脂肪來源的間充質干細胞治療變應性鼻炎的研究進展

楊佩宣,周威邦,張小兵

(1.蘭州大學第一臨床醫學院,甘肅 蘭州 730000; 2. 蘭州大學第一醫院 耳鼻咽喉科,甘肅 蘭州 730000)

變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR)在全球的發病率非常高,尤其是較為發達的國家及地區。全球20%～30%的人群患有AR[1-3],約5%患有哮喘[4],且患病率呈現上升趨勢。AR患者表現出來的噴嚏、流涕、眼癢等臨床癥狀對患者的社交生活、學習和工作效率產生了極大的影響,重者甚至會影響患者的精神狀況,產生焦慮、抑郁等情緒[5-6]。廣泛認為,AR是一種由特異性免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介導的Ⅰ型變態反應性的非感染炎癥。在臨床醫學實踐中,不規范的藥物混用和不合理的治療會導致嚴重的副作用,包括原有癥狀加重甚至全身的過敏和低血壓等[5]。近年來,有關間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的各項實驗研究表明,MSCs本身具有低免疫原性及免疫調節功能,同時具有營養和促進組織修復的能力,其抗炎抗過敏的作用已經得到了多個實驗結果的支持[7-8]。利用MSCs自身的特點,進行細胞移植,理論上來說是治療AR的新希望。脂肪來源的MSCs具有來源廣泛,制備較易,組織修復功能和免疫調節能力明顯等優點,本文就脂肪來源MSCs治療AR的實驗研究進展作一綜述。

1 AR的發生發展

普遍認為,1型輔助性T細胞(type 1 T helper cells, Th1)和2型輔助性T細胞(type 2 T helper cells, Th2)的免疫失衡是AR發生的免疫學基礎[9],主要是指Th2在免疫反應中占優,而Th1不足,導致體內多種炎癥介質、細胞因子的釋放,最后表現為外在的鼻部過敏癥狀。

我國幅員遼闊,每個地方具有不同的氣候和地理環境,變應原的種類也呈現出不同的特點,生活方式的變化也會引起國內變應原譜系的改變[10]。機體接觸到外界變應原后,經抗原呈遞細胞的處理,通過主要組織相容性復合體和T細胞受體之間的相互作用,與T細胞結合,誘導T細胞分化為Th2。Th2產生各種細胞因子,如白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-5、IL-13等[11],通過信號轉導,從而誘導B細胞分化為產生IgE的漿細胞,同時參與肥大細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的炎癥反應。第2組先天淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells,ILC2)也參與免疫應答過程,其產生的IL-5、IL-13因子加劇了炎癥反應[12]。除此之外,濾泡輔助性T細胞在誘導血清IgE水平上調的過程中起了重要作用[13]。血清中,IgE與肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面的高親和力受體結合[14-15],使其致敏,致使肥大細胞、嗜堿性粒細胞釋放包括組胺、類胰蛋白酶和趨化因子在內的生物活性介質,外在機體則表現為一系列典型的過敏癥狀[16]。

AR并不僅僅是上呼吸道疾病,它還可能導致下呼吸道的炎癥發生,在AR患者身上,經常存在鼻炎與哮喘并存的現象[17]。

2019年底新冠病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)的出現及其大流行的發生,對全世界人口的健康產生了巨大的影響。截至2022年12月1日,全球已確診超過6億人,已有超過660萬人的死亡被歸因于COVID-19的大流行。AR和哮喘是常見的呼吸系統疾病,病毒性呼吸道感染會導致其病情惡化[18-20]。部分回顧性分析研究結果表示,AR及哮喘是COVID-19的危險因素,但同時也有隊列研究表示其不存在相關性[19, 21-23]。中度及重度哮喘目前被美國疾控中心列為COVID-19重病的危險因素[患有某些疾病的人/疾病預防控制中心 (cdc.gov)],同時還有支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統疾病被列入。結合上述資料,筆者認為,AR的治療和控制是十分必要的,尋找新的有效的、療效更好的治療方式,是研究的熱點和重點。

2 MSCs的特點

MSCs由干細胞分化而來,同時其仍然保留了干細胞的普遍特性,包括自我更新、自我增殖(克隆)和分化潛能[24-25]。MSCs最初由 Friedenstein等[26]發現,目前一直是各方向研究的中心。MSCs來源廣泛,可從臍帶血、子宮內膜、骨髓、脂肪、肝臟多種組織器官中提取[27],理論上,MSCs甚至可以從全身任何組織獲得[28],通過體外培養,可以獲得呈現出貼壁生長時具有成纖維細胞形態的細胞[29]。最開始,MSCs多指骨髓來源的祖細胞,直到2001年,Zuk等[30]才提出了脂肪來源的MSCs這一概念。脂肪來源的MSCs具有獲取方便、提取簡便、豐度大和多譜系化分化潛力的優點[31],且極少存在醫學倫理學方面的問題,因此在生物醫學實驗中,常采用脂肪來源的MSCs作為實驗材料。

MSCs主要具有以下5項生物學功能[7,32]:①增殖功能;②多能分化功能;③歸巢和遷移功能;④營養功能;⑤免疫抑制功能。

作為干細胞的一種,MSCs能進行增殖達成自我更新和細胞擴增,這與細胞本身具有的“干性”有關[33]。干細胞能在細胞周期中快速移動,較少在G1期停留,S期較普通細胞延長[34],且能長時間地保持在G1或者G0期的靜止狀態,在需要時再次進入細胞周期。體外培養時,MSCs的增殖功能仍然存在,并且能在一定的刺激下分化為脂肪細胞、成軟骨細胞和成骨細胞[7, 35-36],也有部分研究表明[37-39],MSCs也能分化為內皮祖細胞、肌母細胞和神經母細胞。這樣的分化能力,使得其在生物材料領域和組織再生領域大放異彩。MSCs可以沿著血管,穿過內皮壁,回到自然駐留地或者遷移到受損及患病組織中[7]。Fu等[40]研究表示MSCs能通過定向分化和旁分泌進行遷移和組織修復,促進受損組織和傷口的愈合。Cucarián 等[41]研究也表示人脂肪來源的MSCs和體育鍛煉,能有效改善帕金森大鼠模型的運動障礙。但也有學者的研究得到了完全相反的結論[42]。MSCs可通過細胞間接觸產生修復環境的能力,伴隨著多種生物活性大分子的旁分泌過程,這些生物活性大分子促進參與組織修復的炎癥細胞的免疫調節和內源性祖細胞的分化[32,43-44]。MSCs的免疫調節特性能抑制局部免疫反應和纖維化組織形成,同時調節血管生成,細胞凋亡和細胞增殖。MSCs典型的體外調節能力是抑制T細胞[45]和B細胞[46]的增殖,以及樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)的分化,上調Treg細胞的數量來調節免疫反應[47]。在體內和體外比較不同來源的MSCs研究很多,但基本都產生了一致的結果,提示MSCs為免疫學應用中最有希望的細胞[48]。

3 脂肪來源MSCs的低免疫原性與免疫調節功能

脂肪來源的MSCs擁有MSCs的一系列生物學特性,自然也擁有免疫抑制功能。實驗證明,脂肪來源的MSCs在體外擴增時,具有低免疫原性的特點[7]。其不表達Ⅰ類人類白細胞抗原及包括白細胞分化抗原40(cluster of differentiation 40,CD40)、CD80、CD83、CD86和CD154在內的共刺激分子,僅表達Ⅰ類人類白細胞抗原類分子。同時,MSCs還可通過調節DC細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)[49-50],間接抑制效應T細胞的啟動,通過移植MSCs可以有效改善幾種炎癥性疾病[51],如關節炎、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性葡萄膜炎。

脂肪來源的MSCs具有抗炎作用。不同來源的MSCs的免疫特性不完全相同,且來自脂肪組織的MSCs往往有更強的免疫抑制能力[52-53]。有學者認為[54-55],MSCs可以通過對T細胞的有絲分裂進行干擾,一定程度上阻止其增殖,達到抑制免疫應答的目的。這種抑制并不需要直接接觸,但當兩者進行直接接觸時,抑制效應增強。在γ-干擾素(interferon γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1等炎癥因子的刺激下,MSCs會上調誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶的表達水平,以致免疫抑制分子一氧化氮和前列腺素E2大量產生,進行免疫調節[51, 56]。值得注意的是,一氧化氮的調節作用,目前僅在小鼠系統中被證實[57],具有物種依賴性,在人體內,對應的是吲哚胺雙加氧酶,在一些模型實驗里,人MSCs也可發揮相應作用,但并不總是能抑制T細胞的效應[50-51]。MSCs能產生前列腺素E2,減少T細胞的增殖,抑制TNF-α和IL-12的產生,下調肥大細胞表面組織相容性復合體Ⅱ類的表達,減輕炎癥反應[58]。在Najar 等[59]的實驗研究中,人脂肪來源的MSCs在體外共培養時,對淋巴細胞的增殖有劑量依賴性的抑制作用,且高于骨髓來源的MSCs。同時,其擴增速度也高于骨髓來源的MSCs,范圍也更廣。Quaedackers等[60]報道,人脂肪來源的MSCs可以與活化的T細胞、B細胞和NK細胞亞群結合。這些觀察的結果表明,脂肪來源的MSCs具有很好的免疫調節能力,在細胞治療和組織工程方面十分有益,且移植環境也很好。同時,MSCs產生多種趨化因子和黏附分子,將相應的T淋巴細胞募集到損傷部位,發揮免疫抑制作用。MSCs還可以通過抑制IFN-γ、IL-17的分泌,拮抗Th1和Th17的分化,促進IL-10的產生,誘導Treg細胞的產生[61-62]。Kavanagh的實驗證明,MSCs能誘導CD4(+)FOXP3(+)T細胞,降低IL-4、IL-13水平,增加了IL-10的水平,說明MSCs能誘導Treg細胞參與調節氣道的免疫反應。在人和鼠的體內,MSCs都能抑制B細胞的增殖、分化及活化,在體外共同培養時,B細胞表現出周期停滯、漿細胞生成受損,免疫球蛋白分泌能力受損的傾向[63-64]。有相應研究表明,這可能與MSCs胞外囊泡的分泌有關[65]。另外,Ivanova-Todorova 等[52]的研究表示,脂肪來源的MSCs能通過分泌轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和IL-10控制DC的發育,特別是單核細胞衍生的DC,抑制了共刺激分子CD80和CD86的表達,從而抑制了DC有效刺激T淋巴細胞的能力,間接地導致免疫反應的降低或消失。脂肪來源MSCs的以上特點,說明了其能很好地調節Th1/Th2的平衡,從而緩解氣道的炎癥反應。

MSCs的免疫調節功能極其復雜,它涉及對T細胞、B細胞、DC細胞、巨噬細胞、Treg細胞等多種細胞的調節[66],形成了密密麻麻的調節網絡,有助于免疫相關疾病的治療。目前,在人體內,已經進行了克羅恩病(美國Mayo醫生診所),急性移植物抗宿主反應(Osiris Therapeutics)和嚴重成骨不全(St. Jude 兒童研究所)的臨床實驗。AR暫時沒有相關的臨床試驗,但值得期待。

4 脂肪來源的MSCs治療AR的相關實驗研究

因脂肪來源的MSCs的上述特性,現已經成為AR治療研究的新方向,有許多人對其治療AR進行了相應的實驗研究,也取得了很多有價值的結果。

Cho 等[67]通過動物實驗,向AR模型小鼠(指人工造模的AR小鼠,一般采用卵清蛋白和氫氧化鋁聯合基礎致敏,并使用卵清蛋白進行鼻腔激發)尾靜脈注射脂肪來源的MSCs,光鏡下比較發現MSCs可以改善AR模型小鼠鼻黏膜部位嗜酸性粒細胞浸潤,且能降低血清中特異性IgE的水平。并對脾臟進行了IL-4、IL-5、IFN-γ的檢測,研究人員發現與Th1相關的IFN-γ水平上升,與Th2相關的IL-4、IL-5水平下降,這說明了MSCs可能促進了Th1向Th2轉化,調節了AR的免疫失衡。肖二彬等[68]重復了上述實驗,得到了相同的結果。同年,李冠雪等[69]也進行了相似的實驗,向AR模型小鼠尾靜脈注射不同濃度的脂肪來源的MSCs后,使用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ的水平,發現IL-4、IL-6水平下調,IL-10和IFN-γ水平上調,熒光顯微鏡下CM-Dil標記的脂肪來源的MSCs可向鼻黏膜遷移,且高濃度MSCs注射組表現出比低濃度組更明顯的遷移修復傾向,這說明MSCs對鼻黏膜的修復作用與劑量也有一定的關系。此實驗一定程度上驗證了MSCs具有遷移和促進受損組織修復的能力。Ebrahim等[70]則通過向AR模型小鼠腹腔注射脂肪來源的MSCs來進行實驗研究。與口服孟魯斯特鈉的AR模型小鼠組相同,注射了脂肪來源的MSCs的小鼠,在行為學上,打噴嚏、流涕等過敏癥狀明顯減輕,血清學分析結果則表示特異性IgE、IgG1、IgG2a和組胺水平也均有降低。對比注射了MSCs的小鼠和孟魯斯特鈉組的小鼠,光鏡下發現腹腔注射脂肪來源的MSCs的AR模型小鼠鼻黏膜部位修復更為明顯,表現出了MSCs修復作用。此實驗也說明了脂肪來源的MSCs對AR小鼠具有很好的治療效果。戴偉丹等[71]將脂肪來源的MSCs通過腹腔注射,注入哮喘模型小鼠體內,比較發現,干細胞治療組小鼠的肺部炎癥較模型組明顯減輕,血清學實驗也表示,治療組體內IL-5、IL-13表達較哮喘模型組明顯下調,且隨著時間的變化,治療組小鼠體內IL-25、IL-33等細胞因子的表達也逐步下降,上述因子均為ILC2的前炎癥因子。此實驗證明了靜脈注射脂肪來源的MSCs能減輕哮喘的氣道炎癥,緩解臨床癥狀,具體可能是因為MSCs抑制了ILC2的增殖。前文我們提過,ILC2也同樣參與了AR的發生。去年,Trombitas 等[72]對慢性鼻-鼻竇炎小鼠進行了類似實驗,通過向慢性鼻-鼻竇炎小鼠進行框周靜脈注射脂肪來源的MSCs,在注射后比較對照組,模型組和MSCs治療組的小鼠鼻黏膜,發現MSCs向鼻黏膜進行了遷移和修復。

綜合上述實驗結果,我們認為脂肪來源的MSCs能一定程度上降低氣道的炎癥反應,并且能一定程度上進行受損組織的修復,具有非常好的療效,這是基于MSCs本身的特性實現的,尤其是MSCs本身的免疫調節能力。在致敏的微環境中, IL-2、IL-4、IL-5、IL-13因子上升,MSCs表面的IL-4細胞因子受體與IL-4結合,通過相應的細胞通路,產生TGF-β,與相應的免疫細胞結合,導致IL-4的含量下調,恢復免疫平衡。同樣的,MSCs還能上調Th1型細胞免疫應答,使IL-10和IFN-γ水平上調,產生拮抗作用。并且,其組織修復、遷移以及免疫調節功能在實驗中都得到了相當正面的反饋。

5 小結與展望

盡管脂肪來源的MSCs治療AR已經在動物實驗方面取得了很多研究成果,被證實為有效的治療方式,但至今仍然沒有臨床實驗研究結果?，F階段,MSCs幾乎都是在體外環境下培養增殖的,而不是在正常的生理條件下,這可能會在實際應用時產生不同的影響,MSCs的生物學特性或許也會發生改變[73]。脂肪是屬于個體比較容易獲取的來源,培養方法和繁殖水平也相對容易,提取也較骨髓更為方便,細胞豐度也更大,將來在臨床實驗上可能獲得更多的考慮和關注。

本文收集的數據主要是使用脂肪來源的MSCs在動物體內進行的實驗研究,存在一定的局限性。但從理論上來說,對難以治愈的AR患者來說,這可能是新的治療方向,是新的治愈希望。從治療的安全性上來說,脂肪組織中存在大量的間充質細胞,并且在體外培養時,能迅速增殖,這就減少了染色質變異的可能性。在實驗研究上,也暫時沒有發現其導致腫瘤發生的現象,但是人體內相關的實驗研究仍然匱乏,并不能因此認為脂肪來源的MSCs不會導致腫瘤的發生。Neri等[74]的研究表示,脂肪來源的MSCs具有一定的遺傳穩定性,比骨髓來源的MSCs更安全。

近年來,有關MSCs胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的研究越來越多,有相當的文獻研究表明,EVs可能具有與MSCs類似的免疫調節特性。外泌體是由質膜直接向外發芽產生的,其產生微囊泡、微顆粒和直徑約為50 nm至1 μm的尺寸范圍的大囊泡,外泌體起源于內體,直徑為40～160 nm(平均約100 nm)[75-76]。MSCs衍生的外泌體于2010年在心肌缺血再灌注損傷小鼠模型中首次進行了研究[77],后續在心血管疾病、腎臟疾病、神經系統疾病、癌癥和免疫系統疾病中都有相應的應用[78]。Zhao等[79]的研究提示脂肪來源的MSC-EVs可從脂肪來源MSCs內轉移至巨噬細胞,與其結合,誘導M2型巨噬細胞極化,從而緩解炎癥反應的發生。Dong等[80]的發現則證明,對類固醇抵抗的哮喘小鼠使用MSC-EVs,可以逆轉氣道的高反應性,減輕炎癥反應。郭瑞敏等[81]對MSC-EVs治療呼吸系統相關疾病的研究中,提出霧化、滴鼻使用,能更直接讓MSC-EVs到達呼吸道,發揮歸巢、免疫調節功能。應用EVs治療AR的實驗研究現在極少,但這不失為更進一步的選擇,EVs的制備比起MSCs更復雜,但它的使用也更為安全和簡單,無需考慮MSCs異常增殖導致的一系列問題,而且EVs的主要組織相容性復合體分子相對較少,也無法直接形成腫瘤[78],最近的研究表明[82],MSCs衍生的外泌體正是誘導外周耐受和調節免疫反應的有效細胞器。將其作為AR治療的新策略,則需要更多的實驗支持。

在各種呼吸道病毒傳播的流行中,控制AR患者的癥狀,能減少呼吸道病毒的傳播。Gani等[83-84]表明,雖然過敏不是新冠病毒發病的危險因素,但仍建議在COVID-19的流行期間,對AR患者加強管理,以降低傳播感染的風險。應對兒童AR患者進行新冠病毒疫苗的有效接種,構建群體免疫屏障[85]?？刂艫R患者的發病癥狀,甚至治愈AR,在現在,在未來,都是迫切的。希望有更多更細致的實驗,能為AR患者提供更多的治療選擇。筆者認為,使用脂肪來源的MSCs來干預,是治療AR新的方向。