低溫處理對桃種子貯藏物質及抗氧化酶活性的影響

侯小進,張夢,劉克帥,蔡祖國,陳瑩瑩,王保全

（1.河南科技學院園藝園林學院,河南 新鄉 453003；2.新鄉市果樹研究所,河南 新鄉 453006）

桃為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus L.）的落葉喬木[1],花期為3～4 月,果實成熟期因品種不同而異.桃原產于我國,在河南、河北、浙江、江蘇、山東等地區均有栽培.一般北方地區的桃多為硬桃,南方地區的桃多為軟桃[2].桃喜光,不耐陰,適宜較溫和的氣候條件,多生長在光照良好的地方；耐寒、耐旱能力強,忌澇；繁殖方式主要采用嫁接繁殖,可芽接,技術要求高.桃果實中維生素E 含量較高,可抑制眼睛晶狀體內的過氧化脂反應,從而預防近視[3].

隨著生物技術和種質資源的不斷發展,植物種子的保存和利用變得愈發重要.在生物學領域,種子作為植物的生殖器官,是保持植物種群進化的載體,同時也是植物繁衍后代的關鍵.作為植物的重要組成部分,種子內部含有一定的養分和活性成分,這些成分能夠為植物發芽、生長等各個階段提供必需的能量及營養物質.

種子休眠是高等植物普遍存在的現象,是植物長期在特定環境中形成的一種適應性[4],這可能是由于受種皮[5]和抑制物質[6]的影響所致.桃種子同樣存在休眠[7],低溫處理是目前解除桃種子休眠最常用并且最有效的方法,可以提高其酶活性,從而解除休眠[8-9].種子的休眠及萌發與種子的能量動態顯著相關,因此研究桃種子在低溫層積解除休眠過程中蛋白質、糖等主要貯藏物質含量和相關酶活性的變化規律,可為實現桃種子種胚發育和萌發進程提供重要的理論支撐.相關研究表明,溫度對種子萌發和生長有很大的影響,尤其是低溫處理對種子的影響較為顯著,在層積處理過程中種子的貯藏物質及抗氧化酶活性會發生一些變化.在4 ℃的低溫環境下,種子可以保持相對較高的活性,同時也可以降低種子的呼吸強度和代謝速率.在低溫處理過程中,種子能完成種胚成熟,在其內部也會發生一系列的變化,使得種子吸水能力加強,將不溶性的內含物轉化為可溶性的簡單物質.這主要是因為低溫處理能夠有效地促進種子解除休眠,增強植物的抗逆性及抗病性能,同時也能提高種子品質.因此,低溫處理在植物產業的發展中具有重要的應用價值.本文旨在研究低溫處理對桃種子可溶性蛋白、可溶性糖含量以及SOD、POD 和MDA等指標的影響,以期為提高桃種子的質量和活性提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的“錦香”和“秋彤”桃種子,均來自河南省新鄉市衛輝市蟠桃園.

1.2 材料處理

將完全成熟的“錦香”和“秋彤”果實進行處理.首先,將果肉去除,取出桃核并將其外面的果肉剔除干凈,放在清水中清洗干凈,隨后放置在陰涼、干燥、通風處,自然堆漚.其次,選擇大小形態顏色一致且飽滿的桃核進行去硬核處理,將桃種放入清水中浸泡24 h 使之充分吸水,用濕毛巾包裹桃種置于穴盤中,于2023 年2 月1 日放入4 ℃冰箱.期間經常檢查并補水,分別于15 d、30 d、45 d、60 d 各取一次樣,以未進行低溫處理的種子為對照,分別記作CK、15 d、30 d、45 d、60 d.每次取樣為30 個桃種,取樣后去種皮液氮磨樣,置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用.

1.3 試驗試劑

Na2HPO4、NaH2PO4、濃H2SO4、30%H2O2、愈創木酚混合液、核黃素、蛋氨酸、氮藍四唑、TCA（三氯乙酸）、TBA（硫代巴比妥酸）等.

1.4 測定指標

采用考馬斯亮藍法G250 測定可溶性蛋白含量,采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量,采用氮藍四唑法（NBT 法）測定超氧化物歧化酶（SOD）含量,采用比色法測定過氧化物酶（POD）含量,采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量.

1.5 數據處理

采用Excel 2016 對試驗數據進行整理和分析,每個樣品設置3 個重復,數據結果用平均值±標準偏差表示,然后用DPS 軟件對數據進行差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 種子低溫處理過程中貯藏物質的變化

2.1.1 可溶性蛋白含量變化植物的種子以蛋白質和糖類的形式貯藏營養物質,在種子萌發以及幼苗生長初期可以作為能量的來源.在低溫處理過程中,桃種子仍然保持著一定的呼吸作用,其體內的物質會發生分解和復雜的貯藏物質轉化等.

圖1 結果表明,“錦香”在4 ℃低溫處理過程中蛋白質含量整體呈先下降后上升的趨勢,在低溫處理的15 d 蛋白質含量顯著下降,到30 d 以后又開始上升,45 d 時達到高峰.與CK 相比,15 d、30 d 分別下降28.4%和15.7%,差異顯著.而45 d 上升3.1%,60 d 下降1.3%,其45～60 d 蛋白質含量變化不明顯,無顯著差異.“秋彤”在低溫處理過程中蛋白質含量變化與“錦香”不同,其變化趨勢沒有明顯規律,蛋白質含量15 d 時先上升,30 d 時下降到最低值,45 d 開始上升,60 d 又趨于下降.其蛋白質含量與CK 相比,15 d 上升3.5%,30 d 下降12.6%,45 d 上升8.0%,60 d 下降6.1%,與CK 差異均未達到顯著水平.

圖1 低溫處理對桃種子可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of lowtemperature treatment on soluble protein content of peach seeds

2.1.2 可溶性糖含量變化可溶性糖作為一種貯藏物質,能夠為胚芽提供能量和碳源,支持胚芽的生長和發育.在桃種子中,可溶性糖的含量受多種因素如生長環境、種子品種、收獲條件等的影響.一般而言,在一定范圍內種子中可溶性糖的含量越高,胚芽的萌發率越高.

由圖2 可知,“錦香”在4 ℃低溫處理過程中整體呈現下降的趨勢,對照的可溶性糖含量最高,隨著低溫層積時間的增加,可溶性糖含量逐漸降低,60 d 時達到最低.可溶性糖含量與對照相比,15 d 時變化較小,僅降低11.2%,未達到顯著水平.30 d 時降低14.0%,但是,低溫處理的45 d 和60 d,波動較大,分別降低80.9%和84.2%,達到極顯著差異水平.“秋彤”在低溫處理過程中可溶性糖含量變化規律和“錦香”相同,都呈現下降的趨勢,但有一點不同的是,整體含量變化較小,在低溫處理的15 d 時僅下降1.1%,30 d 時下降2.3%,4 5d 時下降2.9%,而在低溫處理的60 d 時降低5.8%,此時可溶性糖含量最低,與對照均無顯著差異.

圖2 低溫處理對桃種子可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of lowtemperature treatment on soluble sugar content of peach seeds

綜上所述,從圖2 可看出可溶性糖含量隨著層積處理時間的延長其含量逐漸降低,表明在無低溫脅迫的情況下,種子萌發率最高,隨著低溫處理時間的延長,胚芽的萌發率會逐漸降低.此研究結果為桃種子萌發障礙提供了現實的依據.

2.2 種子低溫處理過程中抗氧化酶活性的變化

2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性變化SOD 是一種重要的抗氧化酶,它能夠將超氧自由基轉化為過氧化氫（H2O2）,從而減少活性氧的產生.此外,SOD 也能夠與其他抗氧化酶協同作用,保護細胞免受氧化損傷.在本研究中,低溫處理對SOD 活性的影響,可反映種子對環境脅迫的響應能力.

圖3 結果表明,“錦香”在4 ℃低溫處理過程中,隨著層積時間的延長,SOD 活性逐漸下降,在45 d 時SOD 酶活性又開始增加,60 d 時酶活性降到最低,所以整體表現為下降- 上升- 下降.與對照相比,15 d 和45 d 時SOD 酶活性分別下降26.8%和35.5%,60 d 時酶活性最低,下降57.0%.其差異均與對照存在極顯著差異.“秋彤”在低溫處理過程中,30 d 時酶活性達到最高,與對照相比僅增加9.7%,45 d 時最低,降低31.1%,6 0 d 時下降8.7%.整體表現為下降- 上升- 下降- 上升,整體變化波動較大.與對照相比15 d、30 d、60 d 未達到顯著水平,而45 d 存在極顯著差異.

圖3 低溫處理對桃種子SOD 活性的影響Fig.3 Effect of lowtemperature treatment on SOD activity of peach seeds

2.2.2 過氧化物酶（POD）活性變化POD 是一種抗氧化酶,主要存在于植物細胞的質壁分界處,可以清除細胞內過氧化物,減輕環境脅迫帶來的氧化損傷.POD 活性的變化,可以反映桃種子細胞壁的抗氧化能力和低溫適應性.

由圖4 可知,“錦香”在4 ℃低溫處理過程中,POD 活性隨著低溫處理時間的延長逐漸上升,對照POD酶活性最低,在45 d 時達到高峰,增長272.3%,存在顯著差異.其酶活性與對照相比在15 d 和30 d 時無顯著差異,分別增加17.1%和9.8%.“秋彤”在低溫處理過程中,POD 活性表現出上升- 下降- 上升的規律,對照POD 活性最低,在15 d 時顯著增加,其POD 活性增加159.8%,在30 d 時增加28.5%,其活性與15 d 時相比顯著下降,而在45 d 和60 d 時增加.綜上可知,“錦香”和“秋彤”的POD 活性都表現出最低,呈現出共同的特點.

圖4 低溫處理對桃種子POD 活性的影響Fig.4 Effect of lowtemperature treatment on POD activity of peach seeds

2.2.3 丙二醛（MDA）含量變化MDA 是脂質過氧化物的代表物質之一.桃種子中含有MDA,因為桃種子中含有脂質,脂質有可能會在存儲或處理過程中發生氧化反應,產生MDA 等脂質過氧化產物.因此,在對桃種子進行保鮮和貯藏等過程中,需要注意避免氧化反應的發生,以降低MDA 等脂質過氧化產物的含量.

由圖5 可知,“錦香”在4 ℃低溫處理過程中,表現為上升- 下降- 上升的變化趨勢,在45 d 時下降到最低值,60 d 時又有顯著上升,且達到最高值.MDA 含量與對照相比,45 d 時下降49.1%,60 d 時上升136.44%,差異顯著.“秋彤”在低溫處理時MDA 含量變化趨勢與“錦香”不同,整體表現為先下降后上升的變化規律,對照MDA 含量最高,30 d 時達到最低值,與對照相比下降28.8%.整體變化波動較小,說明“秋彤”MDA 含量對低溫反應不敏感,無顯著差異.

圖5 低溫處理對桃種子MDA 含量的影響Fig.5 Effects of lowtemperature treatment on MDA content of peach seeds

3 結論與討論

3.1 結論

本試驗中,“錦香”和“秋彤”可溶性蛋白經過低溫處理后先下降,分別在低溫處理的30 d 和45 d 開始上升,均在45 d 時達到最大值,而后下降.蛋白質含量增加是由一些應激響應蛋白受到低溫等環境刺激所造成的.可溶性糖含量隨低溫處理時間的延長而下降,原因是種子內的可溶性糖被分解為其他產物.

SOD 與對照相比均呈現為下降趨勢,分別在45 d 和30 d 時酶活性為最低,POD 表現為上升- 下降-上升- 下降,但經過低溫處理POD 酶活性均高于對照.“錦香”MDA 含量在低溫處理60 d 表現為上升,“秋彤”表現為下降,其整體變化甚微,但都在45 d 時酶活性最低.低溫處理可能會改變細胞膜的特性,從而影響其活性.

3.2 討論

植物低溫處理的研究一直備受關注,特別是在農業、林業等領域具有重要的地位[10].上述研究表明,可溶性蛋白、可溶性糖作為植物滲透調節物質,通過分解或積累物質達到調節細胞滲透平衡的作用,從而緩解低溫對植物造成一定的傷害[11].可溶性蛋白是桃種子中的重要成分,是桃種子生長和發育過程中必不可少的營養物質；低溫處理對桃種子貯藏物質含量產生一定的影響,“錦香”和“秋彤”種子都在低溫處理的45 d 時達到最高值,60 d 時與對照相比又下降, 這與色木槭和茶條槭可溶性蛋白含量變化相一致[12],在45 d 時升高可能是低溫處理后與種子萌發相關的蛋白增加,而較長時間低溫處理會導致桃種子內細胞代謝減緩,因此可溶性蛋白的含量下降.“錦香”和“秋彤”可溶性糖含量變化規律完全一致,都呈現出下降的趨勢.這與廖云嬌[13]等對東北紅豆杉、李秋琦等[14]與黃儒珠等[15]對南方紅豆杉的研究結果不一致.低溫抑制了糖的合成和代謝過程,但與品種有關,“錦香”下降劇烈,“秋彤”變化較小.可溶性糖是一種重要的植物營養物質,在種子中也起到重要的作用,它是一類可以溶于水的糖類化合物,包括單糖、雙糖和多糖,在胚芽萌發的早期,可溶性糖會被轉化為葡萄糖,這也正是胚芽所需要的能量來源.總之,桃種子中的可溶性糖是一種重要的貯藏物質,其可溶性糖含量隨著低溫處理時間的延長逐漸降低,說明低溫會抑制糖的合成和代謝過程.一定范圍內,可溶性糖含量越高,種子萌發率越高[16].可溶性糖還具有調節作用,能夠影響植物的生長,因此可溶性糖的作用不可忽視.

在低溫處理過程中,桃種子SOD 變化規律各不相同.“錦香”種子在60 d 時活性最低,而“秋彤”種子在45 d 時最低.蔣麗娟等[17]認為,種子萌發率隨低溫層積時間的延長而增加,SOD 活性會逐漸下降.說明低溫處理導致SOD 蛋白質的構象發生變化,導致失去原有的抗氧化活性；在低溫環境下代謝緩慢,細胞及組織內的氧氣濃度增加導致氧化損傷.POD 活性與對照相比均表現為顯著的升高, 這與云南重樓POD 活性變化規律相一致[18],說明低溫處理促進桃種子POD 活性的提高.在低溫條件下,桃種子代謝緩慢,導致POD 底物積累, 同時也會改變桃種子內部的環境因素等.POD 活性的增高可以減輕低溫脅迫造成的損傷[19].同時POD 可以進一步清除H2O2,從而有效減少自由基對細胞膜造成的傷害[20].“錦香”MDA 含量在低溫處理的初期逐漸上升,45 d 時劇烈下降,60 d 時達到峰值,低溫處理引起桃種子細胞膜損傷和氧化應激,從而導致MDA 含量升高.此外,還可能導致種子代謝異常,對能量代謝和酶催化等過程產生干擾.“秋彤”MDA 含量則表現輕微下降,但整體處于平穩趨勢.低溫處理導致“錦香”MDA 含量上升,而“秋彤”表現為下降,其變化規律不同可能與品種有關.其MDA 具有很強的細胞毒性,也是衡量膜系統受害的重要指標[21].當植物體受到的損傷越大,其體內的MDA 含量越多[22].低溫處理可以提高桃種子中抗氧化酶的活性,包括過氧化物酶可以消除種子內部的自由基和有害物質,保護種子的細胞膜和細胞器的完整性,從而增強種子的抗逆性和耐貯存性.

總之,4 ℃低溫處理已經被證明是一種較為有效的方法.研究表明,采用4 ℃低溫處理可以防止桃種子的氧化變質.此外,4 ℃低溫處理還可以有效提高桃種子中多種抗氧化酶的活性,從而增強種子的抗氧化能力,提高其品質和營養價值.因此將4 ℃低溫處理應用于桃種子貯藏中,可以有效提高種子的儲存能力,為其后續的開發和利用提供更大的保障.同時,在對桃種子進行低溫處理時,需要綜合考慮種子發芽率、水分含量和質量損失、營養成分等因素的影響,以確保種子品質的穩定.同時,在實際生產中,應適當調整低溫處理的溫度和時間,以達到最佳的處理效果.

綜上,本研究為進一步探究低溫處理對桃種子的影響提供了新的思路,具體可以從以下方面展開研究：

（1）低溫處理時間的影響：目前研究的低溫處理時間一般較短,而長時間的低溫處理可能會對種子的存活和發芽產生不利的影響,因此需要進一步研究低溫處理時間對桃種子貯藏物質及抗氧化酶活性的影響.

（2）不同溫度處理的影響：除了4 ℃低溫處理外,設置不同的溫度處理也可能對桃種子的貯藏物質和抗氧化酶活性產生影響.

（3）深入探索低溫處理對桃種子存活率和萌發能力的影響機制.

（4）桃種子貯藏條件的優化：在桃種子的貯藏過程中,除了低溫處理外,還需要考慮其他的貯藏條件,如濕度、氧氣含量等,因此可以進一步研究不同貯藏條件對桃種子的影響以及如何優化貯藏條件,提高種子的存活和發芽能力.

這些研究方向將進一步深化低溫處理對桃種子影響的認識,為提高桃種子生產效率和質量提供更有力的理論指導,為桃的種植、貯藏和利用提供有益的參考和指導.未來還可以從多方面深入研究低溫處理的作用及機制,為果樹產業的發展提供更多支持,以推動行業的可持續發展.