不同水曲柳褐斑病病級葉片的微生物多樣性

劉思遠，申東晨，劉崢，魯麗穎，徐恒，董愛榮

摘要：為探究染褐斑病不同程度的水曲柳葉片微生物多樣性和主要致病微生物，分析防治方法以維護水曲柳人工林生態安全、提升其經濟效益，在帽兒山實驗林場采集染褐斑病不同程度的葉片，采用高通量測序技術，測定并分析水曲柳葉片微生物群落結構和物種組成。3組樣品感病前后共得到1 026個真菌分類操作單元（Operational Taxonomic Unit ，OUT）及322個細菌OUT。在細菌中，變形菌門和放線菌門為優勢菌門；鞘氨醇單胞菌屬、醋酸桿菌屬、短根瘤菌屬等為主要優勢屬。在真菌中，擔子菌門和子囊菌門為優勢菌門；維希尼克氏酵母屬、殼針孢屬、漢納酵母屬為優勢菌屬。3組樣品細菌多樣性及群落結構無明顯差異，真菌多樣性及群落結構差異性顯著，初步推測尾孢菌屬為病原菌，但其致病性有待進一步研究。

關鍵詞：水曲柳；褐斑??；高通量測序；尾孢菌屬；菌群結構

中圖分類號：S763.1文獻標識碼：A文章編號：1006-8023（2024）01-0001-08

Microbial Diversity in Leaves of Different Fraxinus mandshurica Brown Spot Disease Stages

LIU Siyuan， SHEN Dongchen， LIU Zheng， LU Liying， XU Heng， DONG Airong*

（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：To investigate the microbial diversity and the main pathogenic microorganisms of Fraxinus mandshurica leaves with different degrees of brown spot disease， and to analyze the control methods to maintain the ecological safety and enhance the economic benefits of Fraxinus mandshurica plantation forests， leaves infected with brown spot disease to varying degrees at Maoershan Experimental Forest Farm were collected，and the microbial community structure and species composition of Fraxinus mandshurica leaves were determined and analyzed using high-throughput sequencing technology. A total of 1 026 fungal operational taxonomic units （OUT） and 322 bacterial OUTs were obtained before and after the disease in the three groups of samples. Among the bacteria， the phyla Proteobacteria and Actinobacteriota were the dominant phyla; the genera Sphingomonas， Acidibacter and Bradyrhizobium were the main dominant genera. Among the fungi， the phyla Ascomycota and Basidiomycota were the dominant phyla; the genera Vishniacozyma， Septoria， and Hannaella were the dominant genera. There were no significant differences in bacterial diversity and community structure among the three groups of samples， and significant differences in fungal diversity and community structure. It was preliminarily speculated that the Cercospora was a pathogenic bacterium， but its pathogenicity needed further study.

Keywords：Fraxinus mandshurica; brown spot; high-throughput sequencing; cercospora; microbial community structure

0引言

水曲柳（Fraxinus mandshurica）是木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）植物，東北三大硬闊木之一，為東北地區的主要造林樹種，同時也是工業和民用高級用材[1-2]，廣泛分布于中國東北三省及西北部分地區，在俄羅斯、日本及朝鮮也有分布[3]。目前對水曲柳的研究較為全面，如生理學研究[4-6]、生態學研究[7-8]、遺傳育種研究[9-10]及繁育技術研究[11]等。由于破壞嚴重，加之對水曲柳的市場需求大，水曲柳資源已十分匱乏，伴隨著水曲柳人工種植數量增加，其病害也愈發嚴重，如水曲柳翅果斑點病、水曲柳梢頭白腐、花曲柳葉斑病、水曲柳白粉病、苗木根結線蟲病、煤污病和水曲柳幼苗褐斑病等都造成很大的經濟損失，因此對水曲柳病害的深入了解至關重要。水曲柳褐斑病多危害幼苗，發病后，嫩葉出現病斑，病斑顏色加深擴大至大量葉片死亡，極大降低幼苗生長率，造成嚴重經濟損失[12-14]。調查發現實驗林場的水曲柳幼樹葉片均感染不同程度的褐斑病，導致葉片發黃甚至植株死亡，是現存水曲柳數量稀少的主要原因之一。此外國內外對于其他褐斑病的相關研究十分豐富，目前常見的褐斑病有核桃褐斑病[15]、蘋果褐斑病[16]、松針褐斑病[17]、梨樹褐斑病[18]和柑橘褐斑病[19]等，但對水曲柳褐斑病的記載較少，僅有少數文獻提及，目前褐斑病的防治以化學防治為主，長此以往會造成環境污染或產生耐藥性等現象，利用拮抗微生物防治林木病害是近年來的研究熱點[20]，故運用生物防治拮抗水曲柳褐斑病病原是一種有效可行的辦法。

高通量測序技術相比較傳統的生物測定方法更加快速、準確、高效且能全面分析物種組成以及群落結構[21- 22]，如鄧世林等[23]在分析感染楊樹灰斑病前后葉圍微生物變化時發現染病后病原菌棒盤孢屬（Coryneum）為優勢真菌，Satoshi等[24]通過高通量測序研究法，分析桐與柞木的真菌群落組成隨著時間與腐朽程度的變化情況，結果表明腐朽木的分解速率受腐朽真菌的種群數量的影響。

目前為止，水曲柳褐斑病未引起足夠重視，關于水曲柳褐斑病的研究也鮮有報道，故探究其微生物群落結構并進一步分析防治方法在維護水曲柳人工林生態安全、提升其經濟效益等方面具有重要意義。本研究運用高通量測序法分析不同染病程度的葉片微生物多樣性和群落結構的相關變化，通過分析相關優勢微生物的豐度，探究引起褐斑病的相關病原菌，為后續的褐斑病研究提供理論依據和試驗基礎。

1材料與方法

1.1樣本采集

水曲柳健康葉片、發病葉片均于2022年6月采集于黑龍江省哈爾濱市帽兒山實驗林場。采用“S”形十點采樣法，分別剪取3棵5年生健康葉片、感染褐斑病較輕（病斑面積占整個葉片面積的10%以下）及染病較重（病斑面積占整個葉片面積的10%以上）的水曲柳葉片，放入密封袋中以進行后續DNA提取處理，編號為J1、B1、B2。

1.2水曲柳葉片總DNA提取及PCR擴增

葉片先用體積分數為75%乙醇浸泡15 s，無菌水沖洗3次去除殘留乙醇，再用0.5%的次氯酸鈉浸泡1 min后，再用無菌水沖洗3次?？侱NA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）稍作修改，并用體積分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量。使用帶條形碼的特異引物對總DNA的16S rRNA和ITS進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增。PCR擴增采用50 μL PCR擴增體系，擴增反應條件為98 ℃預變性5 min， 98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物放于體積分數為2%瓊脂凝膠電泳檢測，剩余樣品4 ℃保存備用。每組樣品設置3個樣本重復，J1的3個重復編號為L1、L2、L3;B1的3個重復編號為L4、L5、L6;B2的3個重復編號為L7、L8、L9。引物中的相對應擴增區域為16S V5、V7 區引物，其作用是可以幫助鑒定細菌多樣性；ITS1 和ITS4區引物，其作用是可以幫助鑒定真菌多樣性。擴增產物采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序，測序過程由上海派森諾生物科技有限公司完成。

細菌上游引物序列：5′－AACMGGATTAGATACCCKG－3′ 下游引物序列5′－ACGTCATCCCCACCTTCC－3′。

真菌上游引物序列：5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′ 下游引物序列5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′。

1.3數據分析

調用QIIME 2切除序列的引物片段，棄除未匹配引物的序列；調用DADA2進行質控、去噪、拼接、去嵌合體、去噪，合并OTUs特征序列和OTU表格，統計各樣本在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平下的組成分布的數據可視化，并以相對豐度呈現分析結果。物種比對注釋使用 RDP classifier 軟件，保留置信區間大于0.8的注釋結果。利用scikit-bio進行豐富度（Chao1）指數、辛普森（Simpson）指數、覆蓋率（Coverage）指數計算，并在各分類水平上進行群落結構的統計分析，得到微生物群落結構組成。利用R語言ropls包進行PCA分析樣本間的物種豐度組成差異。利用VennDiagram包制作韋恩圖。利用pheatmap包繪制物種組成熱圖。

2結果與分析

2.1感病前后樣品的細菌和真菌Alpha多樣性

α指數可以代表物種在生境內的多樣性，例如coverage代表樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣品中序列被測出的概率越高。由表1可知，本次測序的coverage均達到0.99以上，說明本次測序結果代表樣品中微生物的一個真實的情況。Chao1可以用來估計群落中含OUT數目的物種總數，一般來講Chao1的數值越大代表物種總數越多，Shannon指數同樣可用來估算樣品中微生物多樣性，但其與微生物群落多樣性正相關。由表1可知，真菌的Chao1指數與Shannon指數隨著染病程度增加明顯下降；細菌的Chao1指數與Shannon指數隨著染病程度增加明顯上升。結果表明，隨著病菌侵染的加重，內生真菌豐富度及多樣性呈現出下降的趨勢，內生細菌的豐富度及多樣性逐漸上升。

2.2真菌Beat多樣性

基于主坐標分析樣品間多樣性差異，評估不同病級的水曲柳葉片內生真菌的差異性，如圖1所示。結果表明，第一主坐標（PC1）與第二主坐標（PC2）的貢獻率分別為90.2%和8.5%。健康葉J1的3個樣品相聚較近，而發病較輕的B1和較重的B2相聚較近，表明在褐斑病侵染的情況下，內生真菌群落結構發生改變，無病斑葉與染病葉內生真菌群落構成差異明顯。

2.3不同侵染級別的水曲柳葉OUT分類

根據97%相似度對抽平后的序列進行OTU聚類，由圖2可知，感病前后共得到1 208個真菌OUT及358個細菌OUT。不同染病程度的3組樣品中共有160個真菌OUT，占OUT總數的13.2%，3類樣品中特有的真菌OUT數目分別為367、287和212個，其中J1中特有的OUT數目最多。在不同染病程度的葉片中共有33個細菌OUT，占OUT總數的9.9%，3類樣品中特有的細菌OUT數目分別為45、92和152個，其中B2中特有的OUT數目最多。證明染病前后真菌的OUT數目顯著下降，細菌的OUT數目顯著上升，與表1結果一致。

2.4不同感染級別的水曲柳葉物種分類學注釋

通過圖3可直觀地展示各分組的注釋精度及不同分組的注釋情況。由圖3（a）可知，隨葉片染病程度增加，真菌門、綱、目、科、屬、種的OUT數量均明顯下降，真菌種水平下的OUT數目隨染病由282下降為273、240。由圖3（b）可知，隨葉片染病程度增加，細菌門、綱、目、科、屬、種的OUT數量均明顯上升，細菌種水平下的OUT數目隨染病由46上升為71、74。

2.5感病前后葉片細菌群落結構差異性

對不同感染級別的葉片在不同的分類水平進行群落組成分析，結果見表2，在細菌門水平下，3組樣品中主要包含變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）及厚壁菌門（Firmicutes），其中變形菌門的相對豐度最高，分別達到97.56%、97.53%、97.26%，因此變形菌門為葉片內生細菌中的優勢菌門。

在屬水平下，健康葉J1相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（86.34%）、醋酸桿菌屬 （Acidibacter）（4.62%）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（2.84%）、酸球菌屬（Acidisoma）（2.23%）和副球菌屬（Paracoccus）（0.24%）等；染病較輕葉片B1相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（87.63%）、醋酸桿菌屬（4.37%）、短根瘤菌屬（1.71%）、酸球菌屬（1.71%）和未被鑒定的擬桿菌科（muribaculaceae）（0.46%）等；染病較重葉片B2相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（87.50%）、醋酸桿菌屬 （4.64%）、短根瘤菌屬（1.46%）、酸球菌屬（1.81%）和痤瘡棒狀桿菌屬（Cutibacterium）（0.52%）等。3組樣品的細菌群落組成不盡相同，主要優勢屬大致相同，但相對豐度存在一定的差異性。短根瘤菌屬、酸球菌屬、假單胞菌屬和副球菌屬等在葉片染病后相對豐度呈一定下降趨勢；痤瘡棒狀桿菌屬、甲基桿菌屬隨著葉片發病，相對豐度有一定上升。

2.6感病前后葉片真菌群落結構差異性

真菌的群落組成結果見表3，在門水平下，子囊菌門（Ascomycota）與擔子菌門（Basidiomycota）為主要的優勢菌門，且在染病前后出現豐度差異，子囊菌門在健康葉B1中的相對豐度為56.89%，但在B1與B2樣品中相對豐度下降為32.63%和43.92%。擔子菌在J1中相對豐度為14.17%，染病后分別上升到51.46%和51.01%。

在屬水平下，健康葉J1相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（Vishniacozyma）（2.53%）、殼針孢屬（Septoria）（39.71%）、宙斯沸耳屬（Dioszegia）（4.21%）、木耳屬（Auricularia）（1.47%）和鏈格孢屬（Alternaria）（1.29%）等；染病較輕葉片B1相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（38.00%）、殼針孢屬（15.31%）、漢納酵母屬（Hannaella）（6.30%）、木耳屬（Auricularia）（1.52%）和尾孢菌屬（Cercospora）（1.34%）等；染病較重葉片B2相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（35.63%）、殼針孢屬（18.27%）、漢納酵母屬（5.12%）、尾孢菌屬（4.14%）和宙斯沸耳屬（3.91%）等。其中希尼克氏酵母屬、漢納酵母屬和尾孢菌屬在葉片染病后相對豐度開始明顯上升，殼針孢屬相對豐度在染病后明顯下降。

2.7物種組成熱圖分析

根據真菌屬水平下相對豐度前15的數據繪制熱圖，結果如圖4所示。熱圖分析不同樣品的差異較為顯著，不同樣品之間優勢種群存在顯著差異。熱圖分析顯示隨著病害的發生，樣品中的真菌微生物群落逐漸改變，優勢菌群發生改變，樣品中的群落結構不穩定。從樣本聚類來看B1組和B2組的真菌微生物群落組成更為相似，表明染病后的菌群結構相似度提高。殼針孢屬與宙斯沸耳屬等在J1樣本中豐度較高，而維希尼克氏酵母屬與尾孢菌屬等在染病葉片中豐度較高。

3討論

通過高通量測序技術，對不同染病程度的水曲柳葉片內生細菌與真菌多樣性進行分析，并研究其群落結構。研究表明健康植物組織的內生真菌群落結構更加穩定[25]，從而抑制病原菌的侵入與致病，張麗娜等[26]通過平板稀釋法培養健康與染病的山茶葉片，結果發現健康葉片的內生真菌數量及多樣性遠高于染病葉片。本研究中，健康葉片內生真菌多樣性顯著高于染病葉片，這與先前的研究結論一致。

3組樣品的細菌優勢門為變形菌門和放線菌門，

Sturz[27]研究發現在果樹等經濟樹種及經濟農作物的組織中也存在大量的變形菌門和放線菌門，與此同時甄泉[28]和方建波[29]的研究中提到，不同的林型空氣細菌群落中變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門均是細菌的主導菌門，這說明水曲柳葉片樣品中的優勢細菌很可能是在染病之前就大量存在，不是導致水曲柳褐斑病的主要病原。真菌群落中擔子菌門和子囊菌門是絕對的優勢真菌，兩者均為常見的植物內生真菌[30]，且染病前后相對豐度出現顯著變化。

鞘氨醇單胞菌屬作為內生細菌的優勢屬，可對紫外線輻射進行預防，在白玉蘭、水稻等植物葉片內生細菌群落研究中也有報道[31-32]。維希尼克氏酵母屬是常見植物內生真菌，如趙衛松等[33]研究表明患黃萎蔫病的馬鈴薯病株根際土壤中維希尼克氏酵母屬的相對豐度呈上升趨勢，但對其系統性研究卻鮮有報道[34- 35]。殼針孢屬是球殼孢目的無性屬，為許多植物病原菌，分布于全球多種植物，常引起葉斑等癥狀[36]，但在本研究中殼針孢屬相對豐度在染病后下降，同時其也為常見的內生真菌[37-38]，不考慮為病原菌。水曲柳褐斑病其致病菌有研究認為是半知菌球殼孢目[13]，有研究認為是白蠟尾孢菌（Cercospora fraxinites）[14]，后者與本研究結果相似，本研究在健康葉中僅檢測到0.05%的尾孢菌屬，但尾孢菌屬在病葉中的相對豐度顯著上升，很可能為病原菌，但其致病性需要柯赫氏法則進一步驗證，后續可從病原菌分離及內生細菌真菌的拮抗方向進一步探究。

本研究結果可為水曲柳的微生物群落結構提供一些理論的依據。隨著水曲柳需求量的日益增加，以及人工水曲柳林的逐漸增多，水曲柳褐斑病等重要病害的監測和防治任務更加艱巨，因此東北地區如何實施有效的防治策略，還有待今后進一步調查和研究。

4結論

健康及感染水曲柳褐斑病葉片的微生物多樣性如下。

1）不同染病程度葉片細菌多樣性及豐度無顯著差異，其中變形菌門和放線菌門為優勢菌門；鞘氨醇單胞菌屬、醋酸桿菌屬和短根瘤菌屬等為主要優勢屬。

2）3組樣品真菌多樣性及豐度有差異顯著，其中擔子菌門和子囊菌門為優勢菌門，但染病前后相對豐度差異顯著；維希尼克氏酵母屬、殼針孢屬和漢納酵母屬等染病前后相對豐度差異顯著。

3）初步推測尾孢菌屬為病原菌。

【參考文獻】

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1993.

Editorial Committee of Flora of China. Flora of China[M]. Beijing： Science Press， 1993.

[2]林士杰，張忠輝，謝朋，等.中國水曲柳基因資源的保護與利用[J].中國農學通報，2009，25（24）：158-162.

LIN S J， ZHANG Z H， XIE P， et al. Conservation and application of the genetic resource of Fraxinus mandshurica in China[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（24）： 158-162.

[3]HU L J， KENTARO U， SHEN H L， et al. Nuclear DNA microsatellites reveal genetic variation but a lack of phylogeographical structure in an endangered species， Fraxinus mandshurica， across North-east China[J]. Annals of Botany， 2008， 102（2）： 195-205.

[4]張新潔，陸天宇，孫海龍，等.氮磷添加對水曲柳化學計量特征和養分再吸收的影響[J].森林工程，2019，35（5）：16-21.

ZHANG X J， LU T Y， SUN H L， et al. Effects of nitrogen and phosphorus addition on nutrient stoichiometry and resorption of Fraxinus mandshurica[J]. Forest Engineering， 2019， 35（5）：16-21.

[5]李婷婷，楊柳，李曉霞，等.水曲柳和蒙古櫟光合特性和生長對不同氮素形態的響應[J].植物研究，2023，43（2）：207-217.

LI T T， YANG L， LI X X， et al. Different nitrogen forms on the photosynthetic characteristics and growth of Fraxinus mandshurica and Quercus mongolica[J]. Bulletin of Botanical Research， 2023， 43（2）： 207-217.

[6]ZHAN Y. Comparing the effects of N and P deficiency on physiology and growth for fast-and slow-growing provenances of Fraxinus mandshurica[J]. Forests， 2021，12（12）： 1760.

[7]朱美如，矯春晶，安康明，等.貯藏溫度和種子含水率對水曲柳種子活力指標的影響[J].東北林業大學學報，2022，50（3）：9-12，18.

ZHU M R， JIAO C J， AN K M， et al. Effects of storage temperature and water content on germination of dormancy-released Fraxinus mandshurica seeds[J]. Journal of Northeast Forestry University， 2022， 50（3）：9-12， 18.

[8]ZHANG X， ZHANG C， ZHAO X. Effect of sex ratio， habitat factors and neighborhood competition on stem growth in the dioecious tree Fraxinus mandshurica[J]. Ecological Research， 2014， 29（2）： 309-317.

[9]崔靖弘，于磊，梁楠松，等.水曲柳CUC1基因克隆及瞬時表達分析[J].林業科學研究，2022，35（1）：82-91.

CUI J H， YU L， LIANG N S， et al. Cloning and transient expression analysis of CUC1 gene from Fraxinus mandshurica Rupr.[J]. Forest Research， 2022， 35（1）： 82-91.

[10]YU L， LI X， TIAN H， et al. Effects of hormones and epigenetic regulation on the callus and adventitious bud induction of Fraxinus mandshurica Rupr.[J]. Forests， 2020， 11（5）： 590.

[11]LIU Y， WEI C， WANG H， et al. Indirect somatic embryogenesis and regeneration of Fraxinus mandshurica plants via callus tissue[J]. Journal of Forestry Research， 2021， 32（4）： 1613-1625.

[12]耿冰.水曲柳培育技術[J].科技創新與應用，2017，186（2）：290-291.

GENG B. Cultivation technology of Fraxinus mandshurica[J]. Technology Innovation and Application， 2017， 186（2）： 290-291.

[13]高宇.水曲柳主要病蟲害及其防治方法[J].長春大學學報，2014，24（10）：1384-1388.

GAO Y. Diseases and insect pests of Fraxinus mandshuica and their control methods[J]. Journal of Changchun University， 2014， 24（10）： 1384-1388.

[14]葛起新.浙江植物病蟲志病害篇（第一集）[M].上海：上?？茖W技術出版社，1991.

GE Q X. Zhejiang plant pests and diseases pests and diseases （Episode 1） [M]. Shanghai： Shanghai Science & Technology Publishers， 1991.

[15]趙玉強，卓可兒，郭云，等.江蘇句容地區薄殼山核桃褐斑病病原的分離與鑒定[J].植物病理學報，2022：1-5.

ZHAO Y Q， ZHUO K E，GUO Y， et al. Isolation and identification of the pathogen causing pecan brown spot in Jurong， Jiangsu[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2022： 1-5.

[16]譚延肖，鄭現和，石瑩，等.MpCYS4基因對蘋果褐斑病病原菌侵染的響應表達及其轉化株系抗性鑒定[J].核農學報，2020，34（10）：2161-2167.

TAN Y X， ZHENG X H， SHI Y， et al. Response of MpCYS4 gene to Diplocarpon mali infection and pathogen resistance assay in transgenic apple plants[J]. Acta Agriculturae Nucleatae Sinica， 2020， 34（10）： 2161-2167.

[17]楊帆，夏馨蕊，沈李元，等.抗松針褐斑病濕地松胚性愈傷組織的超低溫保存[J].分子植物育種，2020，18（15）：5097-5105.

YANG F， XIA X R， SHEN L Y， et al. Cryopreservation of embryogenic callus of Pinus elliottii with resistance to brown spot needle blight[J]. Molecular Plant Breeding， 2020，18（15）： 5097-5105.

[18]LLORENTE I， MORAGREGA C， RUZ L， et al. An update on control of brown spot of pear[J]. Trees， 2012， 26（1）： 239-245.

[19]HUANG F， FU Y， NIE D， et al. Identification of a novel phylogenetic lineage of Alternaria alternata causing citrus brown spot in China[J]. Fungal Biology， 2015， 119（5）： 320-330.

[20]JANISIEWICZ W J， KORSTEN L. Biological control of postharvest diseases of fruits-annual review of phytopathology[J]. Fruit Decay Biocontrol Microbial Interaction Microbial Antagonists， 2002， 40（1）： 411.

[21]LUO C， TSEMENTZI D， KYRPIDES N， et al. Direct comparisons of Illumina vs. Roche 454 sequencing technologies on the same microbial community DNA sample[J]. PLoS ONE， 2012， 7（2）： e30087.

[22]KIRCHER M， KELSO J. High-throughput DNA sequencing concepts and limitations[J]. Bioessays， 2010， 32（6）： 524-536.

[23]鄧世林，申東晨，潘理，等.高通量測序法分析感楊樹灰斑病前后葉圍微生物多樣性[J].東北林業大學學報，2020，48（5）：104-106.

DENG S L， SHEN D C ，PAN L， et al. Leaf microbial diversity before and after Phyllosticta populea Sacc by high-throughput sequencing[J]. Journal of Northeast Forestry University， 2020，48（5）：104-106.

[24]SATOSHI Y， HAYATO M， SHIN A， et al. Relationship between the decomposition process of coarse woody debris and fungal community structure as detected by high-throughput sequencing in a deciduous broad-leaved forest in Japan[J]. Plos One， 2015，10（6）： e131510.

[25]謝憲，梁軍，張銘，等.赤松枯梢病葉內生真菌多樣性研究[J].生物技術通報，2020，36（2）：119-125.

XIE X， LIANG J， ZHANG M， et al. Endophytic fungi diversity in the needles of Pinus densiflora with Sphaeropsis sapinea[J]. Biotechnology Bulletin， 2020， 36（2）：119-125.

[26]張麗娜，朱天輝，楊佐忠，等.灰斑病對山茶葉部真菌群落的影響[J].四川農業大學學報，2011，29（3）：378-385.

ZHANG L N， ZHU T H， YANG Z Z， et al. Influence of camellia gray spot disease on foliar fungal communities[J]. Journal of Sichuan Agricultural University， 2011， 29（3）：378-385.

[27]STURZ A V. Bacterial endophytes： Potential role in developing sustainable systems of crop production[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2000， 19（1）：1-30.

[28]甄泉.北京市空氣細菌群落特征及其影響因素研究[D].北京：中國科學院大學，2018.

ZHEN Q. Characterization of airborne bacterial communities and their influencing factors in Beijing[D]. Beijing： University of Chinese Academy of Sciences， 2018.

[29]方建波.不同林型空氣細菌群落特征研究[D].廣州：華南農業大學，2018.

FANG J B. Bacterial community characteristics of different forest types[D]. Guangzhou： South China Agricultural University， 2018.

[30]黃彩微，廖映輝，張琪，等.涼山州龍肘山銹紅杜鵑與薄葉馬銀花根部真菌分子檢測[J].微生物學通報，2017，44（5）：1108-1120.

HUANG C W， LIAO Y H， ZHANG Q， et al. Molecular diagnosis of root-associated fungi of Rhododendron bureavii and R.leptothrium in Longzhou mountain of Liangshan Autonomous Prefecture[J]. Microbiology China， 2017， 44（5）：1108-1120.

[31]DELMOTTE N， KNIEF C， CHAFFRON S， et al. Community proteogenomics reveals insights into the physiology of phyllosphere bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences - PNAS， 2009， 106（38）： 16428-16433.

[32]STONE B， JACKSON C R. Biogeographic patterns between bacterial phyllosphere communities of the Southern Magnolia （Magnolia grandiflora） in a small forest[J]. Microbial Ecology， 2016， 71（4）： 954-961.

[33]趙衛松，郭慶港，蘇振賀，等.馬鈴薯健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結構及其對碳源利用特征[J].中國農業科學，2021，54（2）：296-309.

ZHAO W S， GUO Q G， SU Z H， et al. Characterization of fungal community structure in the rhizosphere soil of healthy and diseased-verticillium wilt potato plants and carbon source utilization[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2021， 54（2）： 296-309.

[34]PETER G， ROSA C. Biodiversity and ecophysiology of yeasts[M]. Berlin： Springer VERLAG， 2006.

[35]FELIX C R， ANDRADE D A， ALMEIDA J H， et al. Vishniacozyma alagoana sp. nov. a tremellomycetes yeast associated with plants from dry and rainfall tropical forests[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2020， 70（5）： 3449-3454.

[36]王艷.甘肅省藥用植物球殼孢目真菌病害及其病原研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2013.

WANG Y. Study on the diseases and pathogens of sphaeropsidales on medicinal plants in Gansu Province[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University， 2013.

[37]寧祎，李艷玲，李媛，等.桃兒七莖葉組織內生真菌多樣性[J].生態學報，2017，37（15）：5157-5166.

NING Y， LI Y L， LI Y， et al. Diversity of endophytic fungi from the stem and leaf of Sinopodophyllum hexandrum （Royle） Ying[J]. Acta Ecologica Sinica， 2017， 37（15）：5157-5166.

[38]程歡，張東華，張俊忠，等.蘋果砧木T337不同組織內生菌群落及其功能預測[J].江蘇農業科學，2022，50（14）：144-154.

CHENG H， ZHANG D H， ZHANG J Z， et al. Prediction of endophytic communities and their functions in different tissues of apple rootstock T337[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2022， 50（14）： 144-154.