腫瘤微環境中間充質干細胞與癌癥干細胞的關系及其在乳腺癌進展中的作用

李婷婷 劉燕

作者單位：530021 南寧 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺及骨軟組織腫瘤內科

最新癌癥統計數據顯示，乳腺癌的發病率在女性癌癥中居于首位［1］。在乳腺癌的治療過程中，復發轉移和耐藥會降低患者的整體療效，因此復發轉移和耐藥成為亟需解決的難題。癌癥干細胞（cancer stem cells，CSCs）是顯示干細胞特征的癌細胞亞群，被認為是腫瘤發生、耐藥及復發轉移的重要原因［2］。在乳腺癌中，CSCs 也與耐藥及復發關系密切，有研究報道紫杉醇抗性三陰性乳腺癌細胞較親本細胞顯示出更高的球體形成潛力和乳腺癌干細胞（breast cancer stem cells，BCSCs）亞群比例［3］。并且CSCs 也與乳腺癌患者的惡性分級/分期及預后相關［4］。因此闡明乳腺癌細胞獲得干性的機制，對進一步深入理解乳腺癌耐藥的發生機制，以及開發具有臨床應用前景的新型靶點藥物都具有重要意義。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有自我更新能力、多向分化潛能的干細胞，最早在骨髓基質中被發現，隨后在臍帶、骨髓、脂肪等多種組織中也發現其存在。MSCs 細胞表面表達CD73、CD90、CD105 等分子，具有分化為至少兩種間充質衍生細胞類型的能力［5］。作為腫瘤微環境中的重要組分，MSCs 對腫瘤的發生和發展有著至關重要的作用，能通過直接或間接接觸的方式改變乳腺癌細胞的干性分子表達水平，導致乳腺癌細胞向BCSCs 轉變，進而促進乳腺癌治療耐藥或復發轉移等癌癥進展的發生。本文就MSCs 和CSCs 在乳腺癌進展中的作用以及兩者的潛在聯系進行闡述，為后續開發新的治療方案以改善乳腺癌患者預后提供方向和借鑒。

1 BCSCs

CSCs 是具有高致瘤效力以及干細胞性質的癌細胞亞群［6］。在乳腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌和前列腺癌等多種實體瘤中均有發現。但在腫瘤微環境中，CSCs的比例較低（＜5%），且與其他類型干細胞具有相似性［7-8］，這加大了特異性識別并靶向CSCs 的難度。目前，CSCs 干性抑制藥物在直腸癌［9］、胃癌［10］、膠質瘤［11］中均展現了優秀的抗腫瘤特性和潛在的臨床應用價值。但關于靶向BCSCs 藥物的相關研究尚在探索中。因此，進一步深入探索BCSCs的調控機制及其標志物具有重要的臨床意義。

1.1 BCSCs的分離純化及鑒定

基于BCSCs的特性，目前開發了多種BCSCs的分選方法：⑴通過檢測BCSCs表面分子標志物進行細胞分選。⑵采用無標記BCSCs 分選方法。無標記分選細胞方法利用細胞固有的物理生物特性來分離和分類細胞，不依賴于使用生化標志物來給細胞加上信號標簽。2015 年，有研究基于細胞黏附特性，將低黏附細胞與高黏附細胞進行區分，成功富集了BCSCs［12］。⑶采用側群（side population，SP）細胞分選技術。該技術是在Hoechst 33342 染色后，利用流式細胞儀分析呈Hoechst 33342 低染的細胞［13］，在多發性骨髓瘤［14］中應用最為廣泛，在BCSCs 分選鑒定中也有應用［15］。⑷通過體外成球實驗使CSCs 可以在非黏附、非分化條件下培養細胞富集［16］。以上四種方法中，流式分選細胞表面標志物方法應用最廣泛，但該方法受限于表面標志物的選擇。目前CSCs 尚無明確的通用表面標志物，且標志物的選擇因各癌種及各亞型而異。側群細胞分選技術不依賴于細胞表面標志物，但細胞分選純度較低，異質性高。體外成球實驗在分選CSCs中應用較少，主要是作為鑒定細胞干性的常規實驗。而無標記分選方法是近年來出現的較新的CSCs 分選方法，對于該方法的研究目前比較局限，尚需進一步的探索和完善。

1.2 BCSCs表面標志物

CSCs 標志物的表達因癌癥亞型而異，甚至在同一亞型患者之間也存在差異［17］。關于BCSCs 的表面標志物，自2005 年PONTI 等［18］研究發現表達CD44+/CD24-/low的乳腺癌細胞保留了致瘤活性并顯示干細胞樣特性以來，CD44+/CD24-/low 就被作為BCSCs 的經典表面標志物在乳腺癌干性模型研究中廣泛應用［19］，但僅依靠CD44 和CD24 的表達并不能完全識別所有乳腺癌亞型的干細胞［20］。直至2007 年，GINESTIER 等［21］研究表明ALDH1 是人類正常和惡性BCSCs 的標志物，可作為BCSCs 的表面標志物之一，自此ALDH1與CD44+/CD24-/low共同作為分選和鑒定BCSCs 的標志物。近期研究發現，白血病中CSCs 標志物CD96也在BCSCs 中高表達［22］，但其作用仍需進一步研究。

1.3 BCSCs在乳腺癌進展中的作用及機制

1.3.1 BCSCs 在乳腺癌進展中的作用 BCSCs 在乳腺癌的復發、轉移和治療耐藥過程中有著至關重要的作用［23］。WU 等［24］發現BCSCs 能通過其自身分泌的DKK1 增加SLC7A11 的表達，以保護轉移的癌細胞免受脂質過氧化和鐵死亡，從而促進了乳腺癌轉移。在癌癥轉移過程中，腫瘤細胞可能會進入休眠狀態，到達轉移部位后，在適宜的環境下再次增殖，形成轉移［25］。BCSCs以其獨特的無限自我更新能力，促進并形成轉移性休眠后的乳腺癌復發［26］?；?、放療等會增加乳腺癌微環境中的CSCs 比例而導致治療失敗和疾病復發［27］，通過阻斷化療誘導的BCSCs 富集，可以延長化療后腫瘤復發的時間［28］。BCSCs 還可以通過激活NF-κB 信號通路促進乳腺癌的化療耐藥［29］。BEZIAUD 等［30］研究發現，免疫治療會促進BCSCs 標志物的表達增加，在乳腺癌小鼠模型中BCSCs不僅顯示出對T 細胞毒性的抵抗力增強，而且由活化的T 細胞產生的干擾素γ（IFNγ）可直接將非BCSCs 轉化為BCSCs，表明BCSCs 與乳腺癌的免疫治療抗性密切相關。以上研究結果提示，BCSCs 在乳腺癌復發、轉移、治療耐藥等方面均有影響，靶向清除BCSCs可能是有益于乳腺癌轉變復發、轉移和治療耐藥的潛在途徑。

1.3.2 乳腺癌細胞干性表達的調控機制 相較于正常的乳腺癌細胞亞群，BCSCs 具有更強的成瘤能力且更易對治療產生抵抗性。BCSCs 在化療藥物刺激下會促進CSCs 的自我更新能力［31］，腫瘤微環境則是CSCs 增強耐藥機制的“巢穴”［32］。目前，BCSCs 相關調控機制主要包括以下方面：⑴上皮-間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）可以賦予癌細胞類似干細胞的表型。PARK 等［33］證明了乳腺癌化療藥物紫杉醇誘導的間充質性狀增強了癌細胞的干性，并且部分由SNAIL 介導。⑵通過干性相關信號通路TGF-β、Hippo、Wnt、Notch、JNK-JUN 等調控乳腺癌細胞干性［34］?；熣T導的TGF-β 信號傳導可通過IL-8依賴性CSCs 擴增促使腫瘤復發［35］；Hippo 信號通路能維持BCSCs 的自我更新和腫瘤起始能力［36］；另外，還有一種獨特亞型的未成熟自然殺傷細胞Socs3highCD11bCD27，在小鼠中可通過Wnt 信號激活癌癥干細胞［37］。⑶lncRNA、miRNA、RNA結合蛋白等多種分子可以通過激活干性相關通路，維持或促進乳腺癌細胞的干性。如長鏈非編碼RNA lnc030 可以與PCBP2 協同穩定SQLE mRNA，從而增加膽固醇合成，激活PI3K/Akt 信號通路，維持乳腺癌干細胞的干性［38］。RNA 結合蛋白Lin28B 可以能通過增強乳腺癌細胞的干性促進乳腺癌的進展［39］。⑷通過調控代謝相關基因維持乳腺癌細胞干性。WANG 等［40］發現脂肪酸β氧化是維持BCSCs 所必需的，并有助于乳腺癌的化療耐藥。另外，BCSCs 主要代謝模式為有氧糖酵解，與Caveolin-1（Cav-1）的下調相關，因此Cav-1靶向治療也可能是消除BCSCs有希望的策略［41］。⑸生物力學環境。生物力學環境對CSCs 具有一定的支持作用。LIU 等［42］通過使用超聲彈性成像和原子力顯微鏡檢查手術樣本，發現基質硬度增加與乳腺癌患者對新輔助化療反應差、預后較差和CSCs 富集有關。該研究還發現生物力學激活的TAZ通過與NANOG分離增強了CSCs 性能。腫瘤微環境的缺氧特性也參與癌細胞的干性調控，而缺氧也會導致BCSCs富集。⑹其他調控機制。有研究通過轉錄組學分析鑒定出一種支架蛋白SH3RF3（也稱為POSH2），其在乳腺癌組織及細胞系的CSCs中均表達上調，而且能增強乳腺癌細胞的CSC性質［43］。還有研究報道，維生素D可通過下調乳腺癌干細胞CSCSUM159 中的Wnt/β-catenin 信號通路活性進而抑制BCSCs［44］?？傊?，目前對于乳腺癌細胞干性的調控機制的探索仍在不斷地拓展中，其中干性相關通路是研究的熱點及重點，未來繼續深入研究并闡明其中調控機制，對開發針對BCSCs的治療方案，以及改善乳腺癌患者的預后具有重要意義。

2 MSCs

2.1 MSCs在腫瘤免疫微環境中的作用

MSCs 具有炎癥趨向性，并且在多種實體瘤包括乳腺癌組織中已證實MSC 的存在［45］。MSCs 在腫瘤微環境中主要通過調節免疫、旁分泌等方式影響腫瘤進展。有研究發現，處于轉移前階段的肺間充質基質細胞（LMSC）中補體3（C3）上調，促進了中性粒細胞募集和中性粒細胞外陷阱（NETs）的形成，從而促進癌細胞轉移到肺部［46］。另外，MSCs中Hedgehog信號激活能促進成骨細胞分化，成骨細胞沉積膠原蛋白，通過抑制性LAIR1信號傳導抑制NK細胞并促進腫瘤定植［47］。

2.2 MSCs在腫瘤基質微環境中的作用

近年來，有研究表明，MSCs 可以分化為癌癥相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAFs）而發揮作用［48］。而Grem1 蛋白是乳腺癌細胞與CAFs 相互作用的關鍵因素，可促進癌細胞侵襲［49］。還有研究在脂肪來源的間充質干細胞（ADSCs）與MCF-7 在基質凝膠共培養的結果中發現ADSCs 具有腫瘤趨向性，這可能是受趨化因子的調節，例如巨噬細胞炎癥蛋白（MIP）-1δ 和MIP-3α 等；此外還發現ADSCs 能在體外誘導腫瘤球形成并促進體內致瘤性［50］。MSCs除了具有促腫瘤作用外，也在部分研究中顯示了抗腫瘤和抗轉移特性，其具體作用取決于促腫瘤和抗腫瘤分子分泌的平衡［51］。例如有研究發現人臍帶間充質干細胞來源的外泌體通過miR-21-5p/ZNF367 途徑抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲［52］。由此可見，MSCs 在腫瘤進展中的作用具有多樣性，機制繁雜，仍需進一步深入研究。

3 CSCs和MSCs在乳腺癌中的調控關系

關于MSCs在乳腺癌進展中的機制研究已廣泛開展，但大部分研究集中在MSCs 與正常乳腺癌細胞之間的串擾，對于MSCs 與CSCs 之間的作用機制網絡還知之甚少。細胞之間通過多種途徑傳遞信號進行信息交流，從而發生作用。細胞間的通訊方式可分為直接接觸和間接接觸，直接接觸包括細胞間的識別和結合或通過通道進行信息交換等；間接接觸主要是通過細胞外基質中的介質，如細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等傳遞具有生物活性的因子或信號分子，或細胞直接釋放信號分子來進行細胞間的信息傳遞。

3.1 MSCs通過與CSCs直接接觸影響乳腺癌細胞的干性

LIU等［53］將SUM159乳腺癌細胞與人骨髓來源的MSCs 共培養后，通過流式細胞術分離細胞群，并通過ALDEFLUOR 測定法評估表達ALDH 的群體，發現相較單獨培養，與MSCs 共培養的ALDH+乳腺癌細胞比例提高了3 倍以上。說明MSCs 對乳腺癌細胞的干性有促進作用，且該作用可由兩種細胞直接接觸發生。PATEL 等［54］在調查不同的乳腺癌細胞亞群如何與MSCs 相互作用以極化T 細胞反應的過程中發現，CSCs 與MSCs 的親和力度最高。在一項近期研究［55］中也發現，MSCs 與ER+乳腺癌細胞直接接觸共培養，可使乳腺癌細胞獲得癌癥干樣表型，并且對標準抗雌激素藥物的耐藥性增強。

3.2 MSCs通過外泌體傳遞誘導乳腺癌干性表達的信息

EVs 是一類從細胞釋放到細胞外基質的膜性囊泡，根據其直徑和發生方式的不同，主要分為外泌體（exosome，EXO）、微泡、凋亡小體和癌小體。外泌體因其包含復雜的RNA 和蛋白質，可以穿梭傳遞多種信號分子，在細胞通訊中發揮重要調節作用，故而研究最為廣泛。迄今為止，外泌體在癌癥診斷、癌癥治療和預后預測中已經顯示出巨大的潛力［56］。有研究將人骨髓來源的MSCs與骨髓轉移性人乳腺癌細胞系共培養后，可觀察到乳腺癌細胞增殖、侵襲能力被抑制，干細胞樣表面標志物的豐度和對多西他賽的敏感性降低；同時，提取MSCs培養上清液的外泌體與乳腺癌細胞系共培養后也觀察到了同樣的現象，經過進一步研究發現該作用主要是由外泌體中的miR23b 及其靶基因MARCKS 介導［57］。說明MSCs 外泌體對乳腺癌細胞干性表達具有潛在的影響。此觀點在2021年，SANDIFORD等［58］的研究中也得到了進一步驗證。該研究發現MSCs分泌的EVs主要影響Wnt信號通路，在乳腺癌細胞去分化為BCSCs的過程中發揮作用。綜上所述，MSCs可能通過外泌體介導傳遞信號分子影響乳腺癌細胞的干性，但仍需在更多的實驗中加以驗證。

4 BCSCs在乳腺癌治療中的前景

自BCSCs 在乳腺癌進展中的關鍵作用被發現以來，研究者開展了諸多相關機制研究，極大地豐富了乳腺癌治療靶點，在充分理解BCSCs的上游表達機制和下游生物學功能的基礎上，BCSCs 在乳腺癌治療中顯示了巨大的應用前景：⑴通過構建納米遞送平臺實現CSCs的靶向治療。SUN等［59］設計了一種基于金納米顆粒的藥物遞送系統，將化療藥物多柔比星遞送到CSCs，降低了乳腺球形成能力和癌癥起始活性，并抑制了小鼠模型中的腫瘤生長。該研究改變了常規化療藥物無法殺傷CSCs 并且反而富集CSCs 的缺陷，使傳統的化療藥物有望用于癌癥干細胞治療。⑵通過新型疫苗接種方法消除CSCs。該方法可通過將ALDH表位肽傳送到抗原提呈細胞（APCs），從而引起T細胞反應，抑制ALDHhigh的CSCs，可能為CSCs 的癌癥免疫治療開辟新的途徑［60］。⑶改變CSCs 的生物學功能。FTO 是一種核糖核酸N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，具有致癌作用。有研究表明，FTO 在CSCs 自我更新和免疫逃避中起著關鍵作用，通過靶向抑制FTO，可以減弱CSCs的自我更新，顯示了靶向CSCs的癌癥治療潛力［61］。還有研究報道，二甲雙胍可介導miR-708靶向抑制CD47，從而抑制BCSCs的自我更新能力［62］。另外，BCSCs 普遍存在于乏氧腫瘤環境中，因此傳統化療對BCSCs 的效果不佳。KIM 等［63］報道了一種分子結構AzCDF，可以在乏氧腫瘤環境中選擇性地靶向BCSCs，從而減少CSCs 遷移，延緩腫瘤生長，并降低腫瘤發生率。⑷靶向BCSCs表面標志物消除CSCs。目前該途徑仍具有挑戰性，但最近一項研究發現，exportin-1（又稱CRM1，是一種染色體維持蛋白）與乳腺癌細胞的活力和凋亡有關［64］。其天然高效小分子拮抗劑LFS-1107 可以選擇性消除CD44+CD24-富集的BCSCs，并在體內外實驗以及來源于臨床患者樣本的類器官中得到了驗證［65］。除了以上方面，XIONG 等［66］設計了一種基于pH 響應性羥乙基淀粉前藥、銅離子和葡萄糖氧化酶（GOD）自組裝的多功能級聯生物反應器（HCG），其由高壓氧（HBO）賦能，主要用于侵襲性乳腺癌治療，該研究顯示HCG 與HBO結合可顯著抑制原位乳腺腫瘤的生長，并能通過抑制CSCs抑制肺轉移。綜上所述，目前諸多研究已經在細胞和動物模型中驗證了通過靶向抑制或消除CSCs對乳腺癌進展具有重要作用，顯示了BCSCs巨大的潛在治療作用，但是在臨床試驗中基于CSCs治療方案的高質量研究仍有很大空缺，需進一步加深對CSCs調控腫瘤進展作用機制的理解，為臨床轉化奠定基礎。

5 小結

BCSCs 在乳腺癌的發生及進展中扮演重要角色，是乳腺癌治療中的關鍵靶點。但目前對于BCSCs 的研究尚處于初步階段，現有臨床轉化研究結果仍不理想。在乳腺癌腫瘤微環境中，MSCs 能通過直接或間接接觸引起乳腺癌細胞的干性改變，進而影響細胞表面干性相關標志物的表達和乳腺癌細胞的去分化等，但具體機制尚未完全闡明。未來進一步深入了解MSCs 與BCSCs 的調控機制，可能為靶向BCSCs 相關治療提供一個新的切入點，有益于改變當前靶向BCSCs 的治療困境，對改善乳腺癌患者預后具有重要的臨床意義。