落葉松-楊柵銹菌MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白互作關系初探

楊 冰,陳凱玥,李子曄,周顯臻,于 丹

(西北農林科技大學 林學院,陜西 楊陵 712100)

微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein,MCM)是AAA ATPase大基因家族中一類獨特的亞群[1]。MCM蛋白在真核生物中高度保守,典型的MCM基因家族包括6個成員,即MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7,它們通常形成異源六聚體復合物[2]。MCM蛋白具有ATPase結構域,也稱作MCM box,其中含有所有MCM蛋白具有的3個保守基序。第1個Walker A,對應MCM特異的序列GDPXX(S/A)KS;第2個Walker B,序列為IDEFDKM;第3個R-finger,序列較短,SRFD[1,3]。所有真核MCM蛋白具有鋅結合基序,具體序列因蛋白類型有一定差異[1]。在釀酒酵母中,MCM基因家族在DNA復制起始過程發揮重要作用,并且以0.4 M NaCl處理細胞10 min作為外源滲透壓脅迫,使用免疫共沉淀技術檢測HOG1蛋白是否與各種復制復合體組分相互作用,最終發現HOG1能夠與MCM4、CDC45、PSF2、DPB2及CDC7互作[4-5]。

在真菌中,MCM4基因的研究主要集中在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)兩大系統,也被分別稱為CDC54和CDC21[1]。付靜等[3]在全基因組水平上鑒定了植物病原真菌葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)MCM基因家族成員,并分析了其對硫化物脅迫的響應特征,為闡明韭菜及其主要成分對蘋果輪紋病的防控機理提供了理論依據。專性寄生真菌落葉松-楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)能夠侵染楊樹引起楊樹葉銹病,該病害廣泛分布于世界各楊樹栽培區,在我國對楊樹用材林和防護林的安全生產造成嚴重影響[6]。落葉松-楊柵銹菌MCM基因家族的研究目前尚未見報道。前期研究推斷MlpHOG1基因參與落葉松-楊柵銹菌侵染菌絲生長擴展和響應環境脅迫等生命活動[7-8]。本研究通過鑒定落葉松-楊柵銹菌標準菌株MCM基因家族成員和系統發育分析,從而確定MCM4候選基因,進而同源克隆獲得中國菌株MlpMCM4基因的CDS片段,并對目的蛋白的基本特征進行預測分析,最后借助2種技術分析目的蛋白與MlpHOG1蛋白的相互作用情況,為后續明確目的蛋白與MlpHOG1蛋白的互作關系提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 試驗材料 落葉松-楊柵銹菌中國菌株wh03為單孢菌系[9],使用太白楊(Populuspurdomii)在溫室進行人工擴繁,根據曹支敏等[10]的方法進行菌株的活化及保存。酵母雙雜交載體pDHB1、pPR3-N、pDHB1-largeT和pDSL-ΔP53以及熒光素酶試驗載體pCAMBIA1300-CLuc、pCAMBIA1300-NLuc分別由西北農林科技大學植物保護學院劉慧泉教授和康振生教授實驗室惠贈。大腸桿菌感受態細胞DH5α購自北京擎科生物科技有限公司。酵母感受態細胞NMY51和農桿菌感受態細胞GV3101購自上海唯地生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;反轉錄試劑盒、Phusion Plus DNA聚合酶和Taq酶購自Thermo Scientific公司;高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase公司和Clon Express Ⅱ One Step Cloning Kit購自Vazyme;pMD19-T載體購自TAKARA公司;SC/-Leu/-Trp Broth、SC/-Ade/-His/-Leu/-Trp Broth和X-gal購自北京酷來搏科技有限公司;D-熒光素鉀鹽購自上海笛醫生物科技有限公司。引物序列合成和大腸桿菌轉化子測序在北京奧科鼎盛生物科技有限公司(楊陵分部)完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 候選基因分析 從Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載MCM基因家族模型數據(PF00493),通過hmmer軟件在供試真菌(表1)全體蛋白序列中搜索鑒定,提取鑒定到的序列并在NCBI CDD數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)中比對,從而去除不存在MCM(PF00493)保守結構域的序列。將通過篩選的蛋白序列用軟件MEGA7.0對齊,用gblocks提取保守序列。最后,用iqtree構建最大似然法(Maximum likelihood)樹,設置“-m”參數調用ModelFinder獲得氨基酸序列的最佳替代模型,設置“-b 1 000”采用1 000次重復計算的常規自展檢驗法(Bootstrap)對分支可靠性進行評估。生成的樹文件使用MEGA7.0軟件查看。

表1 參與MCM基因家族鑒定的物種Table 1 Species used in the phylogenetic analysis of the MCM family

1.2.2 目的基因克隆 用Rneasy Plant Mini Kit試劑盒提取落葉松-楊柵銹菌夏孢子總RNA,消解基因組DNA后用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。根據落葉松-楊柵銹菌標準菌株98AG31(v1.0)[11]中Protein ID 48743的基因序列,利用軟件Primer Premier 5設計特異性擴增引物48743-uF1和48743-uR2(表2)。PCR 反應總體系50 μL,其中cDNA模板1.5 μL,10 μM上下游引物各2.5 μL,2×Phusion Plus PCR Master Mix 25 μL,ddH2O 18.5 μL。擴增程序:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性7 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min 25 s,35個循環;72 ℃延伸 5 min,16 ℃保存。擴增完成后,在PCR產物中加入0.5 μLTaqDNA聚合酶和0.5 μL dNTP,72 ℃延伸30 min,16 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化目的片段,再連接至pMD19-T載體骨架,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,PCR檢測篩選后將陽性轉化子送公司測序。

1.2.3 目的基因編碼蛋白生物信息學分析 利用在線軟件ProtParam預測和分析目的基因編碼蛋白的基本理化性質。使用軟件Clustalx1.83對供試蛋白序列進行多序列比對,然后使用GeneDoc軟件進行查看。使用SOPMA在線工具預測目的基因編碼蛋白的二級結構。借助3種在線軟件EuK-mPLoc 2.0、WOLFPSORT和PROTCOMP預測分析目的蛋白的亞細胞定位區域。

1.2.4 酵母雙雜交 使用高保真聚合酶擴增目的片段,擴增引物見表2。NcoⅠ單酶切pDHB1載體,BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切pPR3-N載體。用重組克隆試劑盒,將MlpMCM4(wh03)基因片段和MlpHOG1(wh03)基因片段分別連接至pDHB1載體質粒和pPR3-N載體質粒,測序確認后獲得bait載體pDHB1-MlpMCM4和prey載體pPR3-N-MlpHOG1。將獲得的重組載體質粒共轉化至酵母感受態細胞NMY51,觀察30 ℃條件下整合外源片段的酵母轉化子在缺陷培養基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade上培養3 d的生長情況,并檢測以X-gal為反應底物時能否發生藍色反應。其中pDHB1-largeT與pDSL-ΔP53共轉化轉化子為陽性對照,pDHB1-largeT與pPR3-N共轉化轉化子為陰性對照,pDHB1-MlpMCM4與pPR3-N共轉化轉化子為自激活組。

1.2.5 螢火蟲熒光素酶互補試驗 使用高保真聚合酶擴增目的片段,擴增引物見表2。KpnⅠ和SalⅠ酶切空載體pCAMBIA1300-CLuc和pCAMBIA1300-NLuc。用重組克隆試劑盒將目的基因片段分別連接至載體骨架,測序確認后獲得重組載體pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4和pCAMBIA 1300- NLuc-MlpHOG1。選取生長3～4周、長勢良好的本氏煙(Nicotianabenthamiana)作為煙草瞬時表達系統的材料。將獲得的重組載體質粒分別轉化至農桿菌感受態細胞GV3101,參考Chen等[12]的方法進行菌液處理,在煙草葉片上分別注射不同的菌液組合。2 d后在每個接種點均勻涂抹D-熒光素鉀鹽溶液,室溫黑暗靜置5 min。在多光譜動態熒光顯微成像系統(PlantView 100)中觀察其注射煙草葉片區域是否有熒光出現。

2 結果與分析

2.1 候選基因的確定

借助hmmer軟件將下載獲得的MCM基因家族模型數據在10個供試物種的蛋白序列中進行搜索鑒定,共獲得65條序列。其中2個基因序列太短,不具有保守結構域,進而使用63條序列構建最大似然法系統進化樹,結果表明,進化樹具有6個分支,分別代表MCM基因家族的MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7(圖1)。ID 48743(v1.0)為釀酒酵母MCM4基因在落葉松-楊柵銹菌標準菌株98AG31中的直系同源基因,命名MlpMCM4。

1)物種后的數字代表在相應物種數據庫中的蛋白序號(Protein ID); 2)自展支持率標注于節點。

2.2 目的基因的克隆

以落葉松-楊柵銹菌中國毒性菌株wh03(圖2A)夏孢子cDNA為擴增模板,根據ID 48743(v1.0)序列設計特異引物進行同源克隆,擴增結果呈現一個較為特異且濃度較高的大小約2.5 kb的條帶(圖2B)。通過TA克隆及測序分析結果表明,成功獲得wh03菌株ID 48743基因的CDS片段,長度為2 460 bp,將該基因命名為MlpMCM4(wh03)(GenBank OR751401)。

A.落葉松-楊柵銹菌中國毒性菌株wh03接種楊樹葉片后的寄主表型;B.從wh03菌株夏孢子cDNA中擴增MlpMCM4基因片段

2.3 目的基因編碼蛋白特征

使用在線軟件ProtParam分析蛋白理化性質,結果顯示MlpMCM4(wh03)基因編碼819個氨基酸,相對分子量90.31 ku。負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數為110個,正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為97個,帶負電荷的數目略多于正電荷。MlpMCM4(wh03) 基因編碼蛋白理論等電點(pI)為5.78,即偏酸性。預測的不穩定指數為44.56,超過40,推測屬于不穩定蛋白。

將MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白序列和釀酒酵母MCM4蛋白序列進行比對分析,發現目的蛋白具有MCM蛋白共有的3個重要基序,即Walker A(GDPXX(S/A)KS)、Walker B(IDEFDKM)和 R-finger(SRFD),還具有MCM4類型鋅結合基序(CX2CX18CX2-4C)(圖3)。

1)深綠色橫線區域隸屬釀酒酵母MCM4的MCM box結構域,其中淺藍色橫線表示Walker A、Walker B和 R-finger基序;2)*表示鋅結合基序。

運用SOPMA在線預測目的蛋白二級結構,顯示MlpMCM4 (wh03)蛋白二級結構主要由4種形式組成(圖4),分別為41.64%的α-螺旋(Alpha helix)、6.23%的β-轉角(β-turn)、15.26%的延伸鏈(Extended strand)和36.87%的無規則卷曲(Random coil),其中α-螺旋和無規則卷曲為主要二級結構。

藍色:α螺旋;綠色:β-轉角;紅色:延伸鏈;紫色:無規則卷曲

使用EuK-mPLoc、WOLFPSORT和PROTCOMP這3種在線軟件對MlpMCM4 (wh03)蛋白進行亞細胞定位預測分析。EuK-mPLoc預測目的蛋白定位在細胞核(Nucleus)區域。WOLFPSORT和PROTCOMP均預測顯示細胞核(Nuclear)區域數值明顯高于其他區域(26/27和8.84)。綜合3種軟件預測結果,推斷MlpMCM4 (wh03)蛋白定位在細胞核區域。

2.4 MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白的互作關系

借助酵母雙雜交技術分析落葉松-楊柵銹菌MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白是否相互作用。在SD-Leu-Trp培養基上,陽性對照(pDHB1-largeT+pDSL-ΔP53)、陰性對照(pDHB1-largeT+pPR3-N)及自激活組(pDHB1-MlpMCM4+pPR3-N)均能正常生長。在SD-Leu-Trp-His-Ade培養基上,陽性對照正常生長,陰性對照不能生長,自激活組也不能生長;X-gal染色顯示陽性對照變藍,陰性對照沒有變藍,自激活組也沒有變藍(圖5A)。因此,MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白不具有自激活能力。陽性對照、陰性對照及試驗組(pDHB1-MlpMCM4+pPR3-N-MlpHOG1)在SD-Leu-Trp培養基上均能正常生長。在SD-Leu-Trp-His-Ade培養基上,陽性對照正常生長,陰性對照不能生長,試驗組也不能生長;X-gal染色顯示陽性對照變藍,陰性對照沒有變藍,試驗組也沒有變藍(圖5B)。因此,利用本研究中分離泛素酵母雙雜交系統發現MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白和MlpHOG1(wh03)基因編碼蛋白二者不存在相互作用關系。

A.自激活檢測結果;B.試驗組檢測結果

同時,借助螢火蟲熒光素酶互補試驗進行分析。在植物活體熒光成像系統中觀察不同組合煙草葉片注射區域,陽性對照pCAMBIA1300-CLuc-X與pCAMBIA1300-NLuc-Y共表達的葉片區域呈現熒光(結果未報道),3組陰性對照pCAMBIA1300-CLuc+pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4+pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc+pCAMBIA1300-NLuc-MlpHOG1,以及試驗組pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4+pCAMBIA1300-NLuc-MlpHOG1共表達的葉片區域都沒有檢測到熒光信號(圖6)。表明該系統中MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白和MlpHOG1(wh03)基因編碼蛋白也不存在相互作用。

圖6 螢火蟲熒光素酶互補試驗分析MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白的互作關系Fig.6 The interaction between MlpMCM4 andMlpHOG1 detected by the firefly luciferase complementary assay

3 結論與討論

MCM4基因是MCM家族成員之一,一對一比對涉及的序列相似度較高,因此根據家族模型在全基因組水平鑒定落葉松-楊柵銹菌MCM基因家族成員,進而通過構建系統進化樹來確定成員直系同源基因。本研究發現ID 48743是釀酒酵母MCM4基因的直系同源基因,因此命名為MlpMCM4。同時,也鑒定出其他成員,ID76084是釀酒酵母MCM2基因的直系同源基因,ID34519是釀酒酵母MCM3基因的直系同源基因,ID74054是釀酒酵母MCM5基因的直系同源基因,ID86241、115157和42573是釀酒酵母MCM6基因的直系同源基因,ID95211是釀酒酵母MCM7基因的直系同源基因。這為后續研究該銹菌MCM基因家族的功能奠定基礎。本研究使用MCM模型在供試擔子菌和子囊菌中均鑒定到MCM2-7,沒有其他成員如MCM8和MCM9,這與MCM8和MCM9僅存在于高等生物體內的報道是一致的[13]。

比對分析顯示MlpMCM4 (wh03)蛋白具有3個保守的亞結構域,即Walker A、Walker B和R-finger,它們與MCM蛋白利用ATP的能力密切相關[13]。同時,目的蛋白還具有MCM4類型特有的鋅指結構(CX2CX18CX2-4C),研究顯示在許多MCM蛋白中該結構與酵母菌株的存活密切相關[14-15]。因此,比對預測分析顯示目的蛋白較為保守。大多數MCM4蛋白還具有一個保守的CDK激酶作用位點(S/T)PX(K/R)[1]。但沒有在目的蛋白中預測出該位點,推斷可能CDK激酶通過新的途徑或者作用復合體其他基因來發揮作用。釀酒酵母6個MCM蛋白成員在G1期主要集中在細胞核區域,在S期逐漸從核內輸出,到了G2/M期則完全從核內排出[16]。本研究亞細胞定位預測顯示目的蛋白定位于細胞核,這與報道具有吻合度,有待于后續開展相關試驗進行分析。

落葉松-楊柵銹菌是專性寄生真菌,目前還沒有穩定遺傳操作體系,導致致病分子機理研究明顯落后于模式植物病原真菌?；谇捌谘芯窟M展,期望能夠理清落葉松-楊柵銹菌HOG途徑在該病原菌侵染致病和響應脅迫方面的作用機制。釀酒酵母中在外源滲透壓處理下HOG1和MCM4蛋白具有特異的互作關系[5]。本研究酵母雙雜交系統和螢火蟲熒光素酶互補試驗中,落葉松-楊柵銹菌中國菌株HOG1蛋白和MCM4蛋白沒有表現相互作用,推斷可能因為沒有外源滲透壓刺激。后續考慮增加外源滲透壓脅迫條件及借助多種互作檢測方法,來繼續分析2個蛋白的互作關系。