內分泌腫瘤分子診斷平臺的建立和應用

葉 蕾， 王衛慶

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院內分泌代謝科 上海市內分泌代謝病研究所國家代謝性疾病臨床醫學研究中心（上海） 國家衛健委內分泌代謝病重點實驗室上海市內分泌腫瘤重點實驗室，上海 200025）

分子診斷是指應用分子生物學方法檢測個體遺傳物質的變異實現對疾病的診斷，是檢驗醫學與臨床醫學研究與應用的重要專業領域，其廣泛應用極大推動了臨床醫學的發展。內分泌腫瘤是一大類累及內分泌腺體和細胞的腫瘤，患者面臨腫瘤與激素分泌雙重威脅， 致病基因變異是內分泌腫瘤發生、發展的重要發病機制。 不同基因變異直接決定了腫瘤的生物學行為、治療反應與長期預后。因此，內分泌腫瘤診治的關鍵，過去在于激素分泌的精確評估， 而在分子診斷越來越深入臨床實踐的今天，則是激素分泌評估聯合分子診斷[1]。

內分泌腫瘤致病基因的發現

與其他腫瘤和遺傳病一樣，分子生物學技術尤其是遺傳學技術的進展促成了內分泌腫瘤致病基因的發現。 以多發性內分泌腺瘤病2 型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2）為例，早在1985 年人們通過轉染淋巴瘤DNA 至NIH3T3 細胞， 發現了RET（rearrangement during transfection）基因[1]。但在1993 年之前， 只能通過定位克隆的方法將MEN2 的致病基因定位在10q11.2 約480 kb 的范圍，1993 年由來自英國劍橋大學的Ponder 教授團隊通過PCR 聯合化學切割錯配 （chemical cleavage of mismatch, CCM）的方法成功確認RET點突變導致MEN2[2]。 類似的方法促成了一系列重要內分泌腫瘤致病基因的發現， 比如1997 年發現胚系MEN1基因失活變異導致MEN1，以及GNAS、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphae，cAMP）依賴性蛋白激酶調節亞基1α （cAMP-dependent protein kinase regulatory type Ⅰ-alpha，PRKAR1A）、VHL（von Hippel-Lindau）、 神經纖維瘤病1 型（neurofibromatosis type1,NF1） 與琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH） 等基因突變是內分泌腫瘤的重要病因。 十余年前由于高通量測序技術的發展，迎來了第2 次內分泌腫瘤致病基因發現高峰，比如腎上腺庫欣腺瘤的致病基因PRKACA、 原發性醛固酮增多癥的致病基因內向整流型鉀離子通道亞家族J 成員5 （potassium inwardly-rectifying channel,subfamily J, member 5，KCNJ5）、胰島素瘤的致病基因轉錄因子（Yin Yang 1，YY1），以及腎上腺雙側大結節樣增生的致病基因犰狳重復序列5（armadillo repeat containing 5,ARMC5）等[3]。 目前大多數內分泌腫瘤的致病基因已經明確，這使得臨床的病因診斷成為可能。

分子診斷的臨床意義

檢測上述內分泌腫瘤發生、發展的關鍵致病基因，不僅可以協助疾病早診斷、早治療，還可以指導疾病分層與預后管理，以及作為伴隨診斷指導藥物治療。 例如胚系RET原癌基因突變是遺傳性甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer, MTC）的分子基礎，RET胚系致病突變患者MTC 的外顯率幾乎為100%。 同時，RET基因型與MTC 危險等級之間存在較強的基因型-表型相關關系， 不同危險等級的患者MTC 的發病年齡、腫瘤分期、復發與長期生存率具有明顯差異。 胚系RET原癌基因突變檢測有助于遺傳性MTC 及MEN2 的診斷，MTC 危險等級的判定，術前臨床腫瘤范圍的全面評估，并指導臨床醫師決定手術次序； 家系成員RET基因胚系突變篩查，可實現MTC 的早期診療[4]。其中，對于家系中RET基因突變陽性者， 應定期隨訪以早期發現并診治，同時可考慮預防性甲狀腺切除術；對于有生育需求者， 胚胎植入前遺傳學診斷/篩查使得育齡期患者能夠避免RET突變在家系中的傳遞[4]。 而針對于RET的靶向治療， 包括近年研發的選擇性RET抑制劑如塞普替尼（selpercatinib）和普拉替尼（pralsetinib）， 有望為晚期進展性MTC 提供有效的治療機會[5]。

目前， 多個國內外權威指南推薦進行內分泌腫瘤相關致病基因檢測，比如2014 年嗜鉻細胞瘤診治指南（美國內分泌學會）推薦所有嗜鉻細胞瘤患者應該考慮進行基因檢測，可用臨床特征驅動的診斷流程決定優先選擇特定的基因檢測，副神經節瘤患者進行SDH突變檢測，轉移患者進行SDHB基因突變檢測[6]；《中國抗癌協會神經內分泌腫瘤診治指南（2022 年版）》推薦檢測遺傳腫瘤綜合征的致病基因以協助此類疾病的診斷[7]；《甲狀腺髓樣癌診斷與治療中國專家共識（2020 版）》推薦MTC 患者等5 類人群進行RET基因篩查和遺傳咨詢[8]。

實驗室要求

臨床分子檢測應遵循《醫療機構臨床基因擴增實驗室》等要求完成。 分子檢測實驗特別是高通量測序的操作步驟多、程序復雜，濕實驗包括樣本處理（取材與運輸和核酸提?。?，文庫構建、靶向序列富集與測序等； 干實驗包括測序后數據質量分析、比對、變異識別、注釋和結果報告與解釋等生物信息學分析流程。 分子檢測實驗室各功能區需有嚴格有序的物理分隔及持續的通風換氣，以避免核酸氣溶膠引起的交叉污染，還需注意各功能區物品專用、各功能區域的單一工作流向等；分子檢測各環節必須制定可操作性的標準操作程序并嚴格遵循，進行嚴格的質量控制，包括核酸質量、測序結果的覆蓋深度、均一性、在靶率等。臨床分子檢測還應根據臨床預期用途，進行性能確認，包括準確性、精密度、檢測限等。 腫瘤變異的報告及解釋應遵循標準指南， 如美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）2015 年遺傳性變異解讀指南， 判讀該變異為致病性變異、可能致病性變異、臨床意義未明、可能良性與良性變異[9]；以及2017 年體細胞變異解讀指南（2017 版），從臨床診斷、預后、治療等方面進行評估，將變異分為強臨床意義、潛在臨床意義、臨床意義不明、良性4 類[10]。

與內分泌腫瘤發生相關的基因種類繁多，且遺傳性內分泌腫瘤臨床癥狀常表現為綜合征的形式，各種遺傳性內分泌腫瘤綜合征的癥狀互有重疊。因此對單基因突變的檢查不能很好地滿足對內分泌腫瘤的高效率基因診斷。目前針對內分泌腫瘤尚無靶向測序panel，且已有的廣譜腫瘤診斷panel 不能很好地覆蓋內分泌腫瘤的高頻率突變基因。為了更有效地服務于內分泌腫瘤的臨床診治，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院（瑞金醫院）內分泌代謝科自建神經內分泌腫瘤基因突變檢測方法[11]，可以明確38.1%神經內分泌腫瘤患者分子分型。 基因檢測適用于內分泌腫瘤的診斷和分子分型，適用樣本包括外周血樣本、新鮮組織樣本，亦適用于靶向藥治療方案選擇指導。

瑞金醫院內分泌腫瘤特色

瑞金醫院內分泌代謝科于20 世紀50 年代成功診治國內第1 例原發性醛固酮增多癥，2003 年報道了國內第1 例基因診斷明確的MEN2[12]。 以此為基礎，逐步建立基因檢測平臺，協助內分泌腫瘤的臨床診療，2007 年成功建立科學完備的程式化基因診斷平臺。 2008 年“單基因遺傳性內分泌疾病的基礎研究和臨床應用”獲得國家科技進步獎二等獎。 2010 年后利用高通量測序技術，發現多種致病新基因與分子標志物，包括發現65.5%腎上腺庫欣腺瘤存在PRKACAL205R熱點突變， 突變型腫瘤體積小、分泌能力強、StAR表達強陽性[13]；報道30%胰島細胞瘤存在YY1T372R位點突變， 突變型起病年齡大[14]；發現24.3%甲狀腺腺瘤樣結節存在SPOPP94R/EZH1Q571R/ZNF148特異基因變異， 為良性結節分子標志物[15]；循證證實人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2） 表達可預測嗜鉻細胞瘤轉移，預測率達77%[16]。 2017 年“內分泌腫瘤發病機制新發現與臨床診治技術的建立和應用”獲得國家科技進步獎二等獎。目前已建立國際單中心最大的多個基因型明確的疾病隊列，如多發性內分泌腺瘤病，嗜鉻細胞瘤，原發性醛固酮增多癥、原發性雙側大結節樣腎上腺增生癥，先天性腎上腺皮質增生癥等。 提出疾病預后與治療反應的基因型特征，如KCNJ5突變型腺瘤型原發性醛固酮增多癥手術效果好[17]。 目前分子診斷平臺通過內分泌疑難病例報告系統向全國通道開放，可通過上海市內分泌代謝病研究所微信公眾號“疑難病例”模塊注冊登錄，已向全國30 余家單位提供相關基因檢測服務。