霍山石斛和西洋參配伍對環磷酰胺誘導的大鼠血虛證模型治療作用研究

張小勇 邵銀盈 薛曉輝 孟廣東

血虛證為中醫臨床常見的癥候群之一，表現為唇舌面淡白，毛發無光澤，脈細弱、頭昏乏力。其主要原因是血液虧虛，不能滋養經絡、臟腑。血液虧虛由兩方面原因所致，一方面是相關臟腑功能減退，血液來源不足，另一方面是血液損耗太多，多因大量出血或者大病、久病、勞神太過而致[1-2]。

霍山石斛俗稱米斛，正式載入2020 版《中國藥典》，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。西洋參為五加科人參屬植物，功能以補益為主，能夠清熱生津，補氣養陰?，F代研究表明，霍山石斛富含多糖、生物堿、黃酮、蛋白質、氨基酸和聯芐類化合物等多種成分，在抑制腫瘤、提高免疫、抗衰老、抗氧化、抗白內障和肝損傷保護等方面具有較強的藥理活性[3]。貧血小鼠使用西洋參莖葉總皂甙后，可明顯促進紅細胞總數（RBC）、血紅蛋白（HB）、骨髓有核細胞（BMC）、血小板（PLT）的數值提高，抑制白細胞總數（WBC），WBC數值降低（P＜0.05），加快貧血小鼠造血功能的恢復[4]。本研究建立血虛證大鼠模型，考察霍山石斛和西洋參破壁飲片配伍使用對血虛證的治療作用，為霍山石斛、西洋參合用治療血虛證提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量（220±20）g，許可證號：SCXK（蘇）2017-0003，于安徽中醫藥大學動物房常規飼養，室溫（20±5）℃，濕度40%～70%的環境下。實驗動物顆粒飼料的生產許可證為京飼證（2019）06076，本實驗經倫理委員會批準（編號：2021DW005）。

1.2 藥物與試劑 環磷酰胺（ 生產批號20092225）。當歸補血口服液（ 生產批號012011181）；霍山石斛（生產批號20191153）；西洋參（生產批號19023354）。Rat IL-2 ELISA Kit（ 批號A30200842）；Rat IL-6 ELISA Kit（ 批號A30601231）；Rat EPO ELISA Kit（ 批號Q81LJ8U2N1）；Rat MCSF ELISA Kit（ 批號UH8N57E56A）。

1.3 實驗儀器 邁瑞Mindray全自動血液細胞分析儀BC-5390CRP；酶標儀；低速大容量離心機；電子天平；HJ-4A恒溫磁力攪拌器。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立環磷酰胺誘導的大鼠血虛證模型 大鼠常規飼養1 周后，對除正常組以外的所有大鼠腹腔注射環磷酰胺30 mg/kg，建立大鼠血虛模型，給藥容積0.3 mL/100 g，連續給藥4 d。

1.4.2 分組與給藥 將大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（當歸補血口服液）、霍山石斛和西洋參高（1.8 g/kg）、中（0.9 g/kg）、低（0.45 g/kg）劑量組，共6 組。陽性對照組大鼠以2.0 mL/kg的劑量給藥當歸補血口服液。分別制備霍山石斛和西洋參破壁飲片，按比例混合后加純化水制成混懸液，每天給藥一次，給藥容積1 mL/100 g，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續給藥14 d。

1.5 檢測指標 ①大鼠的一般狀態觀察：觀察給藥期間大鼠的精神狀態、活躍度、毛色、尾、爪色澤、食量等基本情況，每隔7 天稱重一次，記錄體質量。根據體質量變化按給藥標準調整劑量。②外周血象指標的檢測：給藥14 d后，提前對所有大鼠禁食不禁水12 h。將實驗大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進行麻醉。取腹主動脈血樣2 mL，注入EDTA-K2 抗凝管中，用全自動血液細胞分析儀分析抗凝管中的血樣，測定血象指標：白細胞計數（WBC）、血小板計數（PLT）、紅細胞計數（RBC）、淋巴細胞百分比（LYM）和血紅蛋白（HGB）。③免疫和造血相關因子水平檢測：取腹主動脈血樣5 mL注入無抗凝劑的采血管中，離心取血清，置凍存管中，于-20 ℃儲存待檢。檢測時按照ELISA試劑盒中的說明書，依次在標準孔和樣品孔中加入相應試液，加檢測抗體，孵育，洗板，各孔加入底物，孵育，加終止液，制標準曲線檢測血清中免疫相關因子（IL-2、IL-6）和造血相關因子（EPO、M-CSF）水平。④胸腺指數和脾臟指數的檢測：采集大鼠的胸腺和脾臟組織將其用濾紙吸去表面液體，稱重記錄。以下述公式計算臟器指數（OI）：脾臟指數（g/kg）=脾臟質量/ 體質量；胸腺指數（g/kg）=胸腺質量/體質量。

1.6 統計學方法 本次實驗數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行處理分析，計量數據采用（±s）表示，各組數據的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠體質量和一般狀態觀察結果比較 正常組大鼠活動敏捷，反應迅速，食量正常，模型組大鼠的活躍度下降，精神狀態不佳，目光呆滯，毛發無光澤且耳、尾顏色明顯變蒼白，飲食和飲水量減少。給藥組大鼠較模型組上述癥狀均有明顯改善。給藥7 天后，模型組大鼠體質量明顯下降，與正常組相比差異顯著（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組與霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠體質量有所提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）?；羯绞臀餮髤⒔o藥組對于體質量的影響呈現劑量依賴性，高劑量對于體質量的提高優于中、低劑量，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 霍山石斛和西洋參對大鼠體質量的影響（±s，n=10）

表1 霍山石斛和西洋參對大鼠體質量的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別體質量（g）給藥第1天 給藥第7天 給藥第14天正常組234.46±21.20 271.86±39.15 292.97±24.19模型組235.28±21.34 215.85±19.61★★220.7±13.53★★陽性對照組233.90±23.68 243.57±33.70# 257.94±19.62#霍山石斛和西洋參高劑量組236.53±21.58 242.51±30.52# 258.96±19.43#霍山石斛和西洋參中劑量組236.57±19.81 240.18±31.25 243.77±15.39霍山石斛和西洋參低劑量組239.62±24.48 234.55±13.69 224.23±18.98

2.2 霍山石斛和西洋參對外周血象的影響 與正常組相比，模型組大鼠外周血象中的WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平下降趨勢明顯，差異具有統計學意義（P＜0.01）。各給藥組對于外周血液均有一定程度的改善作用，與模型組相比較，霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠外周血液中上述5個指標水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋參中劑量組大鼠外周血液中WBC、PLT、RBC水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋參低劑量組大鼠外周血液中WBC、PLT水平顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平檢測結果比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平檢測結果比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別WBC(109/L)PLT(109/L)RBC(109/L)LYM(%)HGB(109/L)正常組4.24±1.61707.09±88.986.92±0.3169.41±7.58139.9±5.58模型組0.10±0.06★★94.53±14.19★★4.92±0.39★★42.92±4.85★★98.75±9.52★★陽性對照組0.29±0.15##202.23±44.76##5.66±0.34##53.56±5.71#116.44±10.33#霍山石斛和西洋參高劑量組0.27±0.05##181.62±32.88##5.62±0.32##52.77±5.46#115.00±5.39#霍山石斛和西洋參中劑量組0.21±0.06##179.33±25.04##5.52±0.30#48.93±5.68113.33±6.65霍山石斛和西洋參低劑量組0.20±0.02##149.00±26.54##5.23±0.4744.20±6.44109.63±11.27

2.3 霍山石斛和西洋參對免疫和造血相關因子的影響 與正常組相比較，模型組大鼠血清中IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平具有顯著差異（P＜0.01）。各給藥組對于免疫和造血相關因子水平均有不同程度的改善趨勢，與模型組相比，霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），霍山石斛和西洋參中劑量組大鼠M-CSF水平顯著升高（P＜0.01），霍山石斛和西洋參低劑量組大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清中免疫和造血相關因子水平測定結果比較（± s，n=10）

表3 各組大鼠血清中免疫和造血相關因子水平測定結果比較（± s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別IL-2(pg/L)IL-6(pg/L)EPO(ng/L) M-CSF(pg/L)正常組1016.46±91.90 561.43±89.94 2.62±0.43 235.58±28.80模型組761.82±39.48★★ 103.5±13.51★★ 1.73±0.19★★112.42±14.94★★陽性對照組 842.80±90.44# 139.95±22.68## 2.48±0.23## 191.32±26.28##霍山石斛和西洋參高劑量組 836.75±70.42# 124.15±16.95# 2.45±0.31# 177.41±24.06##霍山石斛和西洋參中劑量組 772.94±31.60122.79±17.24 2.19±0.24 163.98±12.99##霍山石斛和西洋參低劑量組 755.59±46.19118.39±24.46 2.04±0.37 136.76±16.12

2.4 霍山石斛和西洋參對胸腺指數和脾臟指數的影響 與正常組相比，模型組大鼠胸腺和胸腺指數下降明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組及霍山石斛和西洋參高劑量組對于大鼠胸腺和脾臟指數有升高的趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）；霍山石斛和西洋參中劑量組及其低劑量組大鼠胸腺和脾臟指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 胸腺指數和脾臟指數的測定結果比較（±s，n=10）

表4 胸腺指數和脾臟指數的測定結果比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，★P＜0.05、★★P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05

組別臟器指數(g/kg)胸腺脾臟正常組2.40±0.213.71±0.77模型組1.22±0.24★ 1.77±0.23★★陽性對照組1.53±0.22#2.15±0.16#霍山石斛和西洋參高劑量組 1.52±0.14#2.37±0.20#霍山石斛和西洋參中劑量組 1.41±0.171.86±0.29霍山石斛和西洋參低劑量組 1.08±0.091.80±0.31

3 討 論

中醫理論認為，氣血密切相關，氣能生血，血不足者可補氣以生之，達到不治而治的目的。研究發現，西洋參能明顯升高血紅蛋白、紅細胞和血小板的數量，證實了“氣能生血”這一中醫理論的正確性[5]。西洋參不僅補氣，且同霍山石斛兼具生津功效，因此霍山石斛和西洋參合用補血，具有中醫理論基礎。通過實驗觀察，給藥組大鼠體質量增加，活動增多，亦符合古籍記載霍山石斛具有“補五臟虛勞羸瘦”之功效?，F代研究表明，鐵皮石斛能夠增加脾虛便秘型小鼠血小板比容、紅細胞比容，血小板計數、紅細胞數量，降低白細胞和淋巴細胞數量，使其恢復至正常水平[6]?；羯绞c鐵皮石斛同科同屬，以此作為切入點，研究霍山石斛補血作用，具有現代藥理學基礎。

血虛證造模的方法有失血法、溶血法、輻射損傷法、營養法、化學損傷法等多種方法[7]。本實驗采用環磷酰胺化學損傷法建立血虛證模型，環磷酰胺是典型的抗腫瘤藥，具有顯著的骨髓抑制作用，可引起骨髓造血干細胞損傷，外周血細胞下降，大鼠血虛證造模常用此法[8]。通過對實驗動物的一般狀態的觀察發現，實驗動物在造模期間活躍度明顯下降，耳、尾明顯蒼白，體質量下降，精神狀態萎靡，符合中醫血虛證的臨床表現。進一步對模型組大鼠外周血象各項指標的檢測發現，其WBC、PLT、RBC、LYM、HGB與正常組差異具有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），由此可推斷環磷酰胺已經抑制了實驗動物的骨髓造血功能，血虛證大鼠模型成功建立。

中藥破壁飲片是指將符合國家法定標準的植物類中藥飲片，采用現代加工技術，粉碎至D90＜45μm（300 目以上），可供直接口服的中藥飲片粉末。與傳統飲片相比，其優點是能夠保留全成分，有利于有效成分的釋放和溶出[9]。目前，中醫臨床上對于中藥破壁飲片的應用越來越廣泛，比如呼吸系統疾病、心腦血管系統疾病、神經系統疾病等[10-11]。本次實驗采用霍山石斛和西洋參破壁飲片對血虛證大鼠模型進行治療，結果表明破壁飲片的治療效果明顯。因霍山石斛市場價格較高，破壁成粉末亦符合我國貴重藥材的使用傳統，因此，霍山石斛破壁飲片使用對藥品開發具有一定指導意義。本研究發現，霍山石斛和西洋參破壁飲片對于外周血象指標WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平以及相關的細胞因子IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平均有提高的趨勢，能提高大鼠胸腺和脾臟指數，呈現出劑量依賴性，高劑量比中、低劑量的治療效果好。

綜上所述，本研究表明霍山石斛和西洋參配伍對血虛證有一定的治療作用，但具體的臨床應用效果還需進一步研究。