基于網絡藥理學和分子對接探討雞血藤治療糖尿病腎病的作用機制研究

王蓉,林栩▲,吳昱升,黃慕源,徐璐瑤,張潔

(1.右江民族醫學院附屬醫院腎內科,廣西百色 533000;2.廣西免疫相關性疾病醫學科研基礎保障重點實驗室,廣西百色 533000)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是一種慢性腎臟疾病,發生在糖尿病(diabetic mellitus,DM)患者身上,持續性蛋白尿和腎功能不全是DKD的主要臨床特征[1-2]。DKD已被公認為糖尿病的嚴重并發癥和終末期腎病的主要致病因素,給人類帶來了嚴重的健康問題和巨大的經濟負擔[3]。在DKD的治療中,傳統的治療方法,如減肥和控制血糖,在許多臨床環境中可能無法提供令人滿意的結果。然而,應該注意的是,中藥具有多種功能,在臨床上有可能作為治療DKD的主要或替代療法。 對中藥中生物活性物質的鑒定及其腎臟保護作用的分子機制的研究正變得越來越活躍。因此,從中藥資源中尋找有效藥物具有重要意義。

糖尿病腎病是一種慢性疾病,需要活血通絡、抗氧化來減輕臨床癥狀,預防并發癥,延緩疾病的進展。雞血藤為豆科植物,性溫,味苦,是活血化瘀藥物,具有改善造血系統、調節脂質代謝、抵抗腫瘤和調節免疫等生物活性,而且含有多種多酚類,具有較強的自由基清除活性和抗氧化作用,是一種很有前途的活性氧相關病理治療藥物[4-5]。近年來,雞血藤的多種藥理作用已被廣泛用于臨床治療。網絡藥理學是一種在系統水平上預測化合物有效成分和疾病靶點的組成,建立藥物-成分-靶點-疾病等多層次網絡的方法。此外,分子對接是一種研究蛋白質受體與小分子配體之間相互作用和識別的理論方法,能夠預測結合模式和親和力強度[6]?？傊?網絡藥理學和分子對接可以互補地用于中醫藥研究,為活性化合物篩選和機理探索提供新的見解,已成為揭示中藥與疾病之間復雜網絡關系的有效工具。本研究通過數據挖掘和分析,應用網絡藥理學和分子對接,篩選和預測DKD治療中雞血藤活性成分的潛在靶分子和信號通路。研究結果從分子層面闡釋治療DKD的機制,為雞血藤進一步研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數據庫及網址數據庫名稱及網址見表1。

表1 數據庫及網址

1.2 收集和篩選雞血藤活性成分及作用靶點運用TCMSP數據庫檢索雞血藤的所有化合物成分,篩選出口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,類藥物(drug like,DL)≥0.18的雞血藤中的活性化合物[6]。通過TCMSP數據庫獲取雞血藤活性成分對應的潛在作用靶點信息。

1.3 DKD相關靶點的篩選以 “diabetic nephropathy ”“diabetic kidney disease” 為關鍵詞,搜索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數據庫以獲得DKD全部的靶點信息。

1.4 活性成分-靶點-疾病網絡構建為明確DKD相關靶點與雞血藤活性成分之間的相互作用,使用Venny 2.1.0將疾病靶點和藥物靶點交叉,以確定共同的靶點,并創建一個韋恩圖。該圖被導入Cytoscape 3.8.0以構建“雞血藤-共有靶點”網絡。

1.5 蛋白相互作用網絡構建將獲取的雞血藤治療DKD的潛在作用靶點輸入到STRING 數據平臺,選項設為“Multiple proteins”,選擇置信度≥0.4,設置隱藏游離點,構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。使用CytoNCA工具來分析網絡中心性(NC)、度中心性(DC)、接近中心性(CC)、局部邊連通性(LAC)、介度中心性(BC)及特征向量中心性(EC)等參數,將所有上述參數高于各自中位數的節點從關鍵網絡節點中過濾出來。剩下的節點被確定為DKD治療的關鍵靶標。

1.6 GO功能分析和KEGG信號通路富集分析按P值及校正后的P值(q值)均<0.001為基準進行GO功能與KEGG通路富集分析,從而得出雞血藤治療DKD參與的生物學過程和作用。

1.7 分子對接①從PubChem 數據庫下載活性成分的化合物作為配體分子。②從RCSB PDB 數據庫獲得蛋白質受體3D結構作為受體分子。③使用AutoDockvina軟件進行小分子配體和蛋白質受體的分子對接[6]。使用Pymol軟件對化合物和蛋白質的對接結果進行分析。

2 結 果

2.1 篩選關鍵活性化合物通過對幾個數據庫的搜索和篩選,收集了雞血藤的24個關鍵活性化合物,結果見表2。

表2 雞血藤活性成分的基本信息

2.2 DKD靶點對GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數據庫的搜索分別發現了15 640、485、220、26和102個DKD相關靶點,剔除重復后得到12 818個DKD相關靶點,結果見圖1。

圖1 數據庫收集DKD相關靶點

2.3 成分-靶點-疾病網絡構建將雞血藤活性成分靶點與DKD靶點輸入到Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得疾病-藥物成分共有靶點48個,見圖2A。Cytoscape 3.8.0也被用來將活性成分與靶點結合,構建“活性成分-靶點”網絡(圖2B),表明雞血藤通過多成分-多靶點整體發揮治療DKD作用。

注:A為靶點-疾病靶點韋恩圖;B為“活性成分-靶點”網絡

2.4 關鍵靶點PPI 網絡的構建與分析將Venny 2.1.0 軟件篩選出的48個共同靶點輸入在線STRING 網站,物種設置為“人”,構建PPI 網絡(圖3),PPI網絡被導入Cytoscape 3.8.0,使用CyoNCA插件進行重建和2次篩查后,共獲得4個核心靶點基因,分別為熱休克蛋白90 Alpha 家族A級成員1(HSP90AA1)、MYC 原癌基因(MYC)、腫瘤蛋白p53(TP53)、信號傳感器和轉錄激活劑3(STAT3),拓撲參數BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自中位數0.894,0.933,13,0.264,10.5,12.211。表明這4個關鍵基因以已知、預測或其他相互作用而相互影響,同時也是雞血藤治療DKD的核心靶點。結果見圖4。

圖3 蛋白之間的相互作用網絡(PPI)

圖4 PPI網絡中關鍵靶點基因的篩選流程

2.5 GO功能富集和KEGG信號通路富集分析GO功能富集分析共檢測出498個條目:440個生物過程(BP),25個細胞組成(CC)和33個分子功能(MF)。見圖5。KEGG通路富集分析共得到61個條目,包括PI3K-Akt信號通路和p53信號通路等。見圖6。

圖5 GO功能富集分析 圖6 KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接技術驗證活性成分與核心基因的相互作用分子對接分析了4個核心靶點基因和從活性成分-靶點網絡中獲得的3種化合物,結果見圖7。蘆薈大黃素與TP53結合能為-7.5,木犀草素與TP53的結合能為-7.9,甘草查爾酮a與HSP90AA1的結合能為-7.9,木犀草素與HSP90AA1的結合能為-8.5,蘆薈大黃素與MYC的結合能為-5.5,甘草查爾酮a與STAT3的結合能為-7.3,蘆薈大黃素與HSP90AA1的結合能為-8.8,蘆薈大黃素與STAT3的結合能為-6.9,木犀草素與MYC的結合能為-6.0,木犀草素與STAT3的結合能為-7.3,甘草查爾酮a與TP53的結合能為-9.2,甘草查爾酮a與MYC的結合能為-5.7。見表3。結果顯示,所有的組合都表現出良好的結合活性,其結合能低于-5 kcal/mol。一些組合還顯示出很強的結合活性,結合能低于-7 kcal/mol。這些結果表明,雞血藤的主要活性成分與DKD的主要靶基因之間有很強的相關性,表明這些有效活性成分和主要靶點基因可能是雞血藤治療DKD的主要活性靶點。

表3 雞血藤活性化合物與核心靶點的對接結果

3 討 論

DKD是終末期腎病(ESKD)的最重要病因,其開始是微量白蛋白尿,隨后是大量白蛋白尿,然后腎功能逐漸下降,并通過特征性病理表現進行病理學診斷,例如系膜底物增加、結節性病變和腎小管間質纖維化[7]。DKD的發病機制包括腎小球高血壓、腎血流動力學改變、缺血和缺氧、氧化應激和腎素-醛固酮系統的上調[8]。然而,該疾病的全部發病機制仍有待了解,治療靶點尚未確定。

本研究采用網絡藥理學初步探索了雞血藤治療DKD的分子機制。通過網絡拓撲分析篩選出雞血藤作用于心血管疾病的前4個基因為關鍵基因,即 HSP90AA1、 TP53、STAT3、MYC。這些基因可能在DKD的發生和發展中起重要作用。HSP90AA1是一種普遍表達的分子伴侶,參與促進癌細胞存活的突變和過表達信號蛋白的穩定性[9],它在多種癌癥中上調,HSP90AA1 水平升高提示預后不良,被認為是惡性轉化和進展的必要條件。另有研究表明HSP90AA1是自噬的重要調節劑,可通過PI3K/Akt/mTOR途徑和JNK/P38途徑促進自噬并抑制細胞凋亡[10]。TP53是一種關鍵的腫瘤抑制因子,在癌癥的發生發展和治療中起著多方面作用。TP53蛋白的活化可導致多種細胞反應,包括細胞凋亡、細胞衰老、細胞周期停滯、DNA修復、代謝適應。TP53介導的轉錄調節根據應激刺激的類型和細胞的類型而變化,例如,輕微的DNA損傷可能導致細胞周期停滯并激活DNA修復機制,而較強的TP53激活信號會誘導衰老或凋亡[11]。轉錄調節劑STAT3是STAT(信號傳感器和轉錄激活劑)家族的成員,參與許多生物學過程,包括細胞增殖、存活、分化和血管生成[12],在正常細胞中,STAT3的瞬時激活(主要通過磷酸化)將轉錄信號從質膜上的細胞因子和生長因子受體傳遞到細胞核[13]。核STAT3通過轉錄調控幾種自噬相關基因(如BCL2家族成員和具有自噬調節劑靶標的微RNA)來微調自噬,細胞質STAT3通過隔離EIF2AK2以及通過與其他自噬相關的信號分子(如FOXO1和FOXO3)相互作用來抑制自噬[14]。此外,STAT3介導由細胞內蛋白如活化的Ras或酪氨酸激酶癌蛋白引發的重要信號轉導級聯反應[15],在抑制關鍵免疫激活調節因子的表達和促進免疫抑制因子的產生方面起重要作用。MYC是一種多效性轉錄因子,可調節關鍵細胞過程,包括增殖、分化、細胞周期、代謝和凋亡[16]。MYC是一個編碼核磷蛋白的原癌基因,參與細胞周期的進展、細胞凋亡和細胞轉化。MYC癌基因家族包括C-MYC、N-MYC 和L-MYC,它們在發育過程中顯示出不同的表達時機和組織特異性,C-MYC在組織發育和各種腫瘤中普遍表達,N-MYC在神經組織和早期造血發育中表達,L-MYC在肺部表達,特別是在小細胞肺癌中過度表達,目前被認為具有較低的轉化活性[17-19]。

本研究中,GO功能富集分析共得到498個條目,分子功能主要涉及泛素樣蛋白連接酶結合、G 蛋白偶聯胺受體活性等;生物學過程主要涉及對膜電位調節、細胞對肽的反應、腎上腺素受體信號通路等;細胞組成主要涉及膜筏、膜微區、蛋白激酶復合物等。KEGG通路富集分析共得到61個條目,包括PI3K-Akt和p53等信號通路。分子對接方法的驗證表明,雞血藤的主要活性成分與DKD的主要靶基因之間有很強的關聯性。然而,目前沒有關于核心靶點與DKD之間相關性的報道,本研究中探討的雞血藤在DKD治療中的潛在靶點基因和信號通路還需要通過適當的實驗進一步證實。

綜上所述,雞血藤中的活性成分可以作用于HSP90AA1、TP53、STAT3和MYC等靶基因,并調節PI3K-Akt和p53等信號通路,發揮對DKD的治療作用。本研究從網絡藥理學的角度預測了雞血藤治療DKD的作用機制,表明雞血藤在治療DKD中表現出多成分、多靶點和多途徑的特性,為進一步研究其分子機制提供了基礎。