質譜離子源內裂解和重排可能會為化學反應中間體的捕獲帶來錯誤信息

趙玲玲,梁馳予,汪 杰,張新星

(南開大學化學學院,天津 300071)

鑒定化學反應中間體并解析其結構對于闡明反應機理至關重要。反應中間體通常具有活性高、壽命短、難以分離等特點,需要使用化學方法捕獲后進行表征,或使用原位方法從反應混合物中直接識別中間體的特征信號,這對分析方法的特異性和樣品的兼容性提出了更高要求。質譜(MS)依據離子的質荷比(m/z)確定樣品成分,能夠全面獲得反應體系中底物、中間體和產物的信息,具有分辨率高、響應速度快、靈敏性好等優勢,非常適用于中間體的檢測;得益于串聯質譜(MS/MS)技術以及離子裂解技術,質譜還具有一定的結構分析能力;并且,隨著大氣壓離子化(API)和敞開式離子化技術的發展,質譜能夠兼容的樣品形態更加豐富,制樣過程進一步簡化,甚至可以省略樣品前處理步驟直接測定反應體系,最大程度地維持反應體系原貌,保持中間體信息[1-3]?；谶@些優勢,質譜技術越來越多地用于化學反應監測與中間體鑒定[4-9],如:1) 監測Claisen重排[10-11]、Smiles重排[12]、串聯有機催化反應[13-14]等小分子有機反應并鑒定重要中間體;2) 醇氧化和乙酸的選擇性分解[15]、碳-氫/碳-碳鍵活化[16]、烯烴復分解[17-18]等過渡金屬介導的反應中配合物中間體的鑒定;3) 電化學反應的質譜監測[19-22];4) 蛋白質組裝過程的中間體[23-24]、雜原子-酶共價鍵合不穩定中間體[25-26]的鑒定;5) 在原子水平上實時監測單個金原子向銀納米團簇的動態團簇內擴散的過程[27]等。

在開發基于噴霧的敞開式離子化方法過程中,研究者們發現,細小的霧滴由于具有巨大的比表面積,將受到界面效應的顯著影響,從而表現出獨特的反應性質。2011年,Girod等[28]利用解吸電噴霧質譜(DESI-MS)對可的松等甾酮和肼(Girard T)的成腙反應進行監測,首次報道了微液滴體系中的反應加速現象,拉開了微液滴領域研究的序幕。后續研究表明,水微液滴除了能夠加速反應2～6個數量級外[29-33],還能夠觸發自發的氧化還原反應[34-39]。微液滴表面的特殊環境,包括極端的酸性環境[28,31,40-42]、強大的界面電場[43-45],以及在電場作用下產生的豐富的羥基自由基和水合電子[35-37,46-48],均對微液滴的獨特性質具有重要貢獻。這種特殊環境能夠穩定許多高活性、短壽命中間體,使它們能夠被在線質譜捕獲、檢測[48-53]。

使用質譜表征噴霧形式的微液滴體系時,微液滴既是離子化載體,又充當反應容器;相應地,質譜條件不再僅是檢測條件,也將作為反應條件,在很大程度上影響反應過程,甚至導致副產物的生成。最顯著的影響因素集中在質譜的大氣壓接口處,Page等[54]考察了進樣毛細管長度對離子傳輸效率的影響及分析結果可能的偏差;Banerjee等[55]報道了微液滴反應會受到進樣毛細管溫度的影響,在高溫下,液滴蒸發帶來的冷卻效應和噴射出的離子受到的加熱效應互相競爭,對不同反應有著不同影響,表現為加速或抑制;Venter等[56]在使用DESI-MS分析蛋白質的過程中發現,管透鏡電壓(tube lens offset)這一參數的高低對蛋白質的相對信號強度具有重要影響。因此,進行微液滴實驗時,需要充分考慮儀器參數的影響,在研究反應機理和捕獲中間體時,應當更加謹慎。

近期,Banerjee課題組[50-51]使用DESI-MS監測水微液滴體系中的消除、取代、氧化等多種反應,觀察到高活性的碳正離子中間體。此前,相關研究表明,成腙反應[28]、Pomeranz-Fritsch異喹啉合成反應[42]等需要強酸催化的反應能夠在不添加外來酸的微液滴中以極高的速度進行,證實了微液滴表面存在極端的酸性環境?；谶@一現象,參考Olah等[57-58]使用超強酸體系捕獲烷基碳正離子的開創性研究,Banerjee等[50]推測他們觀察到的碳正離子是由微液滴表面極端酸性環境捕獲得到的。商用電噴霧離子源(ESI)的噴霧距離較短,且在氣流的輔助下快速脫除溶劑,可在較短的時間內將樣品離子化,能夠淬滅反應體系,排除微液滴界面效應的影響[32-33,59]。本工作擬使用ESI-MS測定上述研究涉及的一系列前體物質溶液,觀察在特定儀器參數下是否生成碳正離子,并通過調整進樣毛細管溫度及管透鏡電壓分析碳正離子的來源。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

LTQ-XL線性離子阱質譜儀:美國Thermo Fisher Scientific公司產品,配有ESI源和注射泵,以及Xcalibur數據處理系統。

1-金剛烷胺鹽酸鹽(純度99%):北京百靈威科技有限公司產品;2-金剛烷胺鹽酸鹽(純度98%):Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司產品;2-氨基降冰片烷胺鹽酸鹽(純度99%)、叔丁胺(純度98%)、膽固醇(純度99%)、叔丁醇(純度≥99.5%)、1-溴金剛烷(純度>97%):上海麥克林生化科技有限公司產品;外-降冰片(純度98%):東京化成工業株式會社產品;4-叔丁基環己醇(純度98%):上海邁瑞爾生化科技有限公司產品;1-氯金剛烷(純度98%):上海浩鴻生物醫藥科技有限公司產品。

甲醇(色譜級):上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品;超純水:由Purelab Quest超純水系統制備,英國Elga LabWater公司產品;高純氮氣:液化空氣(天津)有限公司產品。

1.2 實驗條件

1.2.1溶液配制 首先用甲醇溶解各待測物,再用超純水稀釋至100 μmol/L,備用。

1.2.2電噴霧質譜測試條件 噴霧氣壓強69 kPa,噴霧電壓4.5 kV,毛細管電壓0 V,毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓0 V或140 V,進樣速度15 μL/min。

2 結果與討論

2.1 毛細管溫度和管透鏡電壓共同影響碳正離子的生成

2.1.1橋頭碳正離子的生成 為探究毛細管溫度以及管透鏡電壓對中間體檢測的影響,首先使用ESI-MS表征1-金剛烷胺鹽酸鹽溶液,結果示于圖1。當毛細管溫度為275 ℃、管透鏡電壓為140 V時,m/z152、135離子的信號同時出現,分別是質子化的1-金剛烷胺和1-金剛烷基碳正離子,示于圖1a;保持毛細管溫度不變、關閉管透鏡電壓(圖1b),或保持管透鏡電壓不變、降低毛細管溫度至45 ℃(圖1c)時,譜圖中均只出現1-金剛烷胺離子m/z152峰,而觀察不到1-金剛烷基碳正離子。對比這3組質譜結果可以發現,只有在毛細管高溫且施加管透鏡電壓的條件下,譜圖中才會出現碳正離子信號。分別對上述條件下的1-金剛烷胺離子(m/z152)進行碰撞誘導裂解(CID)實驗,均產生了1-金剛烷基碳正離子m/z135,示于圖1d,證實碳正離子可以由碎裂得到(中性丟失17 u,對應NH3)。結合以上結果,本研究推測高溫和管透鏡的共同作用將引發1-金剛烷胺離子的源內裂解,產生橋頭碳正離子。

注:a.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓140 V;b.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓0 V;c.毛細管溫度45 ℃,管透鏡電壓140 V圖1 1-金剛烷胺鹽酸鹽溶液的質譜圖(a～c)以及m/z 152的二級質譜圖(d)Fig.1 Mass spectra of 1-adamantane hydrochloride (a-c) and MS/MS spectrum of m/z 152 cations (d)

對2-金剛烷胺鹽酸鹽溶液進行了相同的實驗,結果表明,在毛細管高溫和管透鏡電壓的共同作用下,才能在譜圖中觀察到碎裂生成的碳正離子,示于圖2。2-金剛烷基正離子的穩定性比1-金剛烷基正離子差,且由于其二面角接近90°,受空間結構的限制,很難發生重排。圖2a中碳正離子的相對豐度顯著低于圖1a,該現象與這2種碳正離子的穩定性關系一致。

注:a.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓140 V;b.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓0 V;c.毛細管溫度45 ℃,管透鏡電壓140 V圖2 2-金剛烷胺鹽酸鹽溶液的質譜圖(a～c)以及m/z 152的二級質譜圖(d)Fig.2 Mass spectra of 2-adamantane hydrochloride (a-c) and MS/MS spectrum of m/z 152 cations (d)

除金剛烷胺外,鹵代金剛烷也能夠作為金剛烷基碳正離子的前體。使用ESI-MS分別表征1-溴金剛烷和1-氯金剛烷,結果示于圖3。當毛細管溫度275 ℃、管透鏡電壓140 V時,出現較強的m/z135峰信號,推測為1-金剛烷基碳正離子。在該條件下,溴/氯代金剛烷的碳-鹵鍵發生異裂,溴、氯以負離子形式離去,生成碳正離子。降低毛細管溫度或關閉管透鏡電壓時,正離子模式下僅能觀察到較弱的金剛烷基碳正離子信號,進一步表明這2個儀器參數對碳正離子的生成有著重要影響。

圖3 1-溴金剛烷(a)和1-氯金剛烷(b)的ESI-MS譜圖Fig.3 ESI-MS spectra of 1-bromo adamantane (a) and 1-chloride adamantane (b)

2.1.2非經典碳正離子的生成 非經典碳正離子(nonclassical carbocations)通常含有三中心二電子鍵,通過σ鍵參與等方式穩定正電荷中心,比對應的孤立碳正離子形式的穩定性更高[60-62],其中,2-降冰片基正離子是一種具有代表性的非經典碳正離子。本研究以2-氨基降冰片烷胺鹽酸鹽水溶液作為前體物種,采用ESI-MS檢測可能的非經典碳正離子,結果示于圖4。與前述現象相似,在毛細管高溫及管透鏡電壓的共同作用下,樣品分子能夠碎裂得到目標碳正離子,并以非經典形式存在,即譜圖中的m/z95峰,示于圖4a;當毛細管溫度降至45 ℃或關閉管透鏡電壓后,譜圖中僅能觀察到m/z112峰,即2-氨基降冰片烷胺正離子,示于圖4b,4c;CID實驗證明了母離子碎裂生成非經典碳正離子的可能性,示于圖4d。

注:a.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓140 V;b.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓0 V;c.毛細管溫度45 ℃,管透鏡電壓140 V圖4 2-氨基降冰片烷鹽酸鹽溶液的質譜圖(a～c)以及m/z 112的二級質譜圖(d)Fig.4 Mass spectra of 2-aminonorbornane hydrochloride (a-c) and MS/MS spectrum of m/z 112 cations (d)

2.1.3叔碳正離子的推測 采用ESI-MS表征100 μmol/L叔丁胺溶液,結果示于圖5。當調節毛細管溫度為275 ℃、管透鏡電壓為140 V時,除觀察到m/z74對應的叔丁胺正離子外,還觀察到m/z57對應的叔丁基正離子,示于圖5a;當毛細管溫度為45 ℃,或管透鏡電壓為0 V時,僅能觀察到叔丁胺正離子(m/z74)。這再次說明在高溫與較高管透鏡電壓的共同作用下,前體物種易發生源內裂解得到碳正離子。

注:a.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓140 V;b.毛細管溫度275 ℃,管透鏡電壓0 V;c.毛細管溫度45 ℃,管透鏡電壓140 V圖5 叔丁胺溶液的質譜圖(a～c)以及m/z 74的二級質譜圖(d)Fig.5 Mass spectra of tert-butylamine (a-c) and MS/MS spectrum of m/z 74 cations (d)

2.1.4含羥基化合物作為碳正離子前體 使用ESI-MS檢測膽固醇、外-降冰片、4-叔丁基環己醇、叔丁醇等含羥基物質的溶液,當同時存在較高的進樣毛細管溫度和管透鏡電壓這2個條件時,這些物質均能夠形成對應的碳正離子,推測可能經歷了質子化后脫水的過程,沒有觀察到前體分子的羥基質子化后形成的離子,示于圖6。去除高溫或管透鏡電壓的條件后,則無法觀察到碎裂形成的碳正離子,也觀察不到質子化的前體分子。其中,膽固醇對應的碳正離子可能發生了重排,形成了更穩定的烯丙基碳正離子,示于圖6a。

圖6 毛細管溫度275 ℃、管透鏡電壓140 V時,100 μmol/L膽固醇(a)、外-降冰片(b)、4-叔丁基環己醇(c)、叔丁醇(d)溶液的電噴霧質譜圖Fig.6 ESI-MS spectra of 100 μmol/L cholesterol (a), exo-2-norbornol (b), 4-tert-butylcyclohexanol (c) and tert-butanol (d) at the capillary temperature of 275 ℃ and the tube lens voltage of 140 V

2.2 管透鏡電壓引發源內裂解

電噴霧電離等大氣壓電離方法在常壓下產生離子,而質量分析器處于高真空環境,需要通過大氣壓接口實現離子的傳輸。在通過毛細管、小孔等傳輸方式限制進氣量的同時,許多離子隨氣體一起被真空系統抽走;同時,受離子電荷排斥的影響,離子傳輸效率將非常低。因此,需要使用離子光學系統輔助離子傳輸,如采用靜電透鏡、離子漏斗等部件對離子聚焦[63]。LTQ-XL質譜儀采用多級差分真空系統[64],管透鏡(tube lens)和撇渣器(skimmer)被設置在第1級真空(～133 Pa)到第2級真空(～0.133 Pa)的入口處,示于圖7。施加合適的管透鏡電壓能夠保證更多離子進入錐孔,提高離子傳輸效率。然而,該區域的氣體密度較高,在電壓的影響下,極有可能發生氣體-離子反應,引發離子的源內裂解[65]。

注:a摘自LTQ-XL儀器硬件手冊圖7 LTQ-XL質譜大氣接口結構(a)及差分真空系統示意圖[64](b)Fig.7 Schematic diagrams of atmosphere pressure interface (a) and differential pumping stages[64] (b) on LTQ-XL spectrometer

Garrett等[66]研究了四極桿離子阱質譜(QIT-MS)中質子化磷脂分子及鈉離子加和磷脂分子的解離,分別利用脆弱離子在進樣毛細管溫度誘導下發生熱解離(TID)和管透鏡電壓誘導碎裂的現象,評估了多種離子的“脆性”。

Kulyk等[67]使用Velos Pro離子阱質譜儀研究了芐胺醇離子在離子化和傳輸過程中的碎裂現象,發現離子傳輸毛細管溫度和離子光學部件S-透鏡組(S-lens)的射頻電壓將顯著影響碎裂產物離子的分布。Raji等[68]采用全因子實驗設計的方法考察了離子傳輸部件電壓、噴霧電壓、離子傳輸毛細管溫度、毛細管電壓等儀器參數的主效應及它們之間的交互作用。其中,對于Thermo LCQ Deca XP質譜儀和Shimadzu LCMS 2010質譜儀,離子傳輸部件分別是管透鏡和四極桿陣列(Q-array)。離子傳輸部件的電壓對這2種質譜儀的檢測結果均有重要影響,且對于Thermo LCQ Deca XP質譜儀而言,毛細管溫度及其與管透鏡電壓的交互作用的影響均是主要因素。

2.3 碎片離子干擾中間體捕獲研究和機理分析

使用微液滴體系捕獲反應中間體時,需要考慮分析條件是否影響目標離子,以避免誤將碎片離子歸屬為反應中間體。本課題組在研究微液滴中吡啶與碘甲烷的反應時,曾意外觀察到m/z79正離子,數值與吡啶的分子質量相同。起初,將該離子歸屬為吡啶自由基正離子,但在后續的研究中發現,只有在高溫和施加管透鏡電壓共同作用的條件下才能觀察到m/z79。本工作表征了包含預期產物離子——甲基吡啶正離子的甲基吡啶鎓六氟磷酸鹽,發現當高溫和管透鏡電壓這2個條件共存時才能夠觀察到m/z79峰,由此確定該峰并不是奇特的反應中間體,而僅是由甲基化產物在特定分析條件下裂解得到的碎片離子?；谶@一現象和上述討論,我們認為在運用微液滴體系研究中間體時,尤其需要注意分析條件的影響,以免得到錯誤結論。

3 結論

本工作使用電噴霧質譜法分析了一系列碳正離子的前體分子,通過改變毛細管溫度以及管透鏡電壓,發現在毛細管高溫和管透鏡電壓共同作用下,前體物質會發生碎裂形成碳正離子。這一系列碳正離子的形成不需要微液滴提供的極端酸性條件,也并不是反應過程的活性中間體。此前,在本課題組關于微液滴條件下電子介導的氧化還原過程的綜述[39]中分別提到了進樣毛細管溫度和離子光學部件對表征結果的不利影響,本工作進一步探究了這2個因素共同存在時對檢測結果的重要影響,同時也證明了相關報道[50]結論的系統性錯誤。

質譜儀的分析參數繁多復雜,為達到理想的分析效果,往往需要協同調整多個離子光學系統的參數。在使用質譜監測反應或捕獲中間體的過程中,這些參數可能會使飛行中的離子發生解離或重排。這些變化并非液滴內反應導致的,而是離子光學系統所加電壓導致的。因此,在使用質譜進行反應機理研究,尤其是中間體捕獲研究時,需要注意各分析條件及它們之間交互作用的影響,避免這些條件引起對化學反應機理研究的誤判。