例析高考試題中的現代生物技術

甘耀平

(浙江省衢州第二中學)

《普通高中生物學課程標準(2017年版2020年修訂)》(以下簡稱“課程標準”)提出注重科學、技術和社會相互關系是貫穿生物學教學的重要主線之一,也是生物學學科核心素養達成的重要途徑,教師應該重視滲透科學、技術、社會相互關系的教育[1]。以生物技術為背景材料的試題是近幾年高考命題的熱點,受到高考命題專家的青睞。這類試題把課本知識和生物技術有機結合,情境新穎而不陌生,考查靈活而不偏頗,能很好地考查學生信息獲取和知識遷移應用等關鍵能力。同時試題體現了較強的時代性、應用性和創新性,指向不同水平核心素養的評價目標。

1.凝膠色譜法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

例1.(2023年全國甲卷37題節選)為了研究蛋白質的結構與功能,常需要從生物材料中分離純化蛋白質。某同學用凝膠色譜法從某種生物材料中分離純化得到了甲、乙、丙3種蛋白質,并對純化得到的3種蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,結果如圖1所示(“+” “-”分別代表電泳槽的陽極和陰極)。已知甲的相對分子質量是乙的2倍,且甲、乙均由一條肽鏈組成?；卮鹣铝袉栴}。

(1)圖中甲、乙、丙在進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時,遷移的方向是____________(填“從上向下”或“從下向上”)。

圖1

(2)圖中丙在凝膠電泳時出現2個條帶,其原因是_______________。

(3)凝膠色譜法可以根據蛋白質________的差異來分離蛋白質。據圖判斷,甲、乙、丙3種蛋白質中最先從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是________,最后從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是________。

參考答案：(1)從上向下 (2)丙由2種相對分子質量不同的肽鏈組成,在SDS的作用下解聚成2種肽鏈,2種肽鏈的電泳遷移率不同 (3)相對分子質量 丙 乙

解析：凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法[2]。它是根據多孔介質對不同大小(體積)和不同形狀的分子的排阻能力不同來分離蛋白質混合物的[3]。所用的凝膠珠(凝膠顆粒)其內部是多孔的網狀結構,目前常用的凝膠有交聯葡聚糖、聚丙烯酰胺和瓊脂糖等。凝膠色譜法分離的原理是當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠柱時,比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠珠內的網狀結構,只能在凝膠外部移動,隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動,其移動距離較短,移動速度也較快,就最先流出柱外;比凝膠珠孔徑小的分子則不同程度地出入凝膠珠內外。這樣不同大小(或相對分子質量)的蛋白質分子由于所經過的路徑不同而得以分離,大分子(或相對分子質量大)的蛋白質先被洗脫出來,小分子(或相對分子質量小)的蛋白質后被洗脫出來。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是在聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的電泳方式。SDS是一種變性劑,它能破壞蛋白質分子中的氫鍵和疏水鍵相互作用,能使蛋白質的多肽鏈處于展開狀態[3]。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈,因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS以其烴鏈與各種蛋白質分子的側鏈通過疏水作用結合成復合體,SDS所帶的負電荷量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異,同時SDS使蛋白質都呈同樣的棒狀形態。因此SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳幾乎是完全根據蛋白質相對分子質量分離蛋白質的,蛋白質相對分子質量越小,遷移越快。

2.熒光蛋白標記技術

例2.(2023年全國乙卷38題節選)GFP是水母體內存在的能發綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料,利用基因工程技術獲得了能發其他顏色熒光的蛋白,豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。

(3)科研人員將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達,發現大腸桿菌有的發綠色熒光,有的發黃色熒光,有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析,發綠色熒光的可能原因是_________(答出1點即可)。

(4)新蛋白與突變基因的關聯性分析。將上述發黃色熒光的大腸桿菌分離純化后,對其所含的GFP突變基因進行測序,發現其堿基序列與GFP基因的不同,將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達,實驗思路是______________。

參考答案：(3)GFP基因雖然發生了突變,但由于存在密碼的簡并現象,突變基因所編碼的氨基酸序列并未改變 (4)將YFP基因插入表達載體,再將構建成功的重組載體導入不能發黃色熒光的真核細胞中,觀察黃色熒光是否出現

解析：熒光蛋白標記是指利用不同顏色熒光質粒通過某種方式結合其他生物,最終攜帶有顏色熒光且不影響生物正常生理生長的一種方法。因其高靈敏度備受研究者關注,成為目前生物大分子檢測的主要方法[4]。

熒光蛋白主要包括綠色、黃色和紅色3種,綠色熒光蛋白(GFP)是最早從水母分離得到的發光蛋白,由238個氨基酸組成,可在多種生物中廣譜表達而發出綠色熒光。下村修、馬丁·查爾菲和錢永健三位科學家因首次發現綠色熒光蛋白并在其應用上做出了突出貢獻而獲得了2008年諾貝爾化學獎。黃色熒光蛋白(YFP)最初來自維多利亞多管水母,是GFP的突變體,其第203位由蘇氨酸變為酪氨酸。紅色熒光蛋白(RFP)最初從珊瑚蟲中分離,是GFP的同源熒光蛋白。熒光蛋白標記技術可充分利用不同顏色的熒光穩定性特點,能快速標記且檢測簡單,能穩定遺傳且有最佳的示蹤結果[4]。

3.放射自顯影技術

例3.(2023年1月浙江省選考第23題節選)研究光合產物從源分配到庫時,給葉片供應13CO2,13CO2先與葉綠體內的________結合而被固定,形成的產物還原為糖需接受光反應合成的________中的化學能。合成的糖分子運輸到果實等庫中。在本實驗中,選用13CO2的原因有_________(答出2點即可)。

參考答案：五碳糖(C5) ATP和NADPH CO2是光合作用的原料;13C可被儀器檢測;13C在自然界中含量極少且穩定

解析：放射自顯影技術是利用放射性同位素的電離射線對乳膠(含AgBr或AgCl)的感光作用,對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究的一種細胞化學技術。對細胞或生物體內生物大分子進行動態研究和追蹤是這一技術獨具的特征[5]。常用于生物學研究的同位素及其性質如表1所示,根據實驗要求可選擇合適的同位素。

表1 常用放射性同位素的基本特性[5][6]

科學史上,研究DNA是遺傳物質時,選用32P標記噬菌體的DNA;研究DNA復制時選用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR);研究RNA合成時選用3H標記的尿嘧啶核苷(3H-U);研究蛋白質合成和代謝時,選用35S標記的甲硫氨酸(蛋氨酸)、3H或14C標記的亮氨酸等;卡爾文研究光合作用時,選用14C標記的CO2;研究甲狀腺的功能時,選用131I標記的NaI。

4.miRNA和siRNA介導的RNA干擾技術

例4.(2023年廣東卷17題節選)放射性心臟損傷是由電離輻射誘導的大量心肌細胞凋亡產生的心臟疾病。一項新的研究表明,circRNA可以通過miRNA調控P基因表達進而影響細胞凋亡,調控機制見圖2。miRNA是細胞內一種單鏈小分子RNA,可與mRNA靶向結合并使其降解。circRNA是細胞內一種閉合環狀RNA,可靶向結合miRNA使其不能與mRNA結合,從而提高mRNA的翻譯水平。

圖2

回答下列問題:

(2)前體mRNA是通過________酶以DNA的一條鏈為模板合成的,可被剪切成circRNA等多種RNA。circRNA和mRNA在細胞質中通過對________的競爭性結合,調節基因表達。

(3)據圖分析,miRNA表達量升高可影響細胞凋亡,其可能的原因是_______________。

參考答案：(2)RNA聚合 miRNA (3)miRNA表達量升高會阻斷P基因的mRNA合成P蛋白,降低P蛋白對細胞凋亡的抑制作用,促進細胞凋亡

例5.(2023年湖南卷7題)基因Bax和Bcl-2分別促進和抑制細胞凋亡。研究人員利用siRNA干擾技術降低TRPM7基因表達,研究其對細胞凋亡的影響,結果如圖3所示。下列敘述錯誤的是

( )

圖3

A.細胞衰老和細胞凋亡都受遺傳信息的調控

B.TRPM7基因可能通過抑制Bax基因的表達來抑制細胞凋亡

C.TRPM7基因可能通過促進Bcl-2基因的表達來抑制細胞凋亡

D.可通過特異性促進癌細胞中TRPM7基因的表達來治療相關癌癥

參考答案：D

解析：RNA干擾(RNAi)是指通過形成特定雙鏈RNA使目標mRNA發生降解或者翻譯受到阻遏,從而特異性地抑制目標基因在翻譯水平上表達的現象[7]。RNA干擾有兩種類型,即miRNA和siRNA。這兩類干擾RNA來源不同,作用機制和作用效果基本相同:成熟的形式都是短的雙鏈RNA;在發揮作用時,與蛋白質結合形成沉默復合物;在ATP供能的作用下,雙鏈RNA解開,并促使其與mRNA配對,結果使mRNA降解或使其翻譯受阻。

表2 miRNA和siRNA的比較

5.逆轉錄PCR技術和原位雜交技術

例6.(2022年1月浙江選考第29題節選)我國在新冠疫情防控方面取得了顯著的成績,但全球疫情形勢仍然非常嚴峻,尤其是病毒出現了新變異株——德爾塔、奧密克戎,更是威脅著全人類的生命健康。

(1)新冠病毒核酸定性檢測原理是:以新冠病毒的單鏈RNA為模板,利用____________酶合成DNA,經PCR擴增,然后在擴增產物中加入特異的____________,如果檢測到特異的雜交分子則核酸檢測為陽性。

參考答案：逆轉錄 核酸探針

解析：逆轉錄PCR技術(RT-PCR)是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種變式應用,其基本原理是在逆轉錄酶的作用下以RNA為模板合成cDNA,然后利用DNA聚合酶,以cDNA為模板合成雙鏈DNA,再用常規PCR技術擴增出大量DNA[8](具體過程如圖4所示)。

圖4 逆轉錄PCR過程示意圖

逆轉錄PCR技術可用于獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統等,還可以用來分析不同組織細胞或是相同組織細胞在不同發育階段中mRNA的表達情況。

原位雜交技術是細胞內特異核酸(DNA或RNA)定性與定位的重要方法,其原理是利用報告分子(如熒光素、生物素等)標記核酸探針,然后將探針與染色體或DNA顯微切片上的靶DNA雜交,若兩者同源互補,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。原位雜交技術在顯微與亞顯微水平上基因定位、特異mRNA表達等問題的研究中具有重要作用[5]。

6.CRISPR/Cas9基因編輯技術

例7.(2021年6月浙江省選考第20題)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點插入到受精卵的Y染色體上,獲得轉基因雄性小鼠。該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配,通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是

( )

A.基因編輯處理的受精卵在體外培養時,不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液

B.基因編輯處理的受精卵經體外培養至2細胞期,須將其植入同期發情小鼠的子宮,才可獲得表達EGFP的小鼠

C.分離能表達EGFP的胚胎干細胞,通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠

D.通過觀察早期胚胎的熒光,能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎

參考答案：B

解析：CRISPR/Cas9基因編輯技術是繼“鋅指核酸酶(ZFN)” “類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現的新一代基因組定點編輯技術,自發現之后迅速發展成為當今最主流的基因編輯方法[9]。

圖5 CRISPR/Cas9系統的功能(根據參考文獻[9]修改)