靶向金黃色葡萄球菌的納米光敏劑UBI/PCN-224的制備和性能驗證*

閆睿,李夢喬,柴韶斌,汪茜△

(1.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心 胸外科, 北京 100039;2.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心 急診科, 北京 100039)

0 引言

開放性損傷是交通事故、災難、戰爭最主要的傷情之一。傷員在皮膚屏障受損后,細菌進入開放性傷口,可誘發皮膚淺表、內臟深層甚至全身感染[1]?？股匾恢弊鳛閷辜毦腥镜闹匾侄蝃2-3]。然而,由于抗生素濫用導致的細菌耐藥問題已越發普遍[4],世界衛生組織預計,因耐藥菌感染的死亡人數將以約70萬人/年的速度增長,至 2050 年,或將達到1 000萬人/年[5]。因此,亟須尋求合理的策略遏制多重耐藥菌的增長。

人類是金黃色葡萄球菌的天然宿主,當機體皮膚被破壞,廣泛存在于皮膚上的金黃色葡萄球菌-正常菌群平衡關系被打破,可引起皮膚和軟組織感染、敗血癥、膿毒血癥等局部或全身性的嚴重感染[6-7]。早期使用抗生素雖然能減少傷口污染及短期內繼發感染的機會,但也增加了因抗生素濫用導致產生耐藥菌的幾率。當創口較深、創面較大時,因表皮及皮下組織破損,污染物及表皮附著的細菌可進入深部創面,形成菌落定植及混合細菌感染,若傷口分泌物引流不暢,出現膿液聚集包裹,致使全身抗菌藥物的使用效果更差,更易導致細菌耐藥的發生[8]。

光動力抗菌治療(antimicrobial photodynamic therapy,aPDT)利用激發光照射光敏劑發生光化學反應,產生大量高毒性的活性氧,使病原微生物細胞破損、蛋白質變性、DNA斷裂,從而達到殺滅細菌的目的[9],其優勢是只對暴露在激發光源下的病原菌進行殺傷,不會破壞機體微生物穩態,并且能避免耐藥的發生。但由于光敏劑水溶性和穩定性差、易聚集、修飾困難,無法特異識別病原菌,導致光照局部正常組織細胞死亡,抑制新生肉芽的生長,阻礙傷口愈合[10-11]等原因,限制了光敏劑在傷口感染治療領域的應用。為此,Dobrindt等[12]將硼酸分子修飾在光敏劑硅(IV)酞菁上,使其具有特異性識別細菌表面多糖的能力,進一步包覆聚乙烯醇增加其水溶性,實現高效殺傷革蘭氏陰性菌的目的。Liu等[13]將光敏劑疊氮-丙氨酸(d-AzAla)裝載到金屬有機框架(MIL-100)孔道中,該納米材料能高效富集到感染部位,并在感染局部高過氧化氫作用下,快速分解釋放光敏劑,d-AzAla能選擇性插入到細菌細胞壁,精準清除病原菌。Nagpal等[14]構建紅光和近紅外光激活的納米光敏劑-磷化銦量子點,研究發現磷化銦量子點在較低濃度,可選擇性殺死耐藥病原菌,且不會對正常組織產生毒副作用。Heyne等[15]將銀納米顆粒表面包覆硅層,并共價耦聯光敏劑玫瑰紅,形成納米立方體光敏劑。利用等離子體顯著增強鄰近光敏劑產生單線態氧的特性,達到高效清除革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原菌的效果。上述發現均為開發更高效的殺菌體系提供了技術支持。研究表明,納米光敏材料在治療感染時,具有很好的局部治療效果,在有效殺死細菌同時,不會損害人體細胞,同時也有采用aPDT進行抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的研究,取得了較好的治療效果[16]。aPDT因其諸多優點成為有望解決細菌的耐藥性問題的研究方向。

上述研究需要針對不同細菌,選擇不同的光敏劑或者納米骨架,再加上小分子物質的靶向特異較差,在實際應用中,組織非特異損傷較重,其應用具有一定的局限性。因此,開發針對感染創面,具備靶向作用的納米光敏劑,具有重要的臨床應用價值。為此,本研究基于抗菌肽和卟啉光敏劑,使用溶劑熱法合成構建了可靶向金黃色葡萄球菌的納米光敏劑UBI/PCN-224。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

本研究使用以下材料,采用溶劑熱法制備卟啉基納米顆粒:八水氧氯化鋯(ZrOCl2·8H2O,德國默克Sigma-Aldrich)、四羧基苯基卟啉鈷(TCPP,西安齊岳)、苯甲酸(德國默克Sigma-Aldrich)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,上海阿拉丁)、丙酮(上海阿拉丁)、抗菌肽(UBI,上海阿拉丁)、1,3-二苯基異苯并呋喃 (DPBF,德國默克Sigma-Aldrich) 。

納米顆粒制作完成后,通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(S-3400N,日本Hitachi)、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(Jem-1200EX,日本TEOL)、Malvern 激光粒度儀(NanoZW90,愛爾蘭Malvern)、冷凍離心機(3-30KS,德國Sigma)、超純水機(TTL10A-北京同泰聯科技)、光譜儀(F-4600,日本Hitachi)、數控超聲清洗器(CPX2800H,美國Branson)、640 nm激光器(K808DB2RN,北京凱普林),對所制備的納米材料進行檢測,驗證材料的物理性質及生物化學特性。

1.2 靶向金黃色葡萄球菌的納米光敏劑UBI/PCN-224的制備

卟啉是一種良好的光敏劑,可在660 nm激光照射下產生活性氧。通過熱溶劑法[17],可制備以卟啉為基礎的納米光敏材料UBI/PCN-224。

1.2.1PCN-224納米卟啉材料制備 取八水氧氯化鋯2 mg,四羧基苯基卟啉鈷6 mg,苯甲酸56.2 mg,混合后放入5 mL圓底燒瓶中,加入2 mLN,N-二甲基甲酰胺,超聲使其溶解,攪拌均勻。將混合液加熱至90 ℃,600 rpm磁力攪拌5 h。反應結束后,自然冷卻至室溫,12 000 rpm、20 min離心收集產物。離心產物用N,N-二甲基甲酰胺重懸后,再次12 000 rpm、20 min離心,棄上清、收集產物。加入丙酮2 mL重懸,12 000 rpm、20 min離心,棄上清。重復上步,丙酮洗滌3次,棄上清后,離心后產物60 ℃真空干燥箱干燥24 h,得到卟啉基納米材料,即PCN-224[18]。

1.2.2PCN-224連接UBI 取PCN-224 20 mg,加入超純水5 mL,配成4 mg/mL水溶液。加入抗菌肽UBI(29-41-Ubiquicidine)水溶液,充分混合均勻后,震蕩反應24 h后,12 000 rpm,30 min離心,棄上清收集沉淀。20 mL超純水重懸后,再次12 000 rpm,30 min離心后收集沉淀。重復離心收集沉淀2次后,產物分散入5 mL水中,4 ℃冰箱中保存備用。制備產物見圖1。

1.3 UBI/PCN-224表征分析

1.3.1形貌表征 TEM是一種把經加速聚集的電子束透射到非常薄的樣品上,進行顯像的顯微鏡?？煽辞逍∮?.2 μm的細微結構,目前TEM分辨力可達0.2 nm。將制備好的納米顆粒在超聲波清洗儀中分散均勻后,將其稀釋至合適倍數,用移液槍滴20 μL至銅網上,室溫晾干后準備測試。使用TEM獲取PCN-224和UBI/PCN-224的形態圖片。

1.3.2Zeta電位測量檢測連接效果 Zeta電位是對顆粒之間相互排斥或吸引力強度的度量。本實驗采用Malvern 激光粒度儀對PCN-224和UBI/PCN-224納米顆粒進行 Zeta 電位測定。樣品平衡時間 60 s對樣品測試3次,結果取3次平均值。

1.3.3納米光敏材料PCN-224光敏效果評價 DPBF是一種單線態氧指示熒光探針,對單線態氧(O2) 具有高特異性,可形成內過氧化物并分解成1,2-二苯基苯。DPBF可用于檢測活性氧(ROS)的生成。具體而言,單線態氧與DPBF發生環氧化反應導致其420 nm的吸收光譜降低,其降低水平與生成的單線態氧水平呈正相關。

采用660 nm激光照射含有8 mM DPBF的PCN-224溶液10 μg/mL,每隔2 min,用紫外-可見-近紅外光譜儀記錄DPBF在300～600 nm處的吸光度和420 nm處的吸收峰。

1.3.4納米光敏材料UBI/PCN-224靶向金黃色葡萄球菌作用驗證 將納米材料PCN-224、UBI/PCN-224分別和金黃色葡萄球菌溶液混合后,光照4 h,將兩組培養液離心,鋪片,固定后,進行掃描電鏡成像觀察。

2 結果

PCN-224納米金屬顆粒幾何結構完整、顆粒之間獨立、無雜質融合、結晶度良好,納米顆粒的粒徑大小在80 nm左右。將PCN-224連接UBI后,得到的納米復合材料UBI/PCN-224顆粒大小增長到100 nm,但其顆粒結構及形態未見明顯變化,說明UBI結合成功,體積相應增大,但并未破壞其納米框架,見圖2。表明成功地合成了UBI/PCN-224納米復合材料。

PCN-224連接UBI后,Zeta電位較PCN-224有明顯提高,表明二者材料有明顯差異。由于PCN-224、UBI均帶正電荷,二者連接成功后,Zeta電位從12.3 mV升至23 mV,說明UBI靶向分子成功連接到PCN-224表面,使其正電位出現增高(見圖3),PCN-224及UBI/PCN-224納米材料Zeta電位測量結果存在明顯差異。

DPBF指示劑可與單線肽氧發生作用,導致吸收峰下降,加入DPBF后,對納米光敏材料UBI/PCN-224單線態氧活性進行檢測。圖4(a)中,隨著光照時間的增長,第0、2、4、6、8和10 min在420 nm波長處的吸收峰峰值,分別為0.89、0.82、0.77、0.71、0.65和0.61,呈現逐漸下降趨勢。研究表明,在光照條件下,納米光敏材料UBI/PCN-224逐漸產生了單線態氧,同時單線態氧與DPBF特異性結合,導致其吸收峰逐漸下降。而圖4(b)中,在無光照的暗環境下,420 nm波長處的吸收峰無任何變化,表明此時并未有單線肽氧結合DPBF,同時也證明了納米光敏材料UBI/PCN-224在無光環境中不釋放單線態氧,說明其暗毒性較低。圖4(c)為420 nm吸收峰數據隨時間變化的數值,直觀地表現了光照條件下單線態氧逐漸產生的過程。從數值變化看,光照可導致納米光敏材料UBI/PCN-224產生單線態氧成線性增加,也表明了納米光敏材料UBI/PCN-224的殺菌活性在光照后隨即產生,并且隨時間持續增加。

圖2 透射電鏡圖像

圖3 PCN-224和UBI/PCN-224納米材料Zeta電位

由圖5可知,PCN-224在和金黃色葡萄球菌共培養后,可見較小的金黃色葡萄球菌聚集,直徑小于60 μm,同時背景中散在單一金黃色葡萄球菌。而UBI/PCN-224和金黃色葡萄球菌培養經光照后,可形成直徑100 μm以上的納米-細菌聚合物,而且圖片背景清晰,無散在細菌,證明連接UBI后,納米光敏材料具有有效的金黃色葡萄球菌結合能力,同時由于納米顆粒間和細菌的聚合特性,可促進細菌聚集,達到限制細菌感染擴散和殺菌的作用。掃描電鏡結果顯示,連接UBI后的納米光敏材料,能更好的和金黃色葡萄球菌結合聚集,發揮其殺菌作用。

圖4 (a).光照條件下,不同時間DPBF吸收峰變化;(b).無光照條件下,不同時間DPBF吸收峰變化;(c).光照環境和暗環境下,DPBF 420 nm波長處吸收峰隨時間變化圖 Fig.4 (a).Under illumination conditions, the absorption peak of DPBF changes at different times;(b). Under the condition of no light, the absorption peak of DPBF changes at different times;(c). Diagram of absorption peaks at DPBF 420 nm wavelength with time in light and dark environments

圖5 (a). PCN-224和金黃色葡萄球菌共培養掃描電鏡成像;(b).UBI/PCN-224和金黃色葡萄球菌共培養掃描電鏡成像

3 結論

本研究選擇卟啉作為光敏劑原料,使用氧化鋯作為納米骨架,制成納米光敏劑的主要作用結構,并通過連接UBI,獲得更強的靶向細菌效果。其聚合作用還可限制細菌感染的擴散,提高殺菌效果,降低非特異損傷。目前研究完成了材料的制備和性質驗證,后續需對UBI/PCN-224的生物抗菌活性的劑量效應關系和實際應用效果進行更深入的探索。本研究提出了一條更多樣的靶向納米光敏材料的研究思路,可將基礎納米光敏材料,通過連接不同的靶向分子,達到更加精準和靈活地制作靶向納米光敏劑的目的,具有廣泛的應用價值。