實驗教學中醋酸纖維素薄膜電泳的條件優化

武麗濤, 李夢瑤, 寧啟蘭, 吳 鋒, 楊旭東, 閆小飛, 蔣小英, 蔣曉剛, 李冬民

(1.西安交通大學 醫學部基礎醫學院生物化學與分子生物學系,陜西 西安 710061; 2.西安交通大學 醫學研究生教學實驗中心,陜西 西安,710061)

在醫學高等教育體系下,實驗教學連接理論教學與學生實踐,對于培養學生的創新型綜合素質起著至關重要的作用[1]。生物化學是醫學及生物學專業學生必須掌握的基礎課程,推進對生物化學實驗教學的改革[2],可以有效促進學生對理論知識的掌握并提高學生的團結協作精神[3]。

蛋白質的分離是蛋白質章節的一項重要內容[4]。使用水平電泳分離血清蛋白是形象反映蛋白質組成的一項重要實驗技術,奠定了生物化學蛋白質特性的基礎。蛋白質在高于或低于其pI的溶液中成為帶電顆粒,在電場中能向正極或負極方向移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術即為電泳[5]。薄膜電泳是將蛋白質溶液點樣于薄膜上,薄膜兩端分別加正、負電極,此時帶正電荷的蛋白質向負極泳動;帶負電荷的蛋白質向正極泳動,通過移動速度的不同將其形成多條蛋白區帶,達到分離效果[6]。近年來,多地開展的醋酸纖維素薄膜電泳,由于實驗方法的不同,且實驗過程中的影響因素較多,學生獲得的實驗結果也存在多種問題,比如條帶無法分離,分離出少于5條條帶以及條帶歪歪扭扭的情況[7-8]。因此,西安交通大學醫學部基礎醫學院生物化學與分子生物學系針對目前存在的問題,經過多年探索,摸索出了成功分離血清蛋白的醋酸纖維素薄膜電泳技術的實驗條件。

1 實驗材料與器材

1.1 實驗材料

1.1.1 pH 8.6 巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉12.76 g,巴比妥1.66 g,蒸餾水加熱溶解后,定容至1000 mL。

1.1.2 pH 8.6 氯化鈉-NaOH緩沖液：稱取氯化鈉1.5 g溶于1000 mL蒸餾水中,后加入1 mL的1 mol/L NaOH。

1.1.3 pH 8.6 甘氨酸-NaOH緩沖液：稱取甘氨酸3.75 g溶于蒸餾水中,加入20 mL 0.2 mol/L NaOH,定容至1000 mL。

1.1.4 氨基黑染色液：稱取氨基黑10 B 0.5 g,溶解于50 mL甲醇中,后加冰醋酸10 mL及蒸餾水40 mL。

1.1.5 漂洗液：量取冰醋酸100 mL,加蒸餾水定容至1000 mL。

1.1.6 正常人血清,由西安交通大學第二附屬醫院檢驗科提供。

1.1.7 大鼠及小鼠血清,由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。

1.2 實驗器材

臥式水平電泳儀(北京六一,DYCP-38C),直流穩壓電源(北京六一,DYY-6C),醋酸纖維素薄膜(成都菲爾斯特儀器有限公司,規格為2 cm×8 cm),濾紙,膠頭滴管,載玻片,訂書針,鋼尺,鑷子,鉛筆等。

2 實驗方法

2.1 電泳裝置的搭建

在實驗開始前的準備工作中,實驗技術老師提前完成電泳裝置的搭建。具體來說：裁剪50 cm×8 cm的濾紙,縱、橫各折疊一次后,搭建濾紙橋,如圖1所示[9]。在水平電泳槽中按照指示刻度線添加電泳緩沖液,待濾紙全部浸濕后,即可進行后續電泳操作。

圖1 水平電泳儀橫截面濾紙橋搭建示意圖

2.2 醋酸纖維素薄膜的預處理

將醋酸纖維素薄膜用鑷子小心夾出,無光澤的糙面朝上放置在干凈的濾紙上。距離一端1.5 cm處,用鉛筆畫一條線以作點樣標記,同時學生按照分組標記編號以便區分,如圖2所示。隨后,將醋酸纖維素薄膜放置在pH 8.6 的電泳緩沖液中浸泡約20 min[10]。浸泡結束后,將膜取出,濾紙吸取表面多余水分,將膜無光澤面朝上放置備用。

圖2 醋酸纖維素薄膜畫線及點樣示意圖

2.3 點樣的選擇及優化

膠頭滴管吸取一滴樣品(血清)于載玻片上,用蓋玻片的一側(玻片寬度應小于薄膜的寬度)蘸取適量樣品(樣品吸附高度約2 nm,且高度均一),然后將取樣截面與薄膜畫線位置輕輕接觸,完成點樣。點樣動作要輕柔,確保樣品點的細窄且均勻,位置適中[11]。在實驗過程中我們分別使用了玻片、訂書針及鋼尺進行點樣,實驗結果并未觀察到有明顯差異,因此后續實驗我們可以選擇較為經濟的玻片進行點樣。

2.4 電泳檢測

將點好樣的醋酸纖維素薄膜用鑷子輕輕夾取,無光澤面朝下,點樣端靠近陰極,兩端搭在濾紙橋支架上。待薄膜在電泳槽中平衡5～10 min后,接通電源,調節電壓為120 V,恒壓電泳60 min后即可停止電泳[12]。

2.5 蛋白質的染色與背景脫色

用鑷子將薄膜從電泳槽中取出,放置在氨基黑染色液中,染色3 min,然后移入10% 冰醋酸漂洗液中進行漂洗脫色,共漂洗3次,每次5 min,直至薄膜可以清晰觀察到條帶,且背景干凈[13]。

2.6 條帶觀察與分析

將薄膜從漂洗液中取出,用濾紙吸去表面多余的液體,觀察不同來源的血清(人、大鼠、小鼠)經電泳后分離的蛋白區帶。

3 結果與分析

3.1 不同的緩沖液對血清蛋白分離的影響

蛋白質在高于或低于其pI的溶液中成為帶電的顆粒,在電場中能向正極或負極方向移動。我們通過對比以下三種不同的pH 8.6緩沖液來篩選最適于分離血清蛋白的實驗條件。圖3A～3C分別為：pH 8.6巴比妥緩沖液、pH 8.6氯化鈉-NaOH緩沖液[13]以及pH 8.6甘氨酸-NaOH緩沖液[14]。實驗結果顯示,在巴比妥緩沖液中,血清蛋白經醋酸纖維素薄膜電泳分離可見5條清晰條帶。在氯化鈉-NaOH緩沖液中只有部分薄膜可以分離得到條帶,且無法看到明顯的5條條帶。而在pH 8.6甘氨酸-NaOH緩沖液中,血清蛋白無法在醋酸纖維素薄膜電泳下觀察到分離的條帶。即經過三種不同緩沖液的對比,我們可以發現,pH 8.6的巴比妥緩沖液是醋酸纖維素薄膜電泳中分離血清蛋白的最佳緩沖液。

圖3 不同緩沖液對血清蛋白分離的影響

3.2 不同電壓對血清蛋白分離的影響

我們進一步觀察了不同電壓對醋酸纖維素薄膜分離血清蛋白的影響。設立三組電壓進行比較,分別為：100 V、120 V及140 V,實驗結果如圖4A～4C所示。從三種電壓下分離的條帶可以看出,100 V電壓分離的條帶沒有完全分離開且不清晰,140 V電壓分離的條帶出現了嚴重的拖尾現象,只有120 V電壓下分離的條帶清晰且一目了然。因此,120 V是醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白的最佳電壓。

圖4 不同電壓對血清蛋白分離的影響

3.3 不同血清蛋白樣本應用于實驗教學效果的分析

血清蛋白的分離應用于實驗教學中,旨在讓醫學專業的本科生形象直觀地了解電泳技術的原理及操作,了解分離蛋白質等生物大分子技術在臨床疾病診斷中的實際應用。在以往的實驗教學中,常常以人血清作為實驗材料。然而,從人血清的獲取困難性以及操作安全性方面考慮,筆者在本實驗中嘗試使用正常健康的大鼠和小鼠血清作為對比,研究是否可以將安全的小動物血清大面積應用于實驗教學,從而代替使用人血清所存在的安全隱患。如圖5所示,筆者分別使用了人血清、大鼠血清以及小鼠血清進行醋酸纖維素薄膜分離蛋白實驗,結果顯示,在pH 8.6的巴比妥緩沖液中,以120 V電壓電泳60 min均可以分離得到清晰的5條條帶?？紤]到大鼠血清體積明顯多于小鼠血清,且比人血清更容易獲得,因此,在后續的實驗教學中筆者將健康的大鼠血清作為醋酸纖維素薄膜分離血清蛋白的實驗材料。

圖5 不同樣本應用于實驗教學中的分離效果

3.4 優化后大鼠血清蛋白經醋酸纖維素薄膜電泳的分離效果

大鼠血清蛋白的等電點低于pH 7.0,在pH 8.6的巴比妥緩沖液中進行電泳,電泳條件為120 V電泳60 min,可將大鼠血清蛋白分為清蛋白、α1、α2、β以及γ-球蛋白5條區帶,如圖6所示。進一步分析可得各部分蛋白所占的比例：清蛋白為57%～72%;α1-球蛋白為2%～5%、α2-球蛋白為4%～9%、β球蛋白為6.5%～12%以及γ-球蛋白為12%～20%[15-17]。

圖6 醋酸纖維素薄膜電泳分離大鼠血清蛋白電泳圖譜

4 結語

本實驗優化了電泳緩沖液的選擇、電壓的大小以及血清樣本的選擇等實驗步驟,保障了實驗的可操作性及實驗結果的可重復性,條帶再現性一致。這一實驗也使得學生掌握了蛋白質結構及特點這一章節的理論知識,加深了對蛋白質特性的理解。蛋白質電泳的成功分離,更有助于激發學生的實驗熱情和科研動力,鍛煉了學生的動手能力及探索科學問題、解決科學難題的能力,對培養創新型科研人才起到了積極的作用。