混合型生物炭對寒冷地區PAHs 污染土壤微生物修復的強化作用

蘇丹，羅橋冰，董昱杉，楊彩霞，王鑫

1. 遼寧大學環境學院，遼寧 沈陽 110036；2. 沈陽大學/區域污染環境生態修復教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110044

隨著人類工農業活動的加劇，具有高毒性、高累積、難降解、可遠距離遷移的多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）污染物在土壤系統中不斷累積，且在土壤表層和次表層的積累趨勢明顯（姜永海等，2009；Wu et al.，2017），潛在威脅生態安全與人群健康。微生物降解被認為是去除環境中PAHs 的主要途徑，具有經濟、有效、生態無二次污染等優勢，其中固定化微生物技術因其可提高微生物修復效果而備受關注（Alexander，1981；Lea et al.，2019）。

北方寒冷地區土壤受凍融作用影響，大部分PAHs 污染土壤處于中低水平。土壤孔隙自由水0 ℃凍結，團粒吸附水低于-8 ℃凍結（Coxson et al.，1987），凍結會導致大部分微生物休眠，但團粒表面水分子膜在-20 ℃以下仍可保持液態（Koponen et al.，2006；Juan et al.，2018）。冷適應微生物對凍結環境具有較高抗性，在凍結條件下耐冷菌對土壤中PAHs 的降解作用不受限制（Lipson et al.，2004；陳明華，2014）。蘇丹等（2017）已從凍結環境中分離得到多株耐冷PAHs 降解菌，并引入固定化技術成功構建了固定化耐冷真菌-細菌共生體系，發現耐冷菌經固定化處理后，對凍融交替條件下土壤PAHs 的去除效率較游離菌提高10%以上，固定化載體-真菌-細菌構建起的微環境作為緩沖體系，有效屏蔽土著微生物的競爭作用和不利土壤條件的侵害作用，體系內PAHs 降解菌的數量與活性均得到不同程度的提高，正逐步由實驗研發轉向現場應用（鞏春娟，2018；普聿，2019；王天杰，2020）。但要實現在原位修復中的成功應用，還須提高低溫條件下土壤PAHs 的生物有效性（微生物可利用性），縮短污染物和降解菌之間的距離，強化修復效果。

土壤對PAHs 有很強的截留作用，污染物被土壤綁定、老化而長期停留在土壤中，難以被微生物利用，固定化微生物能夠通過固定化載體吸附作用改變土壤PAHs 的分布和結合位點，影響其生物有效性（Martienssen et al.，2000），若要提高土壤PAHs的微生物可利用性，選擇合適的載體材料是一個有效途徑。與天然載體相比，人工載體因具備可控的比表面積、孔徑分布以及傳質性能好等優點，能與特定的微生物及復雜污染物更好地匹配，進而獲得更優的固定化效果和修復性能（Muhammad et al.，2020）。因此，有必要開發出低成本、環境友好型人工載體，用于耐冷PAHs 降解真菌—細菌的固定化。

生物炭作為一種新型環境材料，由于其特殊的多孔性結構、強的吸附性能，以及富含多種營養元素和特殊官能團等特點，在受污染環境修復方面具有巨大的應用潛能（Ahmed et al.，2016；李曉娜等，2017；Kumar et al.，2018；Gorovtsov et al.，2020；Bianco et al.，2021）。通過控制生物炭的前體物、熱解溫度、熱解時間能獲得結構、孔容、比表面積、pH 值、持水性、密度、灰分含量等理化性質和吸附能力各異的生物炭（劉亮，2015；Agegnehu et al.，2017；Yasir et al.，2020）。生物炭具有很高的化學穩定性而且難以被微生物降解。生物炭可以優化微生物的棲息地，改變土壤的酶活以及減少污染物對微生物的毒性，國內外已有采用生物炭負載PAHs降解菌修復PAHs 污染土壤方面的研究，并將較好的修復效果歸因于生物炭載體的吸附鎖定作用和固定化菌劑的生物降解作用（王銀善，2010；Yang et al.，2021）。Garcia-Delgado et al.（2015）研究發現秸稈生物炭負載P.ostreatus對菲的修復效率相比于P.ostreatus的修復，提高了19%，任靜（2020）發現棉桿生物炭（MG）和稻殼生物炭（DK）對降解菌Martellsp（AD-3）固定化后，在PAHs 溶液中的降解效果較好，16 h 后，MG、DK 固定化AD-3對Phe 的去除率分別為92.40%、64.09%，對蒽的去除率分別為65.69%、30.91%。熱解后的生物炭表面含有大量的碳氫化合物質，這些物質可以發送信號分子（Graber et al.，2010），并被微生物所吸收（Farrell et al.，2013)。但是，這些應用還處于探索階段，而且大多針對單一類型生物炭，缺乏不同原料生物炭的選配和組合研究，生物炭功效未能有效發揮。因此，有必要根據土壤理化性狀和修復目標選擇適宜的生物炭載體類型，加強應用研究，實現生物炭功效的最大利用。

在耐冷PAHs 優勢菌修復土壤PAHs 污染過程中，選擇工農業廢棄物為前體物制備生物炭，采用生物炭為固定化載體基材，即可促進降解菌的活性和數量，又可改善土壤理化性質（如持水性、透氣性以及pH 等），提高土壤PAHs 遷移性和生物有效性。在田間條件下，進入土壤的生物質炭自身不穩定組分會發生轉化、淋溶，并與土壤發生相互作用出現老化現象，導致生物質炭的化學與物理性質發生顯著變化（Burrell et al.，2016；He et al.，2021）。生物質炭在土壤中的老化會導致有機污染物的吸附—解吸行為發生改變，且受土壤、生物質炭以及污染物性質的影響較大（卿敬等，2017；Shaaban et al.，2021）。目前，有關如何利用不同類型生物炭的性能，促進生物炭固定化菌劑對土壤中PAHs 的降解及其強化作用機理方面的研究尚未見報道。

本文選用玉米芯、松木屑等工農業廢棄物為前體物，分別制備300 ℃和500 ℃不同熱解溫型生物炭，并對這4 種生物炭（玉米芯300 ℃、玉米芯500 ℃、松木屑300 ℃和松木屑500 ℃）進行十字交叉混配，通過對比不同類型生物炭理化性質，優選出比表面積和孔隙較大的混合型生物炭（C500+W500）作為微生物固定化載體，通過混合生物炭與土壤對Phe 的競爭吸附，探究生物炭對老化土壤中有效態PAHs 遷移過程的影響；以耐冷假單胞菌（Pseudomonassp.，S4）與高山被孢霉（Mortierellaalpine，J7）為PAHs 降解混合菌，采用吸附固定化方法制備生物修復材料，并研究固化了混合菌的混合型生物炭與單一類型生物炭對土壤PAHs 降解性能，從生物炭載體微界面結構特征，以及土壤有效態PAHs 含量隨修復時間的變化特征等角度，揭示生物炭在土壤中PAHs 微生物降解過程中的機理與優勢作用，為進一步開展寒冷地區PAHs 污染土壤的微生物修復研究和工程應用，發展經濟、高效、安全的土壤有機污染修復的實用技術，生產安全農產品提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物炭

生物炭前體物為玉米芯（C）、松木屑（W）生物質，購自沈陽市某農產品加工廠，玉米芯（C）為60 目（孔徑0.250 mm），松木屑（W）為20 目（孔徑0.850 mm）。

1.1.2 供試土壤

選用中國科學院沈陽生態試驗站0—20 cm 表層清潔土，為草甸棕壤，基本理化性狀：pH 為7.30，有機質含量為4.62%（質量分數，下同），全氮為0.30%，總碳1.70%。

1.1.3 供試菌種與培養基

假單胞菌（Pseudomonassp.，S4）（GCMCC NO.14048）和高山被孢霉（Mortierellaalpine，J7）（GCMCC NO. 15183）是由本課題組于2019 年自主篩選并鑒定的耐冷高效PAHs 降解菌。

完全培養基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，葡萄糖10.0 g，氯化鈉5.0 g，pH 7.0—7.2，以蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌25 min，固體培養基另加瓊脂粉20.0 g·L-1。

增殖培養液：蔗糖4.0 g，酵母膏3.0 g，KH2PO40.5 g，(NH4)2HPO42.0 g，MgSO4·H2O 0.25 g，pH 6.0—6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 試劑

氯化鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）、二氯甲烷（分析純，成都市科隆化學品有限公司）、丙酮（分析純，成都市科隆化學品有限公司）、乙腈（色譜純，Sigma-Aldrich 公司）、PAHs標準品（優級純，廣州碩譜生物科技有限公司）、菲（Phe，純度＞95%，百靈威CK 公司）和芘（Pyr，純度＞98%，百靈威CK 公司）。

1.1.5 儀器與裝置

高效液相色譜儀（1200 Series，色譜柱為C-18柱ZORBAX Eclipse，安捷倫科技（中國）有限公司）、掃描電子顯微鏡（Phenom ProX，荷蘭Phenom-World 公司）、全自動比表面積及空隙度分析儀（TriStar II 3020 2.00，美國Micromeritics）、元素分析儀（VARIOELIII，德國Elementar）、高速冷凍離心機（JW-2019HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司）、渦旋振蕩器（VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、超純水機（50131922，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A，上海精宏實驗設備有限公司）、數控超聲波清洗器（KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司）、冷凍干燥機（FD-1C-50，北京博醫康實驗儀器有限公司）、電冰箱（BCD-290W，青島海爾股份有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物炭的制備與表征

采用限氧控溫炭化法制備生物炭，制備過程如下：將玉米芯（C）、松木屑（W）自來水沖洗3 次后，再用蒸餾水沖洗2 次，放置風干2 d，再放入75 ℃烘箱中烘干后，裝入鐵罐中（直徑1 cm，長3 cm）壓實生物質，通入氮氣，直至里面無氧氣，放置馬弗爐中，以10 ℃·min-1升溫至預設溫度（300、500 ℃），然后炭化4 h，待冷卻至室溫后取出，待用。將各溫度下熱解制成的生物炭樣品分別標記為C300、C500、W300、W500。

生物炭酸堿性測定：準確稱取一定質量的生物炭，以質量分數1∶20 比例與超純水混合，振蕩0.5 h后離心靜置取出上清液，使用pH 計測定生物炭pH值（GB/T 12496.7—1999）。

生物炭吸水能力測定：準確稱取一定質量的生物炭，以質量分數1∶20 比例與超純水充分搖勻，置于超聲波機中振蕩24 h 后，抽去多余的水分，然后稱取生物炭+水的質量。吸水量=(生物炭+水的質量)-生物炭質量。

采用VARIOELIII 元素分析儀測定生物炭樣品中C、H、N、O 等元素含量。

采用TriStar II 3020 2.00 全自動比表面積和孔隙度分析儀，測定6 種生物炭的介孔。將生物炭樣品以氮氣吸附介質，300 ℃或500 ℃下脫氣6 h 后，放置于77 K液氮中測定生物炭樣品的比表面積和孔隙結構。

按照參考文獻（蘇丹，2007）的方法對生物炭樣品進行前處理，并采用Phenom ProX 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生物炭的結構與孔隙結構。

1.2.2 混合型生物炭加載耐冷混合菌的制備及其微觀結構表征

采用吸附法制備固定化混合菌顆粒，將S4 和J7，按體積比1∶1，在完全培養基中分別接種，設置溫度為15 ℃，設置搖床為120 r·min-1，使混合菌在搖床上混合培養3 d，制得菌劑。將不同類型生物炭按質量分數1∶1 混合放入高壓滅菌鍋，121 ℃，60 min。按質量分數1∶1 將滅菌的生物炭混合物用增殖培養液浸泡，在15 ℃下培養3 d，制得生物炭加載耐冷高效降解PAHs 生物修復材料。

按照參考文獻（蘇丹，2007）的方法對固定化混合菌樣品進行前處理，并采用Phenom ProX 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察固化了微生物的混合型生物炭微觀結構。

1.2.3 生物炭與土壤對典型PAHs 的競爭吸附

優選比表面積和孔隙較大的混合生物炭（C500+W500）作微生物固定化載體，通過混合生物炭與土壤對典型PAHs—Phe 的競爭吸附，探究生物炭對老化土壤中有效態PAHs 遷移過程的影響。

將土壤置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌60 min，烘干土壤。精確稱取4.0 g 土（CK-Soil）、0.02 g 生物炭（CK-Biochar）、4g 土+0.02 g 生物炭（CW），分別投入到10 個含有100 mL·L-1的PAHs 的錐形瓶中，置于搖床中，25 ℃，100 r·min-1避光條件下振蕩，分別于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min 取樣，離心，過0.45 μm 纖維濾膜，分別提取液體與土壤中PAHs，并用測定其含量。生物炭對Phe 的吸附量由差減法獲得。

1.2.4 土壤修復實驗設計與實施

實驗設置8 個處理，詳見表1。每種處理3 個平行，試驗重復2 次。將修復實驗用土壤過2 mm篩后，分裝培養瓶中，每瓶10 g，121 ℃高溫滅菌60 min，冷卻后每瓶定量加入Phe 或Pyr 的丙酮溶液，使其初始質量分數均為100 mg·kg-1，放置過夜，接種固定化混合菌劑，隨時補加無菌水，使土壤水分為40%，在15 ℃下避光培養，分別在0、10、20 和30 d 取樣測定土壤中PAHs 的殘留量。

表1 土壤修復效果實驗的處理設置Table 1 Treatment design for the soil remediation effect experiment

1.2.5 土壤中可提取態PAHs 含量的測定

采用超聲振蕩抽提法，所用凈化柱為硅酸鎂凈化柱（李娜等，2016；Blatt-Janmaat et al.，2020）。將土樣置于50 mL 玻璃瓶中，加入15%氯化鈉，15 mL 二氯甲烷、20 mL 丙酮，震蕩16 h，轉速設定120 r·min-1，溫度25 ℃。取出靜置1 h。分層，下層水相，上層有機相。取出上層液體轉移至硅酸鎂凈化柱中凈化，通風櫥揮發3 h 至無液體，加入2 mL乙腈，放入小超聲機震蕩1 min，用注射器通過0.22 μm 有機濾頭過濾注射到液相小瓶里，標號，待測。

PAHs 含量用HPLC 法檢測。通過熒光及紫外檢測器對樣品進行檢測分析，水、乙腈為流動相，測定Phe 選用V(乙腈)∶V(水)＝75%∶25%，測定Pyr選用V(乙腈)∶V(水)＝60%∶40%。按梯度進行洗脫，柱溫30 ℃，流速為1 mL·min-1，進樣量10 μL。根據色譜峰保留時間定性，Phe 的保留時間為3.1—3.3 min，Pyr 的保留時間為5.8—6.1 min。采用外標法定量，Phe 的回收率72.56%—90.48%，Pyr 的回收率為68.48%—89.21%。

1.2.6 數據處理

利用單因素方差分析（ANOVA，LSD）分析PAHs 含量間差異。采用SPSS 22.0 進行統計分析，Origin 2017 進行處理擬合并作圖。

生物炭及土壤對Phe 的吸附量，采用BoxLucasl準一級動力學方程和準二級動力學方程對所獲取的數據進行擬合，明確生物炭吸附過程中的吸附機制，線性公式如下：

準一級動力學方程：

準二級動力學方程：

其中：

Qt——t時間的吸附量，μg·mg-1；

Qe——平衡吸附量，μg·mg-1；

k1——準一級吸附動力學常數，min-1，

k2——準二級吸附動力學常數，μg·(mg·min)-1。

2 結果和分析

2.1 生物炭的基本理化性質

2 種材料2 個熱解溫度下生物炭酸堿性、吸水能力、比表面積、總孔空容與平均孔徑如表2 所示。4 種生物炭均為弱堿性，其中C300 pH 最高，為10.13，W500 pH 最低，為8.18。吸水性強的生物炭可以為附著的微生物提供更好的棲息地環境，吸水能力最好的生物炭是松木屑，W500 每克可吸水3.85 g，W300 每克可吸水3.46 g，其余生物炭吸水量均在1.2 g·g-1左右，可見松木屑生物炭顯著高于其他材料的生物炭，更適合作為固定化微生物的載體。

表2 生物炭的pH、吸水能力、比表面積、總孔孔容、平均孔徑Table 2 pH, water absorption capacity, Specific surface area,total pore volume and average pore diameter of biochar

生物炭根據孔徑分為微孔、介孔、大孔結構（Pietik?inen et al.，2000），范圍分別為0—2、2—50、50 nm 以上，根據孔徑范圍可知4 種生物炭的結構均為介孔結構，其中W300 的平均孔徑最大，為9.43 nm，W500 平均孔徑值最小為2.28 nm，C300與C500 的平均孔徑介于中間，分別為6.20 nm 與4.96 nm。

生物炭孔隙體積較大時，微生物更有可能進入生物炭孔隙并利用其中的養分，此外，具有較大孔隙體積的生物炭更有利于體積較小且生長速率較快的微生物進入其中生長發育（Kasozi et al.，2010）。因此，較大孔隙生物炭更適合作為微生物載體基材。由表1 可知，4 種生物炭孔容最大的為C500（4.45 cm3·g-1）、其次為W300（4.32 cm3·g-1）。

生物炭比表面積的大小可影響微生物在生物炭表面上的生長與繁殖（Bolan et al.，2023），大的比表面積可為微生物創造更多的生存空隙以及吸附點，小的比表面積增大了微生物的空間及養分的競爭力。由表1 可知，C500 比表面積最大，為3.59 m2·g-1，較其它生物炭可以促進微生物的生長以及與更多的有機物接觸（Warnock et al.，2001；Shor et al.，2003），其次為W500 的比表面積為2.92 m2·g-1。

生物炭是生物質在限氧熱解條件下產生的，表3列出了生物炭的元素組成。由表3 可知，隨著熱解溫度的升高，2 種材料生物炭中有機組分的C 含量逐漸增多，玉米芯生物炭由74.17%到83.70%，松木屑生物炭由72.86%增到88.14%。其中W500 碳含有率最高，為88.14%，B300 的碳含有率較W500 低18.27%，其它生物炭的含碳率在72%—83%。

表3 生物炭的元素組成Table 3 Elemental analysis of biochar

生物炭的w(C)/w(H)可以反映有機質的碳化、芳香化程度（Qian et al.，2016；劉偉鵬，2018），且芳香化程度隨著w(C)/w(H)變化而變化。由表3 可知，4 種生物炭w(C)/w(H)比值均在16 以上，4 種生物炭芳香性結構都較高，w(C)/w(H)值最大為C500，其w(C)/w(H)值為46.25，其次為W500，其w(C)/w(H)值為37.01，略低于C500。由于生物炭芳香環間電子不規則的分配，使生物炭電子發生了變化，電子的變化引起了π 電子介質的變化，π 電子與有機物中的π 電子結合，進而產生共軛作用促進生物炭吸附有機物。由此可見，4 種生物炭對有機污染物吸附能力均較強。

w(C)/w(N)值會影響微生物的生存與生長，當w(C)/w(N)的比值在25 附近，可以促進微生物的生存與生長（李力等，2011）。在系統處于C 多N 少的情況下，環境中缺少N 會導致微生物活性減小。由表3 可知，C300 的w(C)/w(N)比值較其它生物炭更接近25，其次為C500，說明C300 與C500 中的環境最合適微生物的生存與生長。

2 種生物炭2 種不同溫度下的表面結構（SEM）如圖1 所示。由圖1 可見，不同材料的生物質表面結構不同，玉米芯生物炭（圖1a、b）表面凹凸不平，C500 比C300 表面更加粗糙，褶皺更多，且具有更大的比表面積（表2），增加了對有機物吸附的可能性。松木屑生物炭（圖1c、d）排列錯綜雜亂無整齊的順序，表面褶皺多，W500 比W300 孔隙增多。500 ℃熱解下生物質可以清晰的看見生物炭表面覆蓋著一層白色碎屑，可能是由于灰分在表面堆積。

圖1 供試生物炭SEM 圖Figure 1 SEM of tested biochar

綜合以上生物炭的表征數據，混合型生物炭C500+W500 最適宜作為耐冷高效PAHs 降解混合菌的載體基材。

2.2 混合型生物炭固定化菌劑SEM 表征

圖2 為單一生物炭（C500 或W500）與混合型生物炭C500+W500 加載耐冷混合菌S4J7 后的表面微觀結構（SEM）。由圖2a 和圖2c 對比可知，混合型生物炭上真菌明顯增多，真菌的菌絲橫穿在生物炭的空隙中，有的直接吸附在生物炭表面。由圖2b 和圖2c 對比可知，真菌和細菌均吸附在生物炭上，混合型生物炭上真菌菌絲繁密，縱橫生長，隨著生長向外不斷延伸，菌絲的延伸可更好的接觸污染物。

圖2 修復材料固定化表面結構Figure 2 Immobilized mixed consortium observed by SEM

2.3 生物炭對典型PAHs的競爭吸附量及吸附動力學

通過混合生物炭（C500+W500）與土壤對典型PAHs-Phe 的競爭吸附，探究生物炭對老化土壤中有效態PAHs 遷移過程的影響，結果如圖3 所示。

圖3 生物炭與土壤對Phe 的吸附量Figure 3 Relationship between the amount of adsorption of Phe in biochar and soil with time

由圖3a 可見，第1 小時時CK-Biochar 吸附速率最快，為2.4 μg·mg-1·h-1，此后隨著時間增加，吸附速率逐漸降低，在第12 小時吸附到達平衡，平衡吸附量為4.47 μg·mg-1。由圖3b 可見，CWBiochar在前10 min 競爭吸附Phe 最快，為0.4 μg·mg-1·min-1，之后隨著時間增加，競爭吸附速率逐漸降低，在100 min 時達到吸附平衡，平衡吸附量為0.01 μg·mg-1。由圖3c 可見，前15 min，CK-Soil 對Phe 的吸附速率保持一致，為大致15 μg·g-1·min-1，隨時間變化，競爭吸附速率逐漸降低，至100 min 后達到吸附平衡，平衡吸附量為25.45 μg·g-1。CWSoil前15 min 對Phe 的吸附速率基本保持不變，大致為 14 μg·g-1·min-1，隨時間變化，競爭吸附速率逐漸降低，至100 min 后達到吸附平衡，平衡吸附量為2.03.46 μg·g-1。CW 與CK-Soil 對Phe 的競爭吸附趨勢基本一致，前10 min 競爭吸附速率達8.5 μg·g-1·min-1，此后時間增加，吸附速率逐漸降低，在100 min 處吸附平衡，平衡吸附量為26.46 μg·mg-1。

CK-Soil 比CK-Biochar 對Phe 的吸附速率高（圖3c），且平衡吸附量也高于CK-Biochar，可能是由于 CK-Soil 處理中的土壤添加量遠遠大于CK-Biochar 處理組中的生物炭添加量，而且生物炭的吸附機制與土壤對Phe 的吸附機制不同。生物炭的吸附機制主要包括分配作用、表面吸附作用等，CWBiochar對Phe 的吸附量比CK-Soil、CK-Biochar都小，可能是因為土壤與生物炭在競爭吸附Phe。CWBiochar對Phe 的吸附量明顯減少，可能是因為土壤的吸附作用使CW 中Phe 的濃度大量減少。在Phe的競爭吸附中CW、CWSoil與CK-Soil 曲線趨勢基本相同，平衡吸附量由大到小的關系為 CW＞CK-Soil＞CWSoil。說明生物炭投加至土壤，吸附劑的整體比表面積增大，吸附量增加，但由于競爭吸附力的存在，吸附劑土壤對Phe 的吸附量減少。CWBiochar與CWSoil相比，平衡吸附量相差較大，這與生物質和土壤物理性質等因素有關。

為了探究生物炭對老化土壤中有效態PAHs 遷移過程的影響，研究了混合生物炭與土壤對典型PAHs-Phe 的競爭吸附，并分別采用一級動力學和二級動力學模型對生物炭（CK-Biochar）、土壤（CK-Soil）、生物炭加土壤（CW）吸附Phe 的動態過程進行了擬合，擬合結果見表4。由表4 可知，CK-Biochar 與CWBiochar對Phe 的吸附作用可以用準二級動力學模型進行描述，擬合效果優于準一級動力學模型；CK-Soil、CW 與CWSoil對憎水性化合物的吸附與準一級動力學模型一致。準二級動力學模型建立在吸附速率限制基礎上，是一種化學吸附，在吸附劑與吸附質之間存在電子共用或電子轉移（李文靜等，2016；高如琴等，2019）。準一級動力學模型是理想模型，其主要對整個吸附過程擬合，但實際吸附有多種控制步驟（Zhu et al.，2014；王彤彤等，2017），而準二級動力學模型包含了液膜擴散、顆粒內擴散和化學反應等吸附的所有步驟，所以準二級動力學模型比準一級動力學模型擬合度要高，更適合描述生物炭吸附Phe 的過程。

表4 生物炭吸附動力學擬合參數Table 4 Parameters obtained from pseudo-first-order kinetics model, pseudo-second-order kinetics model for Phe adsorption on biochar and soil

2.4 不同修復方式對PAHs 的降解性能

以耐冷假單胞菌（Pseudomonassp.，S4）與高山被孢霉（Mortierellaalpine，J7）為PAHs 降解混合菌，采用吸附固定化方法制備生物修復材料，并研究固化了混合菌的混合型生物炭與單一類型生物炭對土壤Phe 與Pyr 的降解性能，結果如圖4 所示。

圖4 不同處理修復后土壤中菲（a）與芘（b）的含量Figure 4 Phe (a) and Pyr (b) degradation rate of soil sample with different methods

由圖4 可知，生物炭加載微生物組（CWJ1:1、CWJ1:2、CWJ2:1）的降解效果均優于游離菌（J），30 d 后CWJ2:1 組對Phe（圖4a）、Pyr（圖4b）的去除率分別為51.87%、45.28%，分別高于游離菌（J）25.81%、23.65%。生物炭固定化菌劑可促進土壤中PAHs 的降解，使微生物的活性增強，并使微生物能夠在復雜的環境中進行高效的工作。任靜等（2020）發現棉桿生物炭（MG）和稻殼生物炭（DK）對降解菌Martellsp.（AD-3）固定化后，MG、DK固定化AD-3 對Phe 的去除率分別為92.40%、64.09%，對蒽的去除率分別為65.69%、30.91%。Su et al.（2006）選取玉米棒固定化真菌修復PAHs污染的土壤，發現固定化對污染土地降解PAHs 效果明顯。鞏春娟（2018）采用蛭石為載體吸附法固定微生物，60 d 后對土壤中Phe、Pyr、苯并芘（Bap）降解率分別為64.38%、48.71%、40.19%。

同時，由圖4 可知，與單一生物炭固定化菌的修復效果相比，混合型生物炭為載體的固定化菌的修復效果更優，混合型生物炭組的修復效果與生物炭的混合比例有關?；旌闲蜕锾緾WJ2:1 組30d后對Phe（圖4a）、Pyr（圖4b）的去除率比單一生物炭W 固定化組的去除率分別高18.96%、16.07%,比單一生物炭固定化組的去除率分別高15.63%、13.62%?；旌仙锾緾WJ2:1 對Phe 的降解高于CWJ1:1 與CWJ1:2，因為生物炭含量影響土壤中PAHs 的吸附效果。CWJ2:1 中含有較多的500 ℃玉米芯生物炭，500 ℃玉米芯生物炭因為比表面積與空隙體積大，所以更適合微生物生存，且更有利于對有機物的吸附。

將可降解PAHs 耐冷真菌與細菌聯合固定在生物炭載體上，構建生物炭加載真菌-細菌體系，是提高土壤PAHs 生物有效性的最佳技術途徑之一。生物炭-真菌-細菌構建起的微環境作為緩沖體系，可有效屏蔽土著微生物的競爭作用和不利土壤條件的侵害作用，從而保證耐冷高效降解PAHs 微生物的良好生長；同時，耐冷PAHs 降解真菌-細菌共生體系，可充分發揮微生物生物質對土壤PAHs 活化吸附與協同降解雙重作用，提高微生物生物質吸附態PAHs 生物有效性；此外，生物炭載體作為吸附劑還可以有效地富集土壤中PAHs，促進土壤中PAHs 進入生物相，可提高土壤顆粒吸附態PAHs 與載體吸附態PAHs 生物有效性；另外，生物炭通過改善土壤理化條件，亦可提高降解PAHs 的微生物活性。

3 結論

1）隨著熱解溫度的升高，生物炭比表面積增大，炭化程度變強，灰分含量升高。4 種生物炭均為介孔結構，其中C500、W500 比表面積較大，分別為3.59、2.92 cm3·g-1；C300 的生物炭的w(C)/w(N)比值最接近25，其次為C500。綜合考慮生物炭對有機污染物與微生物的吸附性能，選定C500+W500混合型生物炭為耐冷高效PAHs 降解混合菌的最適載體基材。

2）生物炭投加至土壤后，吸附劑整體比表面積增大，吸附量增加，但由于競爭吸附力的存在，土壤對Phe 的吸附量減少，在Phe 的競爭吸附中CK-Biochar、CK-Soil、CWSoil與CW 的平衡吸附量分別為0.01 μg·mg-1、25.45 μg·g-1、23.46 μg·g-1與26.46 μg·mg-1。生物炭對土壤中Phe 的競爭吸附過程更好的接近于準二級動力學模型。

3）30 d 后CWJ2:1 組對Phe、Pyr 的去除率分別為51.87%、45.28%，分別高于游離菌25.81%、23.65%，高于單一生物炭固定化組高15.63%—18.96%、13.62%—16.07%，表明生物炭起到了促進耐冷混合菌對土壤PAHs 修復的作用，而且混合型生物炭對微生物降解的促進作用優于單一型生物炭。