氣相色譜法測定葛根和淫羊藿總黃酮提取物中大孔樹脂有機殘留物

郭韻妍 郝娟 招嘉文 任賓 周瑩樂 胡時先 王菩彥

（1.國藥集團德眾〔佛山〕藥業有限公司，廣東佛山528000；2.新疆華春生物藥業股份有限公司，新疆烏魯木齊830000）

【摘要】目的：建立葛根和淫羊藿總黃酮提取物中大孔吸附樹脂7種有機殘留物的含量測定方法。方法：采用氣相色譜法，DB-1毛細管柱（柱長為60 m，內徑為0.25 mm，膜厚度為1.0μm），柱溫為程序升溫，起始溫度為40℃，再以4℃/min升溫至175℃，保持12 min，用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度250℃，進樣口溫度200℃；載氣為氮氣，流速為0.8 mL/min，分流比為20∶1，頂空進樣，頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為50 min。結果：7種有機溶劑殘留物的峰面積與濃度呈良好線性關系，正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、1，2-二乙基苯的平均回收率分別為101%、90%、87%、85%、84%、76%、79%。結論：該方法測定準確度高、精密度重復性好。

【關鍵詞】葛根和淫羊藿總黃酮提取物；大孔樹脂有機殘留物；氣相色譜法；頂空進樣

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.01.011

Determination of Macroporous Resin Organic Residues in Total Flavonoids Extracts of Pueraria lobata and Epimedium grandiflorum by Gas Chromatography

GUO Yunyan1， HAO Juan2*， ZHAO Jiawen1， REN Bin2， ZHOU Yingle1， HU Shixian2， WANG Puyan2

（1. National Pharmaceutical Group dezhong〔Foshan〕Pharmaceutical Co.，Ltd.， Foshan 528000， China； 2. Xinjiang Huachun biopharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 7 kinds of organic residues in the total flavone extracts of radix puerariae and epimedium by macroporous adsorption resin. Method： Gas chromatography was used. DB-1 capillary column （column length： 60 m， inner diameter： 0.25 mm， membrane thickness： 1.0μm）；The column temperature is programmed， the initial temperature is 40℃， and then the temperature is increased to 175℃at 4℃/min per minute for 12 min The detector temperature is 250℃， which is detected by hydrogen flame ionization detector； Injection port temperature 200℃； The carrier gas is nitrogen， and the flow rate is 0.8mL/min. The split ratio is 20∶1. For headspace injection， the equilibrium temperature of the headspace bottle is 90℃and the equilibrium time is 50 min. Results： There is a good linear relationship between the peak areas and concentrations of the residues of seven organic solvents. The average recoveries of n-hexane， benzene， toluene， xylene， styrene， divinylbenzene， 1，2-diethylbenzene are 101%， 90%， 87%， 85%， 84%， 76%， 79%， respectively. Conclusion： The method has high accuracy and repeatability.

Keywords： extracts of total flavonoids from kudzu root and epimedium； organic residue of macroporous resin； gas chromatography； headspace injection

孔吸附樹脂是以苯乙烯和丙酸酯為單體，乙烯苯為交聯劑，甲苯、二甲苯為致孔劑，相互交聯聚合形成的多孔骨架結構。大孔吸附樹脂技術的引進，使中草藥有效單體成分或復方中某一單體成分的指標得到提高。該技術具有快速、高效、方便、靈敏、選擇性好等優點。國內外對大孔吸附樹脂溶劑殘留問題有相應的規定，但內容不全，部分品種無樹脂殘留檢測，缺少樹脂相關通用性技術指導原則，行業標準更新緩慢[1]。新疆華春生物藥業公司上市的發揮抗抑郁作用的參葛補腎膠囊所需要的葛根和淫羊藿總黃酮提取物，以葛根和淫羊藿飲片按比例以乙醇提取濃縮，經AB-8大孔樹脂吸附而得到的提取物[2-3]。大孔樹脂常見的殘留溶劑包括苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷。本研究擬建立葛根和淫羊藿總黃酮提取物中大孔吸附樹脂7種有機殘留物的頂空氣相色譜法檢測方法，并在已建立的色譜條件下，檢定3批葛根和淫羊藿總黃酮提取物大孔樹脂的有機溶劑殘留量，為完善葛根和淫羊藿總黃酮提取物質量控制方法奠定試驗基礎。

氣相色譜儀（Agilent 7890B）；純水機（明澈TM-D24UV Millipore密理博）；電子天平（CP225D賽多利斯科學儀器〔北京〕有限公司）；電子天平（BS224S賽多利斯科學儀器〔北京〕有限公司）。正己烷（ALADDIN，C1721099，>99.5%）；苯（Macklin，C13811713，99.9%）；甲苯（佛山西隴，B220701-1，99.5%）；二甲苯（ALADDIN，G1731074，>99.9%）；苯乙烯（Macklin，C13723410，>99.5%）；1，2-二乙基苯（西亞試劑，20220719，99%）；二乙烯苯（西亞試劑，20220419，99.5%）；N，N-二甲基乙酰胺（Fisher chemical，HPLC級，220465）。

2.1色譜條件與系統適用性試驗

以DB-1毛細管柱（柱長為60 m，內徑為0.25 mm，膜厚度為1.0μm）；柱溫為程序升溫，起始溫度為40℃，再以4℃/min升溫至175℃，保持12 min，用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度250℃；進樣口溫度200℃；載氣為氮氣，流速為0.8 mL/min。分流比為20∶1。頂空進樣，頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為50 min。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯對照品適量，加N，N-二甲基乙酰胺制成成每1 mL中分別含20μg、2μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作為對照品貯備液。精密吸取上述貯備液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封，即得。

2.3供試品溶液的制備

取本品約0.1 g，精密稱定，置于20 mL頂空瓶中，精密加入5%N，N-二甲基乙酰胺溶液5 mL，密封，搖勻，即得。

2.4測定方法

分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液（5%N，N-二甲基乙酰胺溶液）、頂空氣體1 mL，注入氣相色譜儀，測定，即得。

2.5分析方法考察

2.5.1專屬性考察

供試品溶液：取供試品按“2.3供試品溶液的制備”制備葛根淫羊藿總黃酮提取物樹脂殘留用供試品溶液。

對照品溶液：稱取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯、苯加N，N-二甲基乙酰胺，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的對照品儲備溶液。精密吸取上述貯備液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封，即得。

陰性對照溶液：以5%N，N-二甲基乙酰胺溶液作為空白溶劑溶液。分別精密量取頂空氣體1 mL，注入氣相色譜儀，測定，即得。結果表明，對各種殘留溶劑定位并進行混合溶劑的分離度試驗，分離度大于1.5。同時空白溶劑對被測溶劑無干擾?？瞻兹軇┲信c對照溶液相應的保留時間沒有色譜峰，說明空白溶劑對樹脂殘留溶劑的測定無干擾，且各目標色譜峰與相鄰色譜峰分離度均符合要求（見圖1—圖4）。這說明以本法測定葛根淫羊藿總黃酮提取物的樹脂殘留具有專屬性。

2.5.2系統適用性考察

精密稱取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯，置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的對照品儲備溶液。精密吸取上述貯備液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封，即得。分別精密量取頂空氣體1 mL，注入氣相色譜儀，測定6次，即得，結果見表1。

結果表明，色譜圖中各目標色譜峰與相鄰色譜峰分離度符合要求（分離度大于1.5）；對照品溶液連續進樣6次，RSD均小于10%。本方法測定葛根淫羊藿總黃酮提取物樹脂殘留系統適用性結果符合要求。

2.5.3標準曲線制備及線性關系考察

對照品儲備液的制備。稱取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯，加N，N-二甲基乙酰胺稀釋至刻度，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的對照品儲備溶液。

精密吸取該對照品儲備溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、3.5、4 mL分別置于100 mL量瓶中，上述各量瓶分別加5% N，N-二甲基乙酰胺至刻度，搖勻，制成7個濃度系列的對照品溶液。精密量取5 mL，置20 mL頂空瓶中，密封，即得。

分別精密吸取7個濃度系列的對照品溶液頂空氣體1 mL，注入氣相色譜儀，按既定色譜條件下進樣測定，測定各自峰面積。以進樣濃度X（μg·mL-1）對應峰面積Y進行線性回歸，結果見表2。

結果表明，苯在0.010570～0.084556μg/mL、正己烷在0.110346～0.882764μg/mL、甲苯在0.109948～0.879580μg/mL、二甲苯在0.107292～0.858340μg/mL、苯乙烯在0.127062～1.016492μg/mL、1，2-二乙基苯在0.113454～0.907632μg/mL、二乙烯苯在0.110744～0.885948μg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.5.4精密度試驗

2.5.4.1重復性試驗

取同一批葛根和淫羊藿總黃酮提取物（批號：G21003）6份，分別按“2.3項供試品溶液的制備”制成6份供試品溶液。測定每一份含量，每份測定1次。結果樣品中平均含量：1，2-二乙基苯為0.000024%，RSD為7.6%；甲苯為0.000021%，RSD為9.7%，其余均未檢出，表明本測定方法的重復性良好。結果見表3、表4。

2.5.4.2中間精密度

不同操作人員分別取同一批次葛根淫羊藿總黃酮提取物（批號：G21003）2份，按“2.3供試品溶液制備方法”制成4份供試品溶液。測定每份含量，每份測定1次。結果測定的樣品中平均含量。檢驗員A：1，2-二乙基苯為0.000024%，檢驗員B：1，2-二乙基苯為0.000020%，兩者之間RSD=9.1%。檢驗員A：甲苯為0.000020%，檢驗員B：甲苯為0.000020%，兩者之間RSD=0。這表明本測定方法中間精密度良好。結果見表5。

2.5.5準確度試驗

取已知含量的葛根淫羊藿總黃酮提取物（批號：G21003）6份，每份0.1 g，置于20 mL頂空瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙基苯的濃度分別為：0.441382、0.042278、0.439790、0.429170、0.508246、0.453816、0.442974μg·mL-1）5 mL，搖勻，定容，即得。按既定色譜條件下進樣1 mL測定。計算加樣回收率。加樣回收率的計算公式為：

式中，A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量；C為待測品測得濃度。

各份樣品的回收率情況見表6。

從表6中可知，回收率分別為：正己烷平均回收率為101%，RSD為5.0%；苯平均回收率為90%，RSD為4.3%；甲苯平均回收率為87%，RSD為3.4%；二甲苯平均回收率為85%，RSD為3.0%；苯乙烯平均回收率為84%，RSD為2.8%；1，2-二乙基苯平均回收率為79%，RSD為3.7%；二乙烯苯平均回收率為76%，RSD為2.2%，因而該方法的準確度良好。

2.5.6耐用性試驗

2.5.6.1穩定性試驗

稱取葛根淫羊藿總黃酮提取物7份（批號：G21003），每份0.1 g，置于20 mL頂空瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙基苯的濃度分別為：0.441382、0.042278、0.439790、0.429170、0.508246、0.453816、0.442974μg·mL-1）5 mL，密封，搖勻，即得。

按既定色譜條件下進樣1 mL測定。供試品溶液（批號：G21003），分別于0、6、12、18、24、33、39 h時間點測定，測得各目標峰峰面積結果表7所示，結果表明供試品溶液在39 h內完成測定，測得數據穩定。

2.5.6.2頂空條件微小變動的影響

取葛根和淫羊藿總黃酮提取物（批號：G21003），分別按“2.3供試品溶液制備方法”制成4份供試品溶液，測定每份的含量，每份測定1次。

頂空條件設置為：1）頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為30 min；2）頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為40 min；3）頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為50 min；4）頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時間為30 min。其余同“2.1”項下色譜條件。結果見表8。

2.5.7檢測限和定量限

將苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、1，2-二乙基苯、正己烷各對照品儲備液分別逐步稀釋，精密取5 mL置于20 mL頂空瓶中密封，精密量取頂空氣體1 mL，注入氣相色譜儀，測定。按照對照品溶液色譜圖中的各成分峰高折算，直到檢測峰高為基線噪聲的3倍左右為止（即S/N=3），計算各個成分的最低檢測限。當檢測峰高為基線噪聲的10倍左右（即S/N= 10），計算各成分的最低定量限，結果見表9。

取以上不同濃度的對照溶液進行測定，根據慣例約定本分析方法的檢測限是信噪比約為（3～5）∶1時相應溶液的濃度，定量限是信噪比約（10～15）∶1時相應的溶液濃度。結果：苯的檢測限為0.001755μg·mL-1，定量限為0.004772μg·mL-1；正己烷的檢測限為0.018317μg·mL-1，定量限為0.048131μg·mL-1；甲苯的檢測限為0.002749μg·mL-1，定量限為0.010995μg·mL-1；二甲苯1的檢測限為0.026823μg·mL-1，定量限為0.035031μg·mL-1；二甲苯2的檢測限為0.004292μg·mL-1，定量限為0.017811μg·mL-1；二甲苯3的檢測限為0.010729μg·mL-1，定量限為0.017811μg·mL-1；苯乙烯的檢測限為0.003177μg·mL-1，定量限為0.127062μg·mL-1；1，2-二乙基苯的檢測限為0.001475μg·mL-1，定量限為0.011345μg·mL-1；二乙烯苯1的檢測限為μg·mL-1，定量限為0.048514μg·mL-1；二乙烯苯2的檢測限為0.036158μg·mL-1，定量限為0.001440μg·mL-1；二乙烯苯3的檢測限為0.004430μg·mL-1，定量限為0.018383μg·mL-1；二乙烯苯4的檢測限為0.003765μg·mL-1，定量限為0.027686μg·mL-1。

2.5.8樣品測定

取3個批次葛根和淫羊藿總黃酮提取物（批號：G21001、G21002、G21004）各2份，分別按2.3規定的方法制成2份供試品溶液。測定每份的含量，每份測定1次，結果樣品中平均含量顯示，葛根淫羊藿總黃酮提取物G21001：未檢出；葛根淫羊藿總黃酮提取物G21002：1，2-二乙基苯為0.00002%；葛根淫羊藿總黃酮提取物G21004：1，2-二乙基苯為0.00005%，其余均未檢出。

本研究在葛根淫羊藿總黃酮提取物樣品4個批次中僅G21003檢出甲苯和1，2-二乙基苯，且所含成分很低，甲苯為0.021329μg·g-1，1，2-二乙基苯為0.024376μg·g-1，小于國家標準規定限度。

由于二乙烯苯在色譜中有4個峰[4]，在精密度試驗、線性方程、檢測限和定量限以及回收率試驗中均以4個峰的加和進行計算。

隨著中藥新藥注冊技術要求的不斷提高，建立中藥產品以及中藥新藥中涉及樹脂純化工藝的樹脂殘留物檢測方法，具有較高的參考意義，可為藥品的安全性提供質量保證。

【參考文獻】

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[2]余煊，王欣佩，雷帆，等.太子參葛根淫羊藿復合物抗抑郁作用：與NRSF/NRSE-TPH2信號相關（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2021，30（1）：27-41.

[3]余煊.基于腦內5-HT探討太子神悅抗抑郁的作用機制[D].北京：清華大學，2019.

[4]馬國萍，陳丹，黃群，等.玳玳果降脂提取物中大孔吸附樹脂有機殘留量的頂空氣相色譜分析研究[J].福建醫科大學學報，2017，51（6）：375-380.

【作者簡介】

郭韻妍，女，1989年出生，主管藥師，學士，研究方向為藥物分析方法開發。

通訊作者：郝娟，女，1983年出生，高級實驗師，學士，研究方向為藥物分析方法開發及新藥研究，聯系電話：15894084869，郵箱：863312511@qq.com。

（編輯：侯睿琪）