放和溫室效應的主要措施。水稻淹水栽培模式不僅耗水量較大，還導致稻田產生大量CH4[2-3]，是CH4的主要人為排放源。壟作灌溉是稻田在平作基礎上，經起壟，利用壟溝中儲存的自然降雨以及灌溉水，在水稻生長過程中進行浸潤灌溉[4]。壟作灌溉在減少灌水量的同時可降低稻田CH4累積排放量[5]。與淹水灌溉相比，壟寬為80 cm 的壟作灌溉稻田CH4排放量減少45.6%～70.3%[6]。

過量施入氮肥會導致氮素利用效率降低，土壤污染加重，硝態氮淋溶增強，對土壤環境造成極大威脅[7]。胡敏杰等[8]認為較高氮肥用量會增加根系和地上生物量，使土壤碳氮比提高，為產CH4菌提供更多的有機底物，同時短期內刺激土壤微生物活性，促進土壤有機質分解，從而促進CH4排放。姜珊珊等[9]研究發現，減施氮肥可以減少稻麥農田溫室氣體排放，實現減排。適宜的施氮量改善CH4氧化菌的氮缺乏狀態，有利于CH4氧化菌的生長繁殖，提高CH4排放氧化能力，從而降低CH4排放。適宜的施氮量可以降低稻田CH4排放[10-11]，因此在保證產量的同時，尋找合理的減氮量對稻田CH4減排很有必要。

根系分泌有機酸總量、蘋果酸和琥珀酸含量與土壤供氮量呈正效應[12]。稻田CH4排放與土壤有機酸含量有一定關系。目前已知CH4產生途徑之一是產CH4菌在厭氧條件下將土壤有機物分解轉化為乙酸、H2和CO2等[13]。與淹水灌溉相比，干濕交替灌溉對稻田土壤中的產CH4古菌種群豐度沒有顯著影響，但卻顯著改變了土壤中產CH4菌的群落結構[14]。產CH4古菌中甲基輔酶M 還原酶(Methyl coenzyme M reductase，MCR)是CH4形成的關鍵酶，其編碼基因為mcrA[15]，而甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)是CH4氧化的關鍵酶[16]，有sMMO 和pMMO 2 種形式，編碼基因分別為sMMO和pMMO，是產CH4菌和CH4氧化菌豐度估算的分子標記。Yuan 等[17]結合高通量測序和qPCR 等技術，通過CH4合成和氧化過程中的關鍵酶編碼基因表達量估算產CH4菌及CH4氧化菌豐度，發現還原途徑的乙酸裂解途徑的甲烷鬃菌屬Methanosaeta為稻田產CH4核心菌群，其群落組成與土壤草酸、乙酸和琥珀酸等有機酸密切相關。

目前有關壟作灌溉對稻田CH4通量、土壤有機酸和CH4形成和轉化相關酶編碼基因表達量的影響以及相互關系研究較少，前人在研究減施氮肥對稻田CH4排放的影響上，取得的結論也尚不一致，有待進一步探討。為探索壟作灌溉與減施氮肥結合下稻田CH4排放、土壤有機酸和CH4形成和轉化相關酶編碼基因表達量之間的相互關系，通過田間試驗，研究不同壟面寬度的壟作灌溉與水稻返青期和孕穗期減施氮肥對稻田土壤CH4排放、土壤有機酸與CH4形成和轉化相關酶編碼基因表達量的影響，分析不同壟作灌溉模式與施氮處理下土壤有機酸和酶編碼基因表達量對稻田CH4排放的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

大田試驗于2020 年8 月在南寧市灌溉試驗站(N22°52′58.33″、E108°17′38.86″)進行。返青期(移栽后0—7 d)、分蘗期(移栽后8—38 d)、拔節孕穗期(移栽后38—57 d)、抽穗期(移栽后57—70 d)和成熟期(移栽后71—95 d) 降水量分別為74.0、45.0、70.5、56.5 和13.5 mm。試驗土壤為第四紀紅色黏土發育的水稻土，主要理化性質如下：pH 7.069(水、土質量比2.5∶1.0，pH 計法)；有機碳16.58 g·kg-1(重鉻酸鉀容量法-外加熱法)；全氮1.35 g·kg-1(半微量開氏法)；堿解氮100.6 mg·kg-1(1 mol·L-1NaOH 堿解擴散法)；速效磷55.38 mg·kg-1(0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬蘭法)；速效鉀116.65 mg·kg-1(1 mol·L-1NH4OAc 浸提-火焰光度法)[18]。供試水稻品種選用當地推廣的‘甬優4 949’，屬三系秈粳雜交中稻品種。

1.2 試驗方法

試驗設3 種灌溉模式——淹水灌溉、壟寬80 cm 的壟作灌溉(壟灌80)、壟寬100 cm 的壟作灌溉(壟灌100)，和3 種施氮處理——常規施氮、返青期減氮、孕穗期減氮，共9 個處理，每個處理設3 個小區，各小區面積25 m2。淹水灌溉在水稻整個生育期內保持20～40 mm 水層。壟作灌溉是在移栽前起壟，形成需要的壟面和壟溝，壟溝寬度和深度分別為20 和15 cm，根據生育期溝內灌水水層要求，插秧前將溝內水灌溉到高出壟面10 mm，然后插秧，此后生育期內，壟面水層在0～10 mm 循環，實現壟作灌溉。分蘗后期將溝內水灌至與壟面齊平，保持溝內至少有1/4 水層，拔節孕穗期到成熟期壟面保持10 mm 水層，成熟期將溝內水灌至與壟面齊平，等溝內降至1/4 水層時，再將溝內水灌至與壟面齊平，如此循環，實現壟作灌溉，具體灌溉方式參照Zeng 等[6]的方式。降雨時田面和壟溝水層可以增加10～30 mm。3 種施氮處理純氮用量分別為常規施氮：135 kg·hm-2，其中苗肥47.25 kg·hm-2、分蘗肥54.00 kg·hm-2和穗肥33.75 kg·hm-2；返青期減氮：110 kg·hm-2，其中苗肥22.25 kg·hm-2、分蘗肥54.00 kg·hm-2和穗肥33.75 kg·hm-2；孕穗期減氮：110 kg·hm-2，其中苗肥47.25 kg·hm-2、分蘗肥54.00 kg·hm-2和穗肥8.75 kg·hm-2。試驗氮、磷、鉀肥分別使用尿素[w(N)46%]、過磷酸鈣[w(P2O5)14%]、氧化鉀[w(K2O)60%]。各處理P2O5用量均為60 kg·hm-2(100% 基肥)，K2O 用量均為120 kg·hm-2(60%苗肥、40%穗肥)。為防止試驗小區間水分側滲、保證各小區獨立排水，小區間用水泥墻隔離分開，各小區均用水管引入固定水源、安裝水表并計量灌水量。

試驗于2020 年8 月9 日進行大田移栽(選取長勢均勻的秧苗單株栽培，株行距為20 cm×20 cm)，8 月16 日施苗肥(移栽后6 d)，9 月3 日施分蘗肥(移栽后21 d)，9 月24 日復水后施穗肥(移栽后42 d)，11 月14 日水稻收割。整個試驗大田生育期為95 d。

1.3 CH4 氣體采集和測定

用靜態封閉箱法在田間采集稻田土壤及稻株共同排放的CH4氣體[19]。靜態箱箱體為無底圓柱體，由厚5 mm 的亞克力板制成，箱體直徑25 cm、高80 cm，頂部封閉留采氣孔，底部開口端為鋸齒狀，靜態箱內部安裝可充電風扇。取樣時靜態箱垂直插入土壤中不留空隙，保證箱內氣體與外部大氣不交換。采樣前將箱體內風扇打開，均勻混合氣體，再用注射器采集氣體樣品。不同時期稻田CH4通量的變化從水稻移栽后開始采樣，根據水分變化情況每隔5～7 d 采樣1 次，在施用氮肥后7 d 內連續采樣3 次。采樣時刻為09:00—12:00，同時記錄箱溫和采樣器高度。每個采樣點在蓋箱后0、10、20 和30 min 時用注射器采樣，每次樣品量為20 mL。

CH4通量采用氣相色譜儀Agilent 7890A 手動進樣測定，采用FID 檢測器，檢測溫度為350 ℃，柱溫6 0 ℃，H2發生器制備的H2(流速為4 0 mL·min-1) 與空氣混合點火，載氣為高純N2。CH4通量計算公式[20]如下：

式中，F為CH4通量，mg·m-2·h-1；H為實測箱體高度，cm；M為CH4的摩爾質量分數，16 g·mol-1；P為標準大氣壓，1.013×105Pa；R為氣體常數，8.314 J·mol-1·kg-1；θ是采樣30 min 箱體內的平均溫度，℃；dc/dt為CH4排放速率，mL·m-3·h-1。

CH4累積排放量計算公式[21]如下：

式中，SUM 為CH4累積排放量，kg·hm-2；i為氣體采樣次數；ti+1-ti表示2 個相鄰測定日期的間隔時間，n為CH4累積排放量觀測時間內總測定次數。

1.4 土壤采集和測定

在水稻移栽后20、25、30、43、45、46 和71 d 采集CH4的同時，用采土器采集每小區0～20 cm土層的非根際土壤。將新鮮土壤(約100 g)放入提前滅菌過的離心管中，用冷凍干燥機干燥2 d，保存在-80 ℃超低溫冰箱，用于土壤有機酸和CH4形成和轉化相關酶編碼基因表達量的測定。

采用外標法測定土壤有機酸含量[22-23]，將土壤樣品從-80 ℃冰箱取出，用冷凍干燥機在-40 ℃對土壤樣品進行冷凍干燥。干燥完畢后，放入小鋼珠密封離心管研磨、粉碎土樣。在土壤樣品中加入0.5 mol·L-1NaHCO3緩沖液，經研磨儀震蕩、靜置后離心，取上清液，用水相針式過濾器過濾至2 mL 進樣瓶，得到待測樣品，采用上海伍豐液相色譜儀LC100(進樣針設置取20 μL)進行測定。配制不同濃度的有機酸標準母液，上機，根據不同濃度有機酸的峰面積繪制每種有機酸的標準曲線，稀釋有機酸標準母液得到有機酸標準混合液，上機測定得到有機酸標準色譜圖，以標準色譜圖作為對照，根據保留時間確定土壤樣品中的各種有機酸，并根據標準曲線計算土壤樣品中的有機酸含量?？傆袡C酸含量為草酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和富馬酸含量的總和。

酶編碼基因表達量：采用qPCR 分別在水稻不同生長時期測定稻田CH4產生與轉化相關酶編碼基因的表達量。通過SDS、CTAB、苯酚-氯仿-異戊醇和異丙醇試劑震蕩離心后提取RNA。采用TaKaRa 反轉錄試劑盒PrimeScript? RT Master Mix 得到cDNA，采用TaKaRa 試劑盒TB Green?Premix Ex Taq? I 進行qPCR，儀器為Roche LC 480，由系統完成熔解曲線及熒光檢測，并由系統自帶軟件(SDS 2.3)完成所測定樣品的CP值計算[24-25]。

將產CH4古菌的酶編碼基因mcrA和sMMO進行qPCR，通過Abs Quant/Fit Points 分析得出CP值，分別與內參基因古菌A16sRNA 和細菌U16sRNA 的CP值相比，可看出酶編碼基因mcrA和sMMO的相對表達量。

1.5 統計方法

本研究用Excel 2021 對試驗數據進行整理作圖。本研究僅對稻田CH4累積排放量進行了方差分析。不同處理間稻田CH4累積排放量和土壤總有機酸含量的多重比較用Duncan’s 法，差異顯著性水平為P＜0.05。用Pearson 相關系數表示稻田CH4通量、土壤總有機酸含量和酶編碼基因表達量之間的相關性。方差分析、多重比較和Pearson 相關性用SPSS 23.0 軟件分析。

2 結果與分析

2.1 壟作灌溉與減施氮肥下稻田土壤總有機酸含量的變化規律

由圖1 可知，不同處理土壤總有機酸含量為80.4～133.6 mol·kg-1。其中壟灌80+常規施氮處理在施肥后10 d 土壤總有機酸含量較施肥前高71.7%，淹水灌溉+常規施氮處理高28.8%。返青期減氮下，壟灌80 和壟灌100 土壤總有機酸含量整體低于淹水灌溉，其中移栽后30 d 壟作灌溉土壤總有機酸含量較淹水灌溉分別低13.1%和5.8%。常規施氮下，移栽后20、25 d 壟作灌溉土壤總有機酸含量較淹水灌溉低，而移栽后30 d 高。孕穗期減氮下，移栽后45 d 壟作灌溉土壤總有機酸含量較淹水灌溉低。壟灌80 和淹水灌溉下，在移栽后25 d 返青期減氮土壤總有機酸含量高于常規施氮，壟作灌溉下，孕穗期減氮土壤總有機酸含量在施孕穗肥后整體低于常規施氮。

圖1 壟作灌溉與不同時期減施氮肥下稻田土壤總有機酸含量的變化Fig.1 Changes of total organic acid content in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.2 壟作灌溉與減施氮肥下稻田酶編碼基因表達量的變化規律

圖2 是壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田土壤產CH4古菌中MCR 編碼基因mcrA的表達結果。除移栽后71 d 土壤mcrA表達量未測出外，其余天數不同處理土壤mcrA相對表達量在0.09～0.76。由圖2 可知：各處理土壤mcrA表達量總體呈現為分蘗后期增加后降低，隨后拔節孕穗期又增加的趨勢，3 種施氮處理土壤mcrA表達量均在移栽后45 d(拔節孕穗期)最低。由圖2a 可知，返青期減氮下，壟灌80 和淹水灌溉土壤mcrA表達量在移栽后25 d 達到峰值，而壟灌100 土壤mcrA表達量在移栽后30 d 最高。3 種灌溉模式下土壤mcrA表達量均在移栽后46 d 出現第2 個小高峰。移栽后45 d 土壤mcrA表達量降低，隨后上升；推測可能是因為分蘗末期至孕穗期曬田，土壤氧氣條件充足，抑制了產CH4菌活性，從而降低土壤mcrA表達量。返青期減氮下，壟灌80 土壤mcrA表達量均低于淹水灌溉，其中移栽后20 d 壟灌80 土壤mcrA表達量較淹水灌溉低12%。常規施氮下，移栽后20、25 d壟作灌溉土壤mcrA表達量較淹水灌溉低，而移栽后30 d 高。孕穗期減氮下，移栽后45、46 d，壟作灌溉土壤mcrA表達量均較淹水灌溉低。壟灌80 下，在移栽后20、30、43 和45 d，返青期減氮土壤mcrA表達量均低于常規施氮。

圖2 壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田土壤甲基輔酶M 還原酶編碼基因mcrA 表達量Fig.2 Methyl coenzyme M reductase encoding gene mcrA expression level in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

圖3 是壟作灌溉和不同時期減氮下稻田土壤CH4氧化菌中MMO 編碼基因sMMO表達量結果，不同處理土壤sMMO相對表達量為0.59～1.16。由圖3 可知，返青期減氮下，壟灌100 和淹水灌溉土壤sMMO表達量在移栽后25 d 達到峰值，壟灌80 土壤sMMO表達量除移栽后25 d 外均高于淹水灌溉，移栽后25 d 壟灌80 土壤sMMO表達量較淹水灌溉低18%。常規施氮下，壟灌100 和淹水灌溉土壤sMMO表達量均在施分蘗肥后開始上升隨后下降，移栽后20 d，壟灌80 和壟灌100 土壤sMMO表達量較淹水灌溉分別增加24.8% 和7.0%，而移栽后25 d，壟灌80 和壟灌100 較淹水灌溉分別低30.0%和11.8%。孕穗期減氮下，3 種灌溉模式土壤sMMO表達量均在施分蘗肥、孕穗肥后上升隨后下降，移栽后46 d 壟作灌溉土壤sMMO表達量均較淹水灌溉高。壟灌80 下，移栽后20、25 和45 d，返青期減氮土壤sMMO表達量均高于常規施氮。淹水灌溉下，在移栽后25、45 和46 d，孕穗期減氮土壤sMMO表達量整體低于常規施氮。

圖3 壟作灌溉與不同時期減施氮肥下土壤CH4 單加氧酶編碼基因sMMO 表達量Fig.3 CH4 monooxygenase encoding gene sMMO expression level in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.3 壟作灌溉與減施氮肥稻田CH4 排放特征

圖4 是壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田CH4通量的變化情況，整體呈下降趨勢。返青期減氮下，壟作灌溉稻田CH4通量均在施分蘗肥后有增加趨勢，壟灌100 稻田CH4通量受施肥影響較大，在移栽后30 d 最高，淹水灌溉稻田CH4通量在移栽后20 d 最高。常規施氮下，3 種灌溉模式稻田CH4通量均在移栽后20 d 最高，隨后稻田CH4通量降低；移栽后20、25 和30 d，壟作灌溉稻田CH4通量整體低于淹水灌溉。孕穗期減氮下，除移栽后25 d 外，壟作灌溉稻田CH4通量總體低于淹水灌溉。壟作灌溉下，返青期減氮稻田CH4通量整體低于常規施氮。

圖4 壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田CH4 通量的變化情況Fig.4 Changes of CH4 flux in paddy field under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

稻田CH4的排放主要集中在返青期與分蘗期，在分蘗期達到排放高峰，于拔節孕穗期降低，在抽穗期短暫升高后下降(表1)。灌溉模式、施氮處理和兩者的交互作用對稻田CH4的排放有顯著影響，在分蘗前期、分蘗后期、抽穗期和成熟期，各處理稻田CH4累積排放量差異顯著。返青期減氮、常規施氮和孕穗期減氮下壟灌80 和壟灌100 稻田全生育期CH4累積排放量較淹水灌溉分別低44.2% 和10.7%、20.9% 和30.7%、43.9% 和32.5%。壟灌80 下返青期減氮和孕穗期減氮稻田CH4累積排放量較常規施氮分別低35.5% 和18.8%，而壟灌100 下較常規施氮分別高17.9%和11.7%，淹水灌溉下返青期減氮較常規施氮低8.5%，而孕穗期減氮較常規施氮高15%。全部處理中，以壟灌80+返青期減氮處理稻田全生育期CH4累積排放量最低。

表1 壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田CH4 累積排放量(E)1)Table 1 Cumulative CH4 emission (E) in paddy field under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.4 稻田CH4 通量、土壤總有機酸和酶編碼基因表達量之間的相關性

由表2 可知，稻田CH4通量與土壤MCR 編碼基因mcrA表達量呈顯著正相關關系(r=0.644、P＜0.01)，而與總有機酸含量呈顯著負相關關系(r=-0.348、P＜0.01)。土壤總有機酸含量與土壤MCR 編碼基因mcrA表達量呈顯著負相關關系(r=-0.240、P＜0.05)，而與土壤MMO 編碼基因sMMO表達量呈顯著正相關關系(r=0.197、P＜0.05)。

表2 稻田CH4 通量與土壤總有機酸含量和酶編碼基因表達量的相互關系1)Table 2 Correlation among CH4 flux from paddy field,total organic acid content and encoding gene expression level in paddy soil

3 討論

3.1 壟作灌溉與減施氮肥對土壤總有機酸含量的影響

灌溉方式影響水稻根系有機酸的分泌，較淹水灌溉節水灌溉可促進根系分泌有機酸[26]。本研究發現，各處理在施分蘗肥后10 d 內總有機酸含量均升高，其中壟灌80+常規施氮處理在施肥后10 d 土壤總有機酸含量較施肥前高71.7%，淹水灌溉+常規施氮處理高28.8%。

施氮水平也影響土壤有機酸含量[27]，不施氮肥和施氮肥360 kg hm-2均會抑制水稻根系分泌有機酸，而適宜的施氮水平會提高土壤有機酸含量，有機酸能平衡植物內部的陰陽離子，硝態氮作為植物吸收無機氮的主要形態，進入細胞內部被轉化為NH4+再參與氨基酸的生物合成，故植物每吸收1 個NO3-的同時會吸收2 個H+，植物為其內部酸堿平衡而釋放出酸性物質[28]，提高土壤有機酸含量。本研究壟灌100 和淹水灌溉下返青期減氮土壤總有機酸含量較常規施氮高，表明返青期減氮較常規施氮促進植物根系有機酸的分泌，從而提高土壤有機酸含量。

3.2 壟作灌溉與減施氮肥對CH4 形成和轉化相關酶編碼基因表達量的影響

稻田CH4的排放與微生物種類與數量相關。本研究表明，返青期減氮下壟作灌溉分蘗期稻田土壤產CH4菌中MCR 編碼基因mcrA表達量較淹水灌溉模式均低，而常規施氮下只有壟灌80 土壤mcrA表達量較淹水灌溉低。壟作灌溉土壤mcrA表達量較淹水灌溉低，可能原因是壟作灌溉水層較薄、氧氣相對較充足，使厭氧的產CH4菌生長區域深度與產CH4菌活性降低，從而導致土壤mcrA表達量減少。返青期減氮下壟灌80 土壤mcrA表達量較壟灌100 低，說明壟面寬度100 cm 較壟面寬度80 cm 更利于產CH4菌生長，壟面寬度增加使其活性增強，土壤mcrA表達量增加[29]。本試驗各處理土壤mcrA表達量總體呈現為分蘗期和拔節孕穗期增加的趨勢，可能是因為氮肥的施入，施入氮肥短期內可以刺激土壤微生物活性，促進土壤有機質的分解，為產CH4菌提供良好的微生物環境，使得土壤mcrA表達量在分蘗期與拔節孕穗期增加，從而增加CH4排放。

本研究發現，在分蘗期，返青期減氮下壟作灌溉土壤sMMO表達量較淹水灌溉低，其他時期較淹水灌溉高，這是因為稻田CH4排放主要集中在分蘗期，因此分蘗期壟作灌溉土壤sMMO表達量低于淹水灌溉。但是整體上壟作灌溉土壤sMMO表達量較淹水灌溉高，可能原因是壟作灌溉土壤氧氣相對較充足，好氧的CH4氧化菌活性增加，從而使稻田土壤sMMO表達量增加。

適宜施氮量有利于CH4氧化菌的生長繁殖，減少CH4的排放[30]。NH4+與CH4競爭CH4氧化菌中MMO 的相同活性結合位點，適宜的NH4+可以使CH4與MMO 結合量變少。本試驗壟灌80 下，除移栽后20 d，返青期減氮土壤sMMO 表達量均較常規施氮高，可能原因是壟灌80 下，返青期減氮處理的施氮量較常規施氮更有利于CH4氧化菌的生長，使其活性提高和CH4氧化增強，減少CH4排放。

3.3 壟作灌溉與減施氮肥對稻田CH4 排放的影響

壟作灌溉通過改變不同時期稻田土壤水分狀況，從而改變稻田CH4的排放[31]。本研究表明，分蘗期CH4排放量整體偏高，可能是因為分蘗期處于根系發育階段，能產生更多的根系分泌物，分解轉化為乙酸、H2和CO2等，為CH4的產生提供較多的基質。分蘗后期到孕穗期進行了曬田，使得土壤氧氣充足，產CH4菌活性降低，從孕穗期到乳熟期產CH4菌活性處于恢復狀態。成熟期壟作灌溉的水分管理處于波動狀態，土壤通氣性強，產CH4菌活性降低，致使稻田CH4排放降低[32]。Bodelier 等[10]認為，植物可以通過吸收與氮肥相關的亞硝酸鹽毒性或鹽使CH4氧化作用減弱，因而施用氮肥量與CH4排放量顯著正相關。本試驗壟灌100 下的減氮處理稻田CH4排放通量沒有降低，可能是因為壟灌80 模式的壟寬較壟灌100 模式窄，壟溝內的水分能夠很好地浸潤到整個壟上，使得壟灌80 模式土壤水分含量較壟灌100 模式高，壟灌100 模式相對壟灌80 與淹水灌溉田間水分含量低，對亞硝酸鹽毒性或鹽的吸收缺失，使NH4+對CH4氧化產生了抑制作用，降低CH4氧化菌活性，導致施用氮肥量與CH4通量相關性不顯著。

氮肥的施用可以同時影響產CH4菌和CH4氧化菌的活性，而產CH4菌和CH4氧化菌活性孰強孰弱決定CH4的排放情況?？傮w來說，在相同灌溉方式下，返青期減氮稻田CH4通量較常規施氮低，而孕穗期減氮無明顯效應，可能因為稻田CH4排放主要集中在分蘗期前后，返青期減氮處理的低氮水平抑制了產CH4菌的生長環境，導致返青期減氮稻田CH4通量較常規施氮降低，孕穗期減氮相對于返青期減氮影響較小[9]。本研究的前期工作發現，與淹水灌溉相比，壟灌80 模式稻田CH4排放量減少45.6%～70.3%，晚稻產量增加17.6%[6]。本試驗在壟灌80 模式基礎下，繼續探索減施氮肥后稻田CH4累積排放量，發現壟灌80 下返青期減氮稻田CH4累積排放量較常規施氮低35.5%。且水氮管理結合下，全生育期稻田CH4累積排放量以壟灌80+返青期減氮處理最低。本試驗未測產，由前期研究可知，壟灌80 模式增產，但壟灌80 與減施氮肥結合的水氮管理稻田產量是否增加或保持不變尚不明確，是本試驗不足之處，后續將進一步探究壟作灌溉與減施氮肥結合的水氮管理對產量的影響，在不減產基礎上尋求合理的稻田CH4減排模式。

3.4 稻田CH4 通量與土壤總有機酸含量和酶編碼基因表達量的關系

通過相關性分析，本研究發現稻田CH4通量與土壤MCR 酶編碼基因mcrA表達量極顯著正相關，而土壤MMO 酶編碼基因sMMO表達量與CH4通量相關性不顯著，但與土壤總有機酸含量顯著相關，而土壤總有機酸含量與MMO 酶編碼基因sMMO表達量極顯著負相關。表明MMO 酶編碼基因sMMO表達量雖然不直接影響稻田CH4排放，但通過土壤總有機酸間接影響稻田CH4通量?？赡苁且驗楦叩种芃MO 酶編碼基因sMMO的表達量[33]，且抑制植物根系分泌有機酸[27]，抑制CH4氧化菌的活性，增加稻田CH4排放。

與連續淹水相比，間歇灌溉使乙酸產CH4途徑的相對貢獻率降低了8%～10%；最后H2/CO2還原途徑相對貢獻率再次增大；在25 和35 ℃時，CH4通過乙酸鹽和H2/CO2還原2 種途徑產生，溫度升高至45 ℃時，產CH4菌僅通過H2/CO2還原途徑產生CH4[34-36]。本研究表明，稻田CH4與土壤乙酸含量相關性不顯著，這可能是因為壟作灌溉和不同時期減施氮肥下稻田CH4的產生不是通過乙酸裂解途徑，而是H2/CO2還原途徑；且所種植的晚稻直到9 月下旬，都處于相對較高的溫度，也可能是該階段產CH4菌主要通過H2/CO2還原途徑產生CH4的原因。

4 結論

本試驗相同施氮處理下，壟作灌溉稻田CH4排放較淹水灌溉顯著降低，相同灌水模式下，返青期減氮稻田CH4排放較常規施氮顯著降低。水氮管理結合下，稻田全生育期CH4累積排放量以壟寬80 cm 的壟作灌溉+返青期減施氮肥25.0 kg·hm-2處理最低，是本試驗稻田土壤CH4減排的最合理水氮管理模式。返青期減氮土壤有機酸含量和sMMO表達量較常規施氮高。返青期減氮下，壟寬80 和100 cm 的壟作灌溉土壤mcrA表達量較常規灌溉低。稻田CH4通量受到土壤總有機酸含量和mcrA表達量的影響，且土壤sMMO 表達量會間接影響稻田CH4通量。