新疆烏魯木齊市周邊乳源金黃色葡萄球菌的污染和致病力評價

權子晨,賀騰飛,劉英玉

(新疆農業大學 動物醫學學院,新疆 烏魯木齊 830052)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種常見的食源性病原菌,人類因攝入了含有一種或多種腸毒素的金黃色葡萄球菌而導致食物中毒[1]。金黃色葡萄球菌及其分泌的毒素(如腸毒素)引起的食物中毒在細菌性食物中毒事件所占比例高達 33%～50%[2-3]。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)被分為具有催吐活性的經典SEs和葡萄球菌腸毒素樣蛋白新型SEs[4]。在世界各地的葡萄球菌食物中毒事件中經典SEs(sea、seb、sec、sed、see)被認為是葡萄球菌食物中毒的主要原因[5]。在新型SEs中,seg、seh、sei、ser、ses和set在靈長類動物模型中口服后也顯示有催吐作用[4]。經典SEs是人源性金黃色葡萄球菌主要攜帶的種類,動物源及食源性金黃色葡萄球菌中檢出多種新型SEs[6-7]。金黃色葡萄球菌還能產生多種致病因子,如溶血素、殺白細胞素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等。金黃色葡萄球菌因引發奶牛乳房炎及子宮內膜炎等多種疾病,且患乳腺炎奶牛的生乳或乳制品會發生食物中毒,因此嚴重危害奶牛養殖業的健康發展[8-9]。本文通過對新疆烏魯木齊市周邊奶牛養殖場和擠奶廳的乳源樣品進行金黃色葡萄球菌的污染調查,分離菌株進行SEs和多種毒力基因的PCR檢測分析和耐藥性調查,旨在評估乳源金黃色葡萄球菌污染和致病力,為監測金黃色葡萄球菌的暴發流行和危害提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2020年5月和6月在烏魯木齊市周邊地區的奶牛養殖場和擠奶廳采集了糞樣225份,飼料41份,皮毛拭子54份,奶樣37份,吸奶器拭子57份,合計乳源樣品414份。

1.1.2 菌株 質控菌株為大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213 來自國家獸醫微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑 2×Taq Master Mix、ddH2O、DL2000 DNA Marker購自Takara寶日醫生物技術有限公司;核酸染料、TE緩沖液、瓊脂糖購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;Baird-Parker瓊脂基礎、7.5%氯化鈉肉湯、金黃色葡萄球菌顯色培養基、亞碲酸鹽卵黃增菌液購自青島海博生物技術有限公司。12種抗生素(恩諾沙星含量100%、環丙沙星含量100%、頭孢噻呋含量100%、阿莫西林-克拉維酸鉀含量86.6%/100%、頭孢西丁含量98%、氨芐西林含量86.5%、慶大霉素含量54.6%、卡那霉素含量77.4%、阿奇霉素含量98%、氯霉素含量99.7%、萬古霉素含量98%、磺胺異惡唑含量98%)購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.4 儀器設備 博迅凈化工作臺SW-CJ-2FD購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠;恒溫培養箱DHP-9162購自上海一恒科學儀器有限公司;高速離心機 D2012 plus SCILOGEX購自新疆偉博鑫生物科技有限公司;PCR儀購自美國BIO-RAD公司;水平電泳槽DYCP-31 DN購自北京六一生物科技有限公司;凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司;立式壓力蒸汽高壓鍋購自上海申安醫療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定 按照國家標準《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗(GB 4789.10-2016)》[10]進行菌株的分離培養,樣品按1∶10接種于7.5% NaCl肉湯中,培養16 h后劃線接種于Baird-Parker瓊脂平板上,培養24 h后挑取典型菌落劃線接種金黃色葡萄球菌顯色培養基,同時增菌后采用煮沸法[6]提取DNA模板備用。通過PCR方法擴增保守基因nuc進行鑒定,引物如表1。反應體系為25 μL,2×Taq Master Mix 13 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板 2 μL,ddH2O 8 μL。反應條件:預變性95 ℃,5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統觀察結果。

表1 金黃色葡萄球菌毒力基因的引物序列和Tm值

1.2.2 金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測 參考胥蘭[11]和Varshney AK[12]的文獻合成Ses(sea、seb、sec、sed、see、sel、seg、seh、sei、sek、sem和seu),纖連蛋白結合蛋白fnbA和fnbB,溶血毒素hla和hlb,特異性凝集因子clfa,殺白細胞素pvl,毒素休克綜合征毒素tst等19個毒力基因的引物(如表1),由上海生物工程有限公司合成。PCR反應體系為25 μL,其中2×Taq Master Mix 13 μL,ddH2O 8 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板 2 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,退火溫度如表1的Tm值設定30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統觀察結果。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的耐藥性調查 以美國臨床實驗室標準化組織(Clinical Laboratory Standards Institude,CLSI)的標準,采用瓊脂稀釋法測定金黃色葡萄球菌菌株對8類12種抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)值,判定標準根據CLSI標準。

2 結果與分析

2.1 乳源金黃色葡萄球菌的污染情況

從新疆烏市周邊的乳源樣品中鑒定出51株金黃色葡萄球菌,總分離率為12.32%(51/414)。由表2所示,225份糞樣樣品鑒定出19株金黃色葡萄球菌(分離率為8.4%),57份吸奶器拭子樣品鑒定出13株金黃色葡萄球菌(分離率為22.1%),54份體表拭子樣品鑒定出8株金黃色葡萄球菌(分離率為14.1%),37份奶樣樣品鑒定出7株金黃色葡萄球菌(分離率為18.9%),41份飼料樣品鑒定出金黃色葡萄球菌4株(分離率為9.8%)。不同樣品中的金黃色葡萄球菌污染情況差異較大,污染最高的是擠奶廳的吸奶器拭子樣品,最低為牛奶養殖場的糞樣樣品。

表2 乳源樣品分類和數量及金黃色葡萄球菌的檢出率

2.2 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測

2.2.1 SEs的檢測 對51株金黃色葡萄球菌進行12種腸毒素基因(sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sel、sem、sek和seu)的檢測,如表3所示有31株菌株攜帶一個或多個腸毒素基因,檢出率為60.8%(31/51),經典SEs基因seb和sec的檢出率為3.9%(2/51)和51.0%(26/51),sea、sed、see未檢出。新型SEs基因she、sel、seg、sem、sei和seu的檢出率分別為43.1%(22/51)、23.5%(12/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51),sek未檢出。

表3 乳源金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測結果

2.2.2 其他毒力基因的檢測 由表3所示,金黃色葡萄球菌溶血毒素hla和hlb的檢出率分別為52.9%(27/51)和84.3%(43/51)。纖連蛋白結合蛋白fnbB的檢出率為7.8%(3/51),fnbA未檢出。特異性凝集因子clfa檢出率為90.2%(46/51),毒素休克綜合征毒素tst僅檢出1株為2.0%(1/51),殺白細胞素pvl未檢出。

2.3 金黃色葡萄球菌耐藥性調查結果

用瓊脂稀釋法對51株乳源金黃色葡萄球菌進行了12種抗菌藥物的耐藥性調查(見表4)。阿奇霉素和磺胺二甲嘧啶的耐藥率最高分別是86.3%和84.3%,萬古霉素、環丙沙星、阿莫西林-克拉維酸鉀、氨芐西林、頭孢西丁、頭孢噻呋、氯霉素、卡那霉素的耐藥率為49.0%、29.4%、27.5%、13.7%、11.8%、7.8%、5.9%、3.9%,對恩諾沙星和慶大霉素敏感。

表4 乳源金黃色葡萄球菌的耐藥性調查結果

多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株共有34株,最高可達6重耐藥(2株),其中3耐菌株最多有21株,在糞樣、飼料、體表拭子、吸奶器拭子、奶樣樣品鑒定有9株、1株、5株、4株、2株金黃色葡萄球菌;4耐菌株有6株(11.8%),在糞樣、體表拭子、吸奶器拭子樣品鑒定有1株、1株、4株金黃色葡萄球菌;5耐菌株有5株(9.8%),在糞樣、飼料、體表拭子樣品鑒定有3株、1株、1株金黃色葡萄球菌;6耐菌株有2株(3.9%),在飼料和吸奶器拭子樣品各鑒定出1株金黃色葡萄球菌(圖1)。

圖1 乳源金黃色葡萄球菌多藥耐藥菌株數量

3 討 論

從烏市周邊牛奶生產源頭奶牛養殖場和擠奶廳進行金黃色葡萄球菌的污染調查,總分離率為12.3%,其中養殖場中糞樣和飼草料的金黃色葡萄球菌分離率是8.4%和9.7%,擠奶廳中吸奶器拭子、體表拭子和奶樣的金黃色葡萄球菌分離率是22.8%和14.8%、18.9%。與王韋華等[13]調查渭南地區奶牛養殖場生鮮乳中金黃色葡萄球菌污染結果一致,造成金黃色葡萄球菌污染與奶牛養殖環境、擠乳前的消毒工作、擠乳方式密切相關。顧其芳等[14]對上海地區4家奶牛場306份生牛乳中分離鑒定出32株金黃色葡萄球菌,分離率為10.5%。張玲等[15]對浙江杭州市某奶牛場 99 份生鮮乳中分離鑒定出5株金黃色葡萄球菌,分離率為5.1%。表明不同地區生牛乳金黃色葡萄球菌污染程度不同。

經典SEs是引發食物中毒的主要原因,近些年也報道了一些新型SEs引起的食物中毒[16],本研究中SEs的總檢出率為60.8%,其中sec、seh和sel的檢出率為51.0%、43.1%和23.5%。顧其芳等[8]對上海市生牛乳中32株金黃色葡萄球菌的經典SEs檢測率為50.1%。楊慧君等[17]對寧夏地區231株牛源金黃色葡萄球菌中sea、seb和sec的檢出率分別為27.7%、29.0%和5.6%。中國寧夏地區奶牛乳房炎乳源金黃色葡萄球菌中SEs基因檢出率為71.4%,其中sei和sen檢出率最高(44.0%)[18]。Morandi等[19]發現意大利67.1%的牛奶和乳制品源金黃色葡萄球菌編碼了SEs。Nazari 等[20]研究發現伊朗庫姆市乳源金黃色葡萄球菌檢出率最高的SEs基因是sea、seb、seg、seh。本研究中溶血毒素hla和hlb檢出率為52.9%和84.3%,董煒等[21]檢測保定地區奶牛場中金黃色葡萄球菌hla和hlb檢出率為97.5%和98.8%。此外,本研究與陳云[22]甘肅牛源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中clfa 檢出率結果相近。根據結果顯示,分離鑒定的金黃色葡萄球菌普遍存在致病性毒力基因,因此控制金黃色葡萄球菌感染對于牛奶安全具有重要意義。

一般來說,動物源金黃色葡萄球菌的耐藥性較為嚴重,這與動物在養殖過程中長期使用抗菌藥物有關。本研究中金黃色葡萄球菌對阿奇霉素和磺胺二甲嘧啶、萬古霉素、環丙沙星、阿莫西林-克拉維酸鉀的的耐藥率分別是是86.3%和84.3%、49.0%、29.4%、27.5%,且呈現多重耐藥的趨勢。與任強等[23]和廖光華等[24]調查的南疆地區乳源中金黃色葡萄球菌的耐藥性不同,任強等[23]調查的南疆地區乳源中金黃色葡萄球菌對青霉素G、紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為72.0%、64.5%和58.9%。廖光華等[24]調查的南疆地區乳源中金黃色葡萄球菌對慶大霉素、諾氟沙星、紅霉素、四環素和克林霉素的耐藥率分別是9.9%、12.7%、30.9%、11.3%、12.7%,存在9株多重耐藥性菌株。不同養殖場乳源金黃色葡萄球菌的耐藥不同,但耐藥性的增加會影響食品的安全或傳遞給人類,必須要引起重視。

4 結 論

從奶牛養殖場和擠奶廳的樣品中分離鑒定出51株金黃色葡萄球菌,經典SEs以sec基因為主、新型SEs以seh和sel為主,同時攜帶較多的溶血毒素hla和hlb、特異性凝集因子clfa基因。分離鑒定的金黃色葡萄球菌對阿奇霉素、磺胺二甲嘧啶、萬古霉素具有較高的耐藥性。烏市周邊奶牛養殖場和擠奶廳對牛奶質量安全具有嚴重的潛在危害。