木薯MePPD3 基因的克隆及功能分析

賈素行，朱壽松，符仁穩，李春霞，陳銀華

（海南大學 熱帶作物學院，?？?570228）

木薯（Manihot esculenta）是熱帶地區主要的糧食作物和經濟作物，有著“地下糧倉”、“淀粉之王”的稱號[1-2]，木薯在我國主要用于各種工業原料的生產[3-5]，其市場前景十分巨大。菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas phaseolipv.manihotis,Xpm）早已列入我國有害生物名錄，它是木薯細菌性枯萎病的病原菌，其能夠使木薯葉片褪綠萎蔫甚至全株死亡，可導致木薯減產20%～90%[6-7]。1991 年于類囊體腔中首次發現PsbP 蛋白，后經過不斷研究發現PsbP 蛋白廣泛存在于藻類、藍細菌和高等植物中[8-9]。目前，已發現的PsbP 蛋白分為3 大類，分別是PsbP 蛋白、類PsbP 蛋白PPL（PsbP-like protein）和PsbP 結構域蛋白PPD（PsbPdomain protein）[10-12]。PsbP 蛋白是葉綠體光系統Ⅱ（photosystem Ⅱ complex, PSⅡ）的重要組成部分，它在維持鈣離子、氯離子濃度方面發揮重要作用；此外，敲除PsbP基因后， PSⅡ的功能將受到一定的影響[13-15]?？茖W家在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發現，PPL1 能參與 PSⅡ復合體的組裝，其和植物適合光照強度變化有關[16-17]；擬南芥的PPL2 缺失突變體中，葉綠體NADH 脫氫酶的積累量和活性降低[17]。Roose 等[8]于2007 年從擬南芥基因組中鑒定出7 個PPD 蛋白，它們分別是PPD1、PPD2、PPD3、PPD4、PPD5、PPD6、PPD7。已有研究發現，PPD1 是PSI 復合體的組裝因子，在擬南芥中，PPD1 缺失突變體能導致PSI 復合體無法正常組裝，從而影響植物的光合作用[18-19]；在擬南芥中，PPD5 蛋白和OST1 相互作用并被其磷酸化，使細胞中H2O2積累增加并使氣孔關閉增強[20]。但目前尚未有過任何關于PPD3 蛋白功能的研究報道。

本研究以‘華南8 號’木薯為材料，通過qRTPCR 擴增得到MePPD3（Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3）基因，并對該基因進行生物信息學分析；同時，對該基因在木薯不同部位和病原菌XpmCHN11 侵染后不同時間的表達模式進行分析；最后利用TRV 介導的基因沉默技術沉默MePPD3基因后測定抗病表型，旨在為進一步研究MePPD3基因的分子機理和木薯抗細菌枯萎病的抗病機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株大腸桿菌DH5α 感受態細胞和農桿菌GV3101 感受態細胞購自上海唯地生物；菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種Xanthomonas phaseolipv.manihotisCHN11 由筆者所在實驗室提供。

1.2 植物材料供試的木薯品種為‘華南8 號’（‘SC8’），由筆者所在實驗室提供。

1.3 試劑多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit）和RNA 反轉錄試劑盒（FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix）購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自艾德萊。

1.4 所用引物從phytozome 數據庫中下載木薯MePPD3基因的CDS 序列，使用Primer Primer 5.0 分別設計該基因的全長擴增引物、定量分析引物和亞細胞定位引物。本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.5 MePPD3基因cDNA 全長序列克隆取少許木薯葉片于液氮中速凍，用液氮預冷后的研缽進行研磨。使用試劑盒提取木薯RNA 并將其反轉錄為cDNA。以木薯cDNA 為PCR 模板，以MePPD3-F 和MePPD3-R 為引物，擴增木薯Me-PPD3基因序列。待瓊脂糖凝膠電泳檢測結果無誤后，轉入植物亞細胞載體pCAMBIA1300-35SGFP 中，挑選陽性單克隆送至楠山生物進行測序。

1.6 MePPD3基因的生物信息學分析借助SignalP 5.0 Server 對MePPD3 蛋白的信號肽進行預測；通過TMHMM Serverv 2.0 分析MePPD3 蛋白的跨膜結構；利用NetPhos 3.1 Server 在線工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測Me-PPD3 蛋白的磷酸化位點和糖基化位點；分別使用在線網站PSIPRED.（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和PHYRE2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index）預測MePPD3 蛋白的二級結構和三級結構。

通過NCBI 序列比對，找到MePPD3 蛋白在不同植物中的同源蛋白。通過DNAMAN 8.0 軟件對這9 個同源蛋白進行多序列比對；使用MEGA 11.0 軟件對這些同源蛋白構建NJ 進化樹；使用MEME 在線網站對MePPD3 及其同源蛋白進行保守Motif 分析。

1.7 MePPD3基因的亞細胞定位將構建好的植物亞細胞定位載體pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3與空載pCAMBIA1300-35S-GFP 分別轉入GV3101 菌株。挑取陽性克隆于28 ℃ 200 r·min-1培養過夜，取適量菌液轉移至新的LB（含Kan 和Rif）液體培養基中擴大培養。調節OD600≈1.0，黑暗靜置2.5 h，注射于生長30 d 左右的煙草（Nicotiana tabacum）葉片背面，做好標記，培養40 h 后于共聚焦顯微鏡下觀察其熒光。

1.8 qRT-PCR 檢測MePPD3基因在木薯不同部位中的表達水平使用Primer Primer 5.0 設計定量引物qpcr-MePPD3-F/R。分別取長勢相同的木薯的頂芽、幼嫩葉片、成熟葉片、葉柄、須根、塊根等部位，每個部位至少3 個生物學重復，液氮速凍后，使用RNA prep Pure Plant Kit 試劑盒提取木薯總RNA，然后再按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒的流程反轉錄cDNA。

1.9 qRT-PCR 檢測XpmCHN11 侵染后不同時間MePPD3基因表達水平變化用OD600≈0.05的菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種XpmCHN11侵染多株長勢相同的木薯，分別于侵染后0 h、6 h、1 d、3 d、5 d 隨機剪取葉片，液氮速凍后將其研磨提取RNA，并反轉錄為cDNA。

1.10 VIGS 沉默MePPD3基因后檢測木薯抗病性有無變化構建沉默載體pCsCMV-MePPD3。將其與正對照pCsCMV-B 和負對照pCsCMVA 分別轉化入GV3101 菌株，在LB 液體培養基（含Kan 和Rif）中培養陽性克隆至OD600=1.0。然后注射于木薯‘SC8’葉片背面，24 ℃培養30 d。

在LPGA 固體培養基（含Chl）上活化XpmCHN11 菌株，活化2 次后，用無菌水清洗菌體并稀釋至OD600=0.05，用該菌液注射木薯葉片。侵染6 d 后，觀察葉片表面病斑的擴散情況。

2 結果與分析

2.1 MePPD3基因的克隆及其理化性質分析以木薯RNA 為模板，MePPD3-F/R 為上下游引物，通過RT-PCR 技術，得到目的基因MePPD3（Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3）（圖1-a）?；蛐蛄蟹治霭l現，MePPD3基因全長807 bp，編碼268 個氨基酸。ExPasy 在線網站分析結果顯示，MePPD3 相對分子質量為67 522.75，理論等電點為5.11，分子式為C2 467H4 129N807O1 033S184，不穩定系數為49.9，脂肪系數為27.14，親水系數為0.775。使用NCBI 的CDD 數據庫分析其保守結構域，結果發現，其氨基酸序列第106～266 位存在PsbP 結構域（圖1-b），推測其為PPD3蛋白。

圖1 MePPD3 基因全長擴增及蛋白結構分析

2.2 MePPD3 蛋白的生物信息學分析使用NetPhos 在線網站，預測MePPD3 蛋白有32 個磷酸化位點，其中，有19 個絲氨酸、6 個蘇氨酸和7 個酪氨酸（圖2-a）；有5 個糖基化位點（圖2-b）；使用TMHMM 在線網站預測發現，其存在跨膜結構域（圖2-c）；使用SignalIP 在線網站發現，其無信號肽（圖2-d）；使用PSIPRED 在線網站預測MePPD3 蛋白二級結構，發現其有6 處螺旋結構，其中，螺旋占21.3%，折疊占26.5%，無規卷曲占52.2%（圖2-e）；通過PHYRE2 在線網站預測其三級結構，發現其有6 個螺旋結構，這符合二級結構預測結果和PsbP 蛋白的結構特征（圖2-f）。

圖2 MePPD3 蛋白的生物信息學分析

2.3 MePPD3 蛋白同源序列、進化樹和保守結構域分析為研究PPD3 蛋白在不同植物中是否具有較高的同源性，首先在NCBI 通過BLAST 比對，在橡膠（Hevea brasiliensis）、蓖麻（Ricinus communis）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）、茶樹（Camellia sinensis）、胡楊（Populus euphratica）、芒果（Mangifera indica）、麻風樹（Jatropha curcas）、開心果（Pistacia vera）等8 種植物中找到了與木薯MePPD3 蛋白同源的氨基酸序列（表2）。使用DANMAN 8.0 對這些序列進行比對（圖3），結果發現，MePPD3 蛋白在不同的植物中具有較高的同源性，其中與橡膠中PPD3 蛋白的同源性最高。PsbP 保守結構域在不同植物中的差別不大（圖中紅線框），且N 端氨基酸序列含有葉綠體/線粒體定位信號（圖中藍線），表明MePPD3 蛋白可能定位于葉綠體或線粒體。

圖3 MePPD3 在不同植物中的同源序列比對

表2 MePPD3 在不同植物中的同源蛋白

為了進一步驗證這些蛋白的親緣關系，使用MEGA11.0 對這9 個同源蛋白構建NJ 進化樹（圖4）。結果發現，木薯中的MePPD3 蛋白與其他幾種植物中的MePPD3 蛋白具有較高的親緣關系，值得一提的是它與橡膠中PPD3 蛋白的親緣關系最接近，可達99%，蓖麻中的PPD3 蛋白次之。

圖4 不同物種間MePPD3 同源蛋白的系統進化樹分析

應用MEME 在線網站對MePPD3 蛋白及其同源蛋白進行保守Motif 分析（圖5），發現這9 個同源蛋白至少含有6 個保守Motif，其中，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4 和Motif 6 具有高度保守性。此外，MePPD3 蛋白和橡膠、蓖麻中PPD3 蛋白具有Motif 的種類和數量一致，均具有這8 個Motif。這與同源蛋白多序列比對和進化樹分析的結果一致，初步說明，PPD3 蛋白在不同植物體內具有較高的保守性，MePPD3 蛋白的功能極有可能與其他PPD3 蛋白的功能一致。

圖5 MePPD3 結構域分析

2.4 MePPD3 蛋白的亞細胞定位為探究木薯MePPD3 蛋白在植物細胞內的亞細胞定位，構建了植物亞細胞定位載體pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3（圖6-a）。使用已提前轉進GV3101 菌株的亞細胞定位載體pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3和空載pCAMBIA1300-35S-GFP 注射生長約30 d 的煙草葉片。40 h 后，剪取葉片觀察熒光信號（圖6-b），結果發現，與對照（GFP 空載）相比，試驗組在葉綠體中能觀測到綠色熒光，且能與葉綠體的紅色自發熒光基本重合，表現出黃色的光。說明MePPD3 蛋白定位在葉綠體中，符合Psbp 蛋白（葉綠體光系統II 亞基蛋白）的特點。

圖6 MePPD3 蛋白的亞細胞定位

2.5 木薯不同部位MePPD3基因的表達模式分析為研究木薯MePPD3基因在木薯不同部位中的表達情況，分別選擇同一株‘SC8’木薯的成熟葉片、幼嫩葉片、葉柄、頂芽、塊根、須根等部位，對其進行real-time PCR 檢測MePPD3基因的表達量是否發生變化。觀察發現（圖7），MePPD3基因在木薯不同組織中均有表達，其在木薯葉片中的表達量最高，在幼嫩葉片中的表達量為頂芽的5 倍，在成熟葉片中的表達量為頂芽的18 倍；在木薯的葉柄、須根、塊根的表達量和頂芽接近。這說明MePPD3基因主要在木薯的葉片中表達，這與其具有的Psbp 結構域的功能相符。

圖7 MePPD3 基因在木薯不同部位的表達模式圖

2.6 病原菌侵染不同時間后MePPD3基因的表達模式分析為探究病原菌XpmCHN11 侵染后MePPD3基因在木薯葉片中的表達量是否發生變化，分別取接種0、6 h，1 、3 、5 d 的木薯葉片，通過實時熒光定量PCR 檢測MePPD3基因的表達量變化（圖8）。從中可以明顯地看出，在XpmCHN11 侵染木薯后的不同時間，MePPD3基因的表達量呈先上升再下降趨勢。在6 h 時，其表達量上升了2.5 倍；在1 、3 和5 d 時，其表達量逐漸下降為本底表達量。這說明，MePPD3基因可能在木薯抗病過程中發揮著作用。

圖8 病原菌侵染后不同時間MePPD3 基因的表達量

2.7 MePPD3基因沉默后木薯SC8 抗病性為明確MePPD3基因在木薯抗病過程中的作用，采用VIGS 技術沉默MePPD3基因，沉默40 d后，接種正對照植株的葉片出現了白化表型（圖9-a）。qRT-PCR 結果顯示，經過VIGS 沉默之后，MePPD3基因的相對表達量顯著降低，其表達量下降了2 倍（圖9-b），說明該基因受到了有效沉默。

圖9 VIGS 沉默植株表型及抗病性檢測

分別在沉默植株和野生型植株上接種XpmCHN11，結果發現，接種后6 d，沉默植株和野生型植株葉片均已產生水漬狀病斑，且沉默植株的水漬狀病斑明顯小于野生型植株（圖9-c），統計后發現沉默植株的病斑面積約為對照植株的一半（圖9-d），該結果顯示MePPD3負調控了木薯的抗病性。

3 討 論

葉綠體是植物體所特有的細胞器，它能為植物體的各項生命活動提供能量。PsbP 蛋白是葉綠體光系統Ⅱ的重要組成部分，它能參與 PSⅡ的組裝[13-15]。此外，葡萄球菌萄球菌RXLR 效應因子RXLR31154 通過影響Psbp 來降低H2O2積累，從而促進葡萄致病[21]。PPD 蛋白是PsbP 蛋白家族的一員，目前已發現的PPD 蛋白有7 種。蛋白在PSI 組裝過程中發揮重要作用[18-19]；PPD5 蛋白和ROS 爆發、氣孔關閉有關[19]。以上研究充分說明了Psbp 蛋白在植物光合作用和免疫反應中發揮著一定的作用。但目前關于PPD3 蛋白的研究卻不是很多。

為了增進對PPD3 蛋白的了解，本研究首次從木薯數據庫中得到MePPD3基因。MePPD3基因CDS 序列全長807 bp，編碼268 個氨基酸序列。對MePPD3基因進行了一系列的生物信息學分析，結果發現：該蛋白第50～100 位存在跨膜結構，第106 到266 位為PsbP 保守結構域。其三級結構由6 個螺旋組成，符合PsbP 蛋白家族的結構特征。選取8 種植物中的同源蛋白序列進行多序列比對、進化樹和保守結構域分析，結果發現，PPD3 蛋白在不同植物中具有較高的保守性，木薯MePPD3 蛋白和橡膠中PPD3 蛋白具有相同的保守結構域，且兩者的相似性可達99%。因此，推測PPD3 蛋白在不同植物中起到的作用一致或相近。此外，通過煙草瞬時表達，證實MePPD3 定位于葉綠體，這與PPD3 蛋白的葉綠體/線粒體定位信號相符，說明MePPD3 可能在葉綠體中發揮功能。另外，本研究通過qRT-PCR 檢測，發現MePPD3基因在木薯成熟葉片中表達量最高；黃單胞菌XpmCHN11 侵染木薯葉片后，MePPD3表達量呈現上調趨勢，初步推斷，MePPD3可能參與了木薯的抗病途徑；VIGS 沉默MePPD3基因后接種結果顯示，MePPD3負調控木薯的抗病途徑。結合前人研究推測，MePPD3 可能通過影響氣孔開閉和ROS 爆發來參與木薯抗病，是否正確仍需要后續研究來證實。