小葉梔子再生體系的建立研究

劉海濤,劉玲,呂沙妹

（1.淮南師范學院生物工程學院,安徽 淮南 232038；2.資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室,安徽 淮南 232038）

梔子屬（Gardenia Ellis.）植物分布廣泛,在熱帶、亞熱帶及溫帶地區均有栽培或野生植株,具有觀賞[1]、藥用[2-7]、制作飲料[8]、提煉油脂和香料等多種用途[9],具有較大的開發潛力.小葉梔子（Gardenia jasminoidesEllis.var.radicans）為茜草科梔子屬植物中梔子（Gardenia jasminoidesEllis.）的一個栽培變種,為葉小濃密、花白具有濃郁香氣的常綠灌木,是優良的園林綠化景觀植物,應用前景廣泛.前人多利用有性、營養繁殖方式產生小葉梔子幼苗,但總體上成活率較低,難以滿足市場需求.

近年來,植物組織培養技術日趨成熟,已廣泛應用于農業[10]、園林[11]、園藝[12]、林業[13]、工業[14]和植物化學物質生產[15]等諸多領域.迄今為止,對于梔子屬植物再生體系的研究多見于利用莖段[16-17]、葉片[18]、果皮[19]、種子或種子團[20]等材料作為外植體進行組織培養以獲得再生植株的研究,而利用無菌葉片和頂芽做為外植體進行木本植物組織培養的研究較少.小葉梔子具有較高的研究價值及應用前景,但目前國內外利用組織培養建立再生體系的研究多集中在梔子屬其它物種,針對小葉梔子的離體快繁技術的研究鮮見.因此,本研究利用小葉梔子的無菌葉片和頂芽為外植體,通過不同質量濃度、種類的植物生長調節劑配比,以期建立小葉梔子的組織培養再生體系,為大規模擴繁小葉梔子幼苗提供理論參考與技術支持.

1 材料與方法

1.1 外植體的獲取

于2022 年5 月中旬天氣晴朗的上午10 時左右,在淮南師范學院小葉梔子培養基地的向陽面,采集生長健壯且無病蟲害的當年生具頂芽的小葉梔子枝條（長3 cm 左右）,放入收納盒后帶回實驗室；用剪刀去除枝條上、頂芽外部的葉片,5%洗衣液浸泡30 min 后,用清水沖洗數遍,直至無泡沫,用紗布包裹去葉頂芽,流水緩慢沖洗1 h,將雜質和灰塵清洗干凈,放置備用.

1.2 無菌無根苗的培養

于超凈工作臺（智誠ZHJH-C112B,購自北京創博環球生物科技有限公司）上,將前期處理好的頂芽置于無菌瓶中,75%的乙醇、0.1%的HgCl2溶液依次浸泡30 s、8 min,無菌水沖洗6 遍后用滅菌刀片切去木質化的莖段,保留0.5 cm 長的頂芽,分別置于50 mg/L 氨芐西林鈉+50 mg/L 硫酸鏈霉素的1∶1 混合溶液（處理1）和200 mg/L 的頭孢霉素溶液（處理2）（均購自北京索萊寶科技有限公司）中浸泡30 s 后接種于啟動培養基上,啟動培養基為不加植物生長調節劑的MS 培養基（pH5.8）,設置空白對照組.每組處理接種30 瓶,每瓶接種2 個頂芽.在無菌室內,培養環境為25 ℃、16/8 h（光照/黑暗）、光照強度1 500 lx.接種30 d 后統計外植體污染率.

1.3 愈傷組織誘導和增殖

以MS 為基本培養基,添加不同質量濃度的2,4-D（1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L）和6-BA（0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L）,兩種植物生長調節劑正交,共9 個處理（Y1-Y9）.在超凈工作臺上,將啟動培養基上生長的頂芽展開的無菌葉片切成大小約5 mm×5 mm 的小塊,將新長出的芽的底端切除一小部分,分別接種到愈傷組織誘導培養基中.每種處理重復15 次,每瓶接種2 個葉片或2 個頂芽.培養條件：25 ℃,遮光處理.定期觀察、統計兩種外植體最早出傷時間、愈傷組織狀況,并于出傷后2 周統計愈傷組織誘導率.在確定愈傷組織最佳誘導條件的基礎上,對誘導產生的愈傷組織進行增殖培養.培養條件同上.

1.4 愈傷組織分化

以MS 為基本培養基,添加不同質量濃度的NAA（0.03 mg/L、0.05 mg/L、0.08 mg/L）和6-BA（1.2 mg/L、1.5 mg/L、1.8 mg/L）,兩種植物生長調節劑正交,共9 個處理（F1-F9）.在超凈工作臺上,將誘導培養基上產生的愈傷組織切成5 mm×5 mm×5 mm 的小塊,接種至分化培養基上,進行分化培養.每種處理重復15次,每瓶接種2 塊愈傷組織.培養條件同上.出芽30 d 后統計愈傷組織分化率.

1.5 生根培養

以1/2 MS 培養基為基本培養基,添加不同質量濃度的NAA（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.15 mg/L）和IBA（0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L）,兩種植物生長調節劑正交,共9 個處理（G1-G9）.在超凈工作臺上,將分化培養基上分化出的芽從基部切下,轉接至生根培養基中,進行生根培養.每種處理重復15 次,每瓶接種2 個不定芽.培養條件同上.從第一瓶苗生根30 d 后統計再生苗生根率.

1.6 數據處理

用SPSS19.0 統計分析軟件對數據進行處理,利用SNK 法對數據均值進行多重比較,并對影響因變量的各因素進行Pearson 相關性分析.

2 結果與分析

2.1 不同抑菌劑對小葉梔子頂芽啟動培養的影響

不同質量濃度抗生素對外植體的雜菌抑制作用結果見表1.

表1 不同質量濃度抗生素對外植體的雜菌抑制作用Tab.1 Mixed bacterium inhibition of antibiotics with different concentrations on explant

由表1 可知,不使用抗生素的外植體污染率最高,達到了73.33%,處理2 次之,污染率達53.33%,處理1 的效果最好,污染率僅為25.00%.與處理1 相比,對照組和處理2 的污染率分別達到了處理1 的2.93 倍和2.13 倍.

對比三組處理的外植體生長狀況（圖1）可見,處理1 和對照組中的無菌苗生長狀況較好,處理2 中的無菌苗生長狀況相對較差,說明200 mg/L 的頭孢霉素對植物生長有一定的抑制作用.

圖1 不同抑菌劑下外植體的生長狀況Fig.1 growth statusof explant under different bacteriostatic agent

2.2 愈傷組織誘導和增殖

不同植物生長調節劑組合對小葉梔子愈傷組織誘導的影響結果見表2.

表2 不同植物生長調節劑組合對小葉梔子愈傷組織誘導的影響Tab.2 Effects of callus tissue induction of Gardenia jasminoides Ellis.var.radicans on different combination plant growth regulators

由表2 可知,去葉無菌頂芽的最快出傷時間在接種后的第10 d,而無菌葉片的最快出傷時間在接種后的第18 d.對兩種外植體的最早出傷時間和愈傷組織誘導率進行綜合分析可知,芽比葉片更適宜進行愈傷組織的誘導,且對于兩種外植體而言,2,4-D 質量濃度在3.0 mg/L 時,愈傷組織誘導率最高只達到60%；2,4-D 質量濃度為2.0 mg/L 時,各處理組愈傷組織誘導效果較好,2,4-D 保持最佳水平,6-BA 質量濃度設置0.5 mg/L,愈傷組織誘導效果最好.因此,兩種外植體最佳培養基配方組合皆為Y4 號處理（MS培養基+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA）,去葉無菌頂芽的愈傷組織誘導率可達93.3%,無菌葉片的愈傷組織誘導率亦可達90%,愈傷組織生長狀況和增殖狀況皆處于良好狀態（見圖2）.

圖2 無菌外植體誘導產生愈傷組織與愈傷組織增殖情況Fig.2 Callus tissue induction status under different sterile explant and callus tissue proliferation status

影響愈傷組織誘導率各因素方差分析結果見表3.

表3 影響愈傷組織誘導率各因素方差分析結果Tab.3 Between-subjects effects tests for influencing factors of callus tissue induction rate

由表3 可知,不同2,4-D質量濃度和不同6-BA質量濃度對愈傷組織誘導率均有極顯著影響（P＜0.01）.多重比較結果顯示,3 種2,4-D 質量濃度和3 種6-BA 質量濃度間的愈傷組織誘導率均存在極顯著差異（P＜0.01）.

相關分析結果見表4.由表4 可知：2,4-D 與愈傷組織誘導率的偏相關系數為-0.721*（P＜0.05）,兩者具有顯著負相關關系；6-BA 與愈傷組織誘導率的偏相關系數為-0.547（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系；2,4-D 與6-BA 的偏相關系數為-0.394（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系.

表4 愈傷組織誘導中控制各因素的偏相關分析結果Tab.4 Partial correlation analysis results of controlling factors in callus tissue induction

2.3 愈傷組織分化成芽

不同植物生長調節劑組合對小葉梔子愈傷組織分化的影響結果見表5.

表5 不同植物生長調節劑組合對小葉梔子愈傷組織分化的影響Tab.5 Effects of callus tissue differentiation of Gardenia jasminoides Ellis.var.radicans on different combination plant growth regulators

由表5 可知,當NAA 質量濃度為0.08 mg/L 時,愈傷組織分化率最高只達到43.3%,在此質量濃度下,6-BA 質量濃度設置為1.2 mg/L,愈傷組織分化率低至16.7%,說明6-BA 質量濃度過低,會嚴重影響NAA 作用的發揮；當NAA 質量濃度為0.05 mg/L 時,愈傷組織分化率普遍較高,在此質量濃度下,6-BA質量濃度設置1.8 mg/L,愈傷組織分化率最高,達到96.7%.因此,最適宜進行愈傷組織分化的植物生長調節劑組合為F6 號處理（MS 培養基+0.05 mg/L NAA+1.8 mg/L 6-BA）,且該處理分化的芽及獲得的無根再生苗皆處于最佳狀態（見圖3）.

圖3 愈傷組織分化狀況Fig.3 Differentiation status of callus tissue

影響愈傷組織分化率各因素方差分析結果見表6.

表6 影響愈傷組織分化率各因素方差分析結果Tab.6 Between-subjects effects tests for influencing factors of callus tissue differentiation rate

由表6 可知,不同NAA 質量濃度和不同6-BA 質量濃度對愈傷組織分化率均有極顯著影響（P＜0.01）.多重比較結果顯示,0.08 mg/L 的NAA 質量濃度與0.03 mg/L、0.05 mg/L 的NAA 質量濃度的愈傷組織分化率存在極顯著差異（P＜0.01）,0.03 mg/L、0.05 mg/L 的NAA 質量濃度的愈傷組織分化率差異不顯著（P＞0.05）；1.2 mg/L 的6-BA 質量濃度與1.5 mg/L 的6-BA 質量濃度的愈傷組織分化率存在顯著差異（P＜0.05）,與1.8 mg/L 的6-BA 質量濃度的愈傷組織分化率存在極顯著差異（P＜0.01）,1.5 mg/L 的6-BA 質量濃度與1.8 mg/L 的6-BA 質量濃度的愈傷組織分化率差異不顯著（P＞0.05）.

相關分析結果見表7.由表7 可知：NAA 與愈傷組織分化率的偏相關系數為-0.692（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系；6-BA 愈傷組織分化率的偏相關系數為0.716*（P＜0.05）,兩者具有顯著負相關關系；NAA 與6-BA 的偏相關系數為0.469（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系.

表7 愈傷組織分化中控制各因素的偏相關分析結果Tab.7 Partial correlation analysis results of controlling factors in callus tissue differentiation

2.4 生根誘導和培養

不同植物生長調節劑組合對小葉梔子再生苗生根的影響結果見表8.

表8 不同植物生長調節劑組合對小葉梔子再生苗生根的影響Tab.8 Effects of rooting of regenerated plantlets of Gardenia jasminoides Ellis.var.radicans on different combination plant growth regulators

由表8 可知,在不添加IBA 且NAA 質量濃度在0.05 mg/L 時,再生苗生根率最高僅達到3.33%；在IBA 質量濃度為0.5 mg/L 時,生根率普遍較高,NAA 質量濃度設置為0.10 mg/L 時,效果最好,再生苗生根率達到26.67%.因此,最適宜進行再生苗生根的植物生長調節劑組合為G6 號處理（1/2 MS 培養基+0.10 mg/L NAA+0.50 mg/L IBA）,且該處理下的再生苗產生不定根和再生苗生長情況皆處于最佳狀態（見圖4）.

圖4 再生苗產生不定根Fig.4 Adventitious root status of regenerated plantlets

影響無菌無根苗生根率各因素方差分析結果見表9.

表9 影響無菌無根苗生根率各因素方差分析結果Tab.9 Between-subjects effects tests for influencing factors of sterile rootless seedlings rooting rate

由表9 可知,不同NAA 質量濃度對無菌無根苗生根率無顯著影響（P＞0.05）,不同IBA 質量濃度對無菌無根苗生根率有顯著影響（P＜0.05）,因此,只需對IBA 質量濃度的不同水平的均值進行多重比較即可.多重比較的結果顯示,0.00 mg/L 的IBA 質量濃度與0.50 mg/L 的IBA 質量濃度的無菌無根苗生根率存在顯著差異（P＜0.05）,0.00 mg/L 的IBA 質量濃度與0.10 mg/L 的IBA 質量濃度以及0.10 mg/L 的IBA 質量濃度與0.50 mg/L 的IBA 質量濃度的無菌無根苗生根率差異不顯著（P＞0.05）.

相關分析結果見表10.由表10 可知：NAA 與再生苗生根率的偏相關系數為0.248（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系；IBA 與再生苗生根率的偏相關系數為0.861**（P＜0.01）,兩者具有極顯著的正相關關系；NAA 與IBA 的偏相關系數為-0.214（P＞0.05）,兩者不存在顯著相關關系.

表10 再生苗生根中控制各因素的偏相關分析結果Tab.10 Partial correlation analysis results of controlling factors in rooting of regenerated plantlets

3 討論與結論

植物材料經過消毒處理后,材料內部一定程度上依然會留存雜菌,存在發生內源菌體污染的風險[21].無菌外植體具有明顯的優點：可確保外植體的無菌狀態,從而有效提高組培接種的成功率和有效性.前人研究發現,選用合適的抗生素溶解在培養基中,可以產生不同程度的抑菌效果[22].本研究采用外植體接種前在抗生素溶液中浸泡的方法,尋找到了能夠顯著降低外植體污染的最佳抗生素配方.利用獲取的無菌材料進行愈傷組織誘導,能夠最大程度地規避影響愈傷組織誘導率產生變化的菌體污染因素.

愈傷組織誘導實驗的成功,不僅取決于植物材料本身,很多情況下更重要的是取決于培養基中激素種類及配比的影響[23-24].有研究表明,單獨使用2,4-D 僅可誘導出少量愈傷組織,而2,4-D 與6-BA 配合使用則可誘導出大量愈傷組織[25].本研究采用小葉梔子的無菌葉片和無菌頂芽為外植體,通過添加不同質量濃度水平的2,4-D 和6-BA 進行對比實驗,發現不同的植物生長調節劑質量濃度配比對愈傷組織誘導率有極顯著影響,2,4-D 在此過程中發揮了較為重要的作用,這與前人的研究結果基本一致[26-28].同時,本研究中頂芽的愈傷組織誘導率高達93.3%,啟動培養基上生長的頂芽展開的無菌葉片的愈傷組織誘導率亦達到90%,這表明了幼嫩、分裂旺盛的部位具有較強的脫分化與再分化的能力,更易產生愈傷組織,這與潘清平等[19]、張虹等[29]、Deng 等[30]的研究結果相似.

細胞分裂素可以促進細胞的分裂與膨大,生長素則可以促進細胞的生長.研究表明,細胞分裂素/生長素比例較高時可促進芽的分化,比例適中時有利于愈傷組織的誘導和苗的生長,比例較低時促進根的生長[31-33].本研究采用了高質量濃度細胞分裂素和低質量濃度生長素搭配,進行愈傷組織分化,結果顯示愈傷組織分化最佳培養基配方為MS 培養基附加0.05 mg/L NAA 和1.8 mg/L 6-BA,分化率高達96.7%,這與商圓圓[34]的研究結果相一致.值得注意的是,在實驗過程中還發現,有些愈傷組織不能進行分化,原因可能是愈傷組織生長時間太長,失去了分化能力或沒有形成胚狀體.有研究表明,TDZ 是一種多功能性的人工合成的植物生長調節劑,能有效促進木本植物芽的誘導[35-36].因此,后續研究可考慮在培養基中添加TDZ,以解決部分愈傷組織未能有效分化,以達到更為有效地促進愈傷組織不定芽誘導的目的.

前人研究表明,愈傷組織誘導和分化階段使用MS 培養基最為常見,而在生根壯苗階段使用1/2 或1/4MS 培養基效果較好[34,37-38].本研究選用1/2 MS 培養基作為再生苗生根培養的基本培養基,對小葉梔子再生苗進行生根培養,生根率相對較高,最佳植物生長調節劑配比為0.05 mg/L NAA 和1.8 mg/L 6-BA,生根率可達26.67%.值得一提的是,不同IBA 質量濃度對無菌無根苗的生根率有顯著影響,存在極顯著的正相關關系,在生根過程中發揮了重要作用.

本研究利用小葉梔子的無菌葉片、頂芽進行離體培養,針對小葉梔子離體快繁過程中外植體啟動、愈傷組織誘導、分化、生根階段存在的關鍵問題,對小葉梔子的再生體系進行了優化,成功建立了小葉梔子的離體再生體系,為大規模擴繁生產小葉梔子幼苗奠定了基礎,也為其廣泛推廣應用創造了有利條件.