宿主身份與葉性狀對海南熱帶山地雨林樟科和殼斗科植物葉內生真菌群落的影響

羅竹慧，吳春玲，王艷麗，李萃玲，萬 玲，丁 瓊

（1. 海南大學 生態與環境學院，?？?570228; 2. 海南大學 園藝學院，?？?570228）

內生真菌是一類生活在植物組織內，但不會引起任何外在疾病跡象的真菌[1]。它能促進植物生長、提高植物抗病防御[2-4]，對農業及自然生態系統的可持續管理有重要意義[5]。植物的根與葉均是內生真菌生活的熱點場所。熱帶森林中幾乎所有的葉都受到內生真菌侵染[6]，單株植物的葉內生真菌達30 多種[7]，而單片葉的內生真菌甚至達20 種以上[2]。除葉內生真菌外，植物的根普遍與真菌形成菌根，能提高養分的有效性和促進植物的耐脅迫能力。外生菌根與叢枝菌根是自然界最常見的菌根類型，外生菌根主要長生在殼斗科、松科植物上，真菌主要為擔子菌和少量子囊菌；而叢枝菌根涉及80%以上的陸生植物，真菌主要為球囊菌門[8]。在功能上，外生菌根真菌促進植物吸收氮，而叢枝菌根真菌促進植物吸收磷。不同菌根類型在生態生理上的差異，會改變植物營養和土壤過程[9]。植物的菌根類型會影響葉內生真菌群落，如叢枝菌根真菌影響葉內養分的有效性，進而影響葉內生真菌群落組成[10]；菌根真菌與葉內生真菌的互作影響植物抗蟲性[11]。比較同一片森林中外生菌根植物和叢枝菌根植物的葉內生真菌群落可以更好地理解2 種類型植物與真菌之間的相互作用和生態功能。海南島位于我國南部，地處熱帶北緣，同時具有熱帶和亞熱帶的氣候特征，物種豐富，被譽為“熱帶北緣生物物種基因庫”。海南島的熱帶山地雨林是當前保存最完整、面積最大的熱帶森林，具有面積廣、物種多樣性高、層次結構復雜等特點，是具有國家和國際意義的生物多樣性保護的熱點地區的代表性植被類型[12-13]。在海南島尖峰嶺的熱帶山地雨林中，樟科植物重要值最高，其次是殼斗科植物[13]，二者的根部真菌群落分別以叢枝菌根真菌和外生菌根真菌為主[14]。目前，基于微生物DNA 條形碼（如真菌ITS、細菌16S rRNA基因）的高通量測序技術，相對于依賴培養的一代測序技術，具有檢測更全面、通量更高的特點，能在短期內高效地獲得海量的微生物DNA 序列，越來越多地被應用于揭示環境微生物群落的多樣性和復雜性[15]。本研究擬采用高通量測序技術檢測尖峰嶺熱帶山地雨林樟科和殼斗科植物的葉內生真菌群落的物種組成，旨在揭示植物身份與葉性狀在葉內生真菌群落構建中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究地點自然概況研究樣地位于海南島西南部尖峰嶺國家級自然保護區內（18°23′—18°50′N，108°36′—109° 05′E），地跨樂東、東方兩市縣。受到熱帶季風氣候的影響，該區域干濕季節明顯，干季為11 月—翌年4 月，濕季為5—10 月，年均降雨量介于1 305～3 686 mm 之間，屬低緯度熱帶島嶼季風氣候。保護區內森林植被類型豐富，植被垂直分布帶譜明顯，由海邊至山頂形成了8 個主要植被類型: 包括濱海有刺灌叢、熱帶稀樹草原（或稱稀樹灌叢）、熱帶半落葉季雨林、熱帶常綠季雨林、熱帶北緣溝谷雨林、熱帶山地雨林、熱帶山地常綠闊葉林等，其中熱帶山地雨林是尖峰嶺地區面積最大、物種組成多樣的植被類型，它主要分布在海拔600～1200 m 的山地丘陵，磚黃壤-黃壤是其主要的土壤類型[13,16]。樣地歷年每木調查共記錄到439 676 株存活的胸徑≥ 1.0 cm 的喬灌木植株，植株密度為0.732 8 株·m-2，在20 m × 20 m 尺度上單位面積物種數量平均為80 種[13]。在本研究中抽到的樣方內，按物種豐富度、相對頻度、植株平均胸徑三者平均值排序，優勢度最高的兩科為樟科、殼斗科。

1.2 葉片采集樣品采集地為中國林業科學研究院尖峰嶺森林生物多樣性動態監測大樣地，簡稱大樣地。樣地總面積60 hm2（600 m × 1000 m），西南角原點坐標18°43′41.0″N，108°53′59.6″E，海拔870 m。首先，沿大樣地長邊將樣地劃分為2 個300 m × 1000 m 的子樣地。然后，在南側子樣地設置100 m × 100 m 的網格，并從中隨機抽取5 個網格用于葉片采集。在抽取的網格內，隨機設置1 個20 m × 40 m 的樣方。接著，先找到樣方內樟科和殼斗科植物位置，再使用加長高枝剪從目標植物樹冠剪取3 條樹枝（這些樹枝沿水平方向間隔約 120°），同時記錄枝條的采樣高度。從剪切下的枝條摘取成熟、健康的葉片，并將它們分別裝在3 個塑料封口袋中。將袋子置于冷藏箱中轉運至實驗室，并在-20 ℃保存，以備后續DNA 提取。

1.3 葉性狀的測定測定了10 個葉性狀，包括葉面積（LA）、鮮質量（FW）、干質量（DW）、比葉面積（SLA）、葉干物質含量（LDMC）、葉含水量（LWC）、葉氮含量（LNC）、葉磷含量（LPC）、葉鉀含量（LKC）、葉鈣含量（LCaC），這些性狀可能會對內生真菌群落組成產生潛在影響[17-18]。其中，氮、磷、鉀、鈣含量分別用凱氏定氮蒸餾法、鉬銻抗比色法、火焰光度法、原子吸收分光光度法進行測定。

1.4 葉內生真菌的分子檢測從每株樹的3 個枝條分別選取成熟、健康的葉48 片，用直徑為3 mm 打孔器在每片葉的中脈左側或右側打孔。將打下的葉片組織塊放入2 mL 離心管中。先加入400 μLddH2O 和1∶1000 的表面活性劑Tween 20 進行混合，然后放在200 r·min-1的搖床上搖晃15 min。接著用400 μL75%乙醇將樣本浸泡并搖晃5 min，最后用800 μL 無菌水洗滌5 次，每次放入渦旋振蕩器中振蕩30 s[19-20]。然后每管加入100 μLCTAB 提取緩沖液及2 顆直徑4 mm 的鋼珠，并放置于-20 ℃的冰箱中冷凍過夜。取出樣本后，使用高通量多樣品組織研磨儀粉碎葉組織，直到其被充分粉碎為糊狀物。接下來，采用改良的CTAB 法提取DNA[14]。將同株葉的DNA 混合成1 個樣品，然后委托上海生工生物工程有限公司在Illumina Miseq 測序平臺下使用引物ITS3F和ITS4R 對樣品真菌ITS rDNA 基因的ITS2 區進行測序，再將序列劃分為可操作單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）。

1.5 數據分析首先將數據整理成植株為行，葉內生真菌為列的植物-真菌矩陣，矩陣中的各單元格為對應的真菌序列數，將矩陣中小于2 的值全部轉換成0，以去除稀有種和減少PCR 擴增或測序過程中引入的錯誤。然后，繪制稀釋曲線以評估本次實驗采集的樣本大小是否充足；計算每株植物的葉內生真菌Shannon-Wiener、Simpson 多樣性指數；用Kruskal-Wallis test 分析宿主植物對葉內生真菌物種豐富度和多樣性指數的影響。使用非度量多維尺度可視化樟科、殼斗科植物葉內生真菌的群落組成差異。進一步采用偏冗余分析法檢驗宿主身份（啞元變量）、葉性狀（數值型變量）對葉內生真菌群落是否有顯著影響，以及影響的大??；同時也將單個的葉性狀擬合到偏冗余分析的排序圖上，以確定各個性狀的影響大小。所有分析均在R 中進行，用到的軟件包為vegan 2.5-7。

2 結果與分析

2.1 葉內生真菌群落的多樣性和組成對熱帶山地雨林中的樟科（26 株）和殼斗科（22 株）2 科植物進行了葉內生真菌ITS2 區的高通量測序，共獲得葉內生真菌序列數1 557 620 ，經過序列分析被劃分為6 805 個OTUs。去除僅序列數為1 的OTUs 后，葉內生真菌序列數仍有1 539 567，5 471個OTUs，每株達（ 690 ± 31）個OTUs。這些葉內生真菌隸屬于8 門、30 綱、108 目、281 科、892 屬。樟科與殼斗科植物獲得葉內生真菌序列數分別為991 193 和548 374，平均每株分別為38122± 1785 和24926 ± 3250 。在樟科與殼斗科中，序列數占比例最高的均是子囊菌門Ascomycota，分別達95.7%和92.4%，其次是擔子菌門Basidiomycota，分別占2.5%和3.9%，尚有其他類群的真菌分別占1.8%和3.7%。在綱級分類單元，樟科與殼斗科植物的葉內生真菌序列數占比較高的前四類真菌分別為Dothideomycetes（56.4%和49.5%）、Eurotiomycetes（22.5%和19.3%）、Sordariomycetes （10.4%和11.0%）、Lecanoromycetes （3.2%和8.8%）。此外，Leotiomycetes 在樟科植物中占比較高（2.3%），而Agaricomycetes 在殼斗科植物中較多（2.2%）。在樟科植物中，序列數占比最高的前5 種真菌是Asperisporium caricae（5.4%）、Mycosphaerella quasiparkii（2.4%）、Gonatophragmium triuniae（2.2%）、Zasmidium dalbergiae（1.8%）、Zasmidium lonicericola和Sporidesmiumsp.（1.5%），而殼斗科植物中Mycosphaerellaceae sp2（3.0%）、 Dothideomycetes sp1（2.8%）、Xylographa trunciseda和Asperisporium caricae（2.1%）、Zasmidium lonicericola（1.9%）較多（圖1）。

圖1 尖峰嶺熱帶山地雨林樟科與殼斗科植物序列數最多的前30 種葉內生真菌的序列百分比組成

稀釋曲線顯示，隨著測序深度的增加，真菌物種數增加的趨勢變平緩（圖2-a），表明當前測序深度能夠較為全面地反映熱帶山地雨林殼斗科、樟科的葉內真菌多樣性。整體上單株植物的葉內生真菌達（690 ± 31）個 OTUs，并且樟科植物單株葉內生真菌物種豐富度達（805 ± 32 ）個OTUs，顯著高于殼斗科植物的（554 ± 41）個 OTUs（Kruskal-Wallis test:χ2= 16.283，P= 0.000）（圖2-b）；而Shannon-Wiener 多樣性指數和Simpson 多樣性指數在兩科植物間均無顯著差異（χ2= 1.028，P=0.311；χ2= 0.035，P= 0.852）。

圖2 尖峰嶺熱帶山地雨林樟科（綠色）與殼斗科（紅色）植物葉內生真菌物種累積曲線（a）和物種豐富度（b）

2.2 葉內生真菌群落組成的影響因子在群落水平，非度量多維尺度分析（NMDS）的結果（圖3）顯示殼斗科和樟科的葉內生真菌群落組成顯著不同（stress = 0.188）。偏冗余分析（RDA）結果表明，宿主科、屬、種身份對葉內生真菌群落組成有顯著的影響（P= 0.001），去除植物性狀的效應后，宿主科、屬、種身份能獨立解釋葉內生真菌群落物種組成的變異量分別達2.9%、15.7%、33.7%。取樣高度對葉內生真菌群落組成沒有影響（R2= 0.026，P= 0.081）。

圖3 樟科（綠色）和殼斗科（紅色）葉內生真菌群落物種組成差異的非度量多維尺度分析

偏冗余分析結果表明，葉性狀對葉內生真菌群落結構也有顯著影響（R2= 0.213，P= 0.003）。各性狀擬合排序軸的結果表明，對葉內生真菌群落影響程度由高到低依次為：葉鈣含量（R2=0.572，P= 0.001），比葉面積（R2= 0.413，P=0.001），葉氮含量（R2= 0.181，P= 0.008）和葉鉀含量（R2= 0.137，P= 0.031）（表1）。

表1 葉性狀解釋葉內生真菌群落組成的變異量

3 討 論

3.1 熱帶山地雨林的葉內生真菌多樣性海南尖峰嶺熱帶山地雨林葉內生真菌的物種豐富度極高，從樟科和殼斗科的48 株植物中檢測到葉內生真菌達5471 OTUs。單株植物葉內生真菌達（690 ±31）個 OTUs，遠高于目前已有報道的世界其他地區的森林木本植物單株葉內生真菌多樣性水平（10 ～ 260 種）[1, 7, 20 - 23]，依賴于培養的傳統檢測方法揭示的單株葉內生菌物種豐富度范圍更低至3 ～48 種[2, 24 - 25]。不同的采樣策略是導致葉內生真菌多樣性觀察值差異的重要因素之一。如智利溫帶雨林的優勢樹種，每株取3 片完整葉，單株葉內生真菌物種豐富度為（263 ± 37.6 ）個OTUs[22]；臺灣亞熱帶山地雨林中的殼斗科、茜草科等10 種植物，每株取3 片葉，每片葉取樣1 cm2，單株葉內生真菌的豐富度最高僅達44 個OTUs[23]。本研究中，每株樹采集144 片葉，每片葉取樣約0.07 cm2，這高度異質性的取樣策略可能是單株植物葉內生真菌遠高于同類研究的主要原因之一。尖峰嶺熱帶山地雨林的叢枝菌根的樟科植物單株葉內生真菌物種數達（805 ± 32 ）個OTUs，顯著高于外生菌根的殼斗科植物（554 ± 41）個 OTUs）。樟科植物的葉內生真菌相對較高的α 多樣性可能是與樟科的AM 與殼斗科植物的ECM 屬性有關。在功能上，外生菌根真菌促進植物吸收氮，而叢枝菌根真菌促進植物吸收磷。不同菌根類型在生態生理上的差異，會改變植物營養和土壤過程[9]。如叢枝菌根真菌影響菊科植物絲路薊的葉內養分的有效性，進而影響葉內生真菌群落組成[10]。喜馬拉雅鳳仙花的菌根真菌與葉內生真菌的互作影響其抗蟲性[11]。

尖峰嶺熱帶山地雨林中樟科和殼斗科的葉內生真菌群落均以子囊菌門真菌為主。在綱級分類單元，兩科植物的優勢類群均為Dothideomycetes、Eurotiomycetes、 Sordariomycetes、 Lecanoromycetes。這些真菌均被普遍報道為木本植物的內生真菌，是亞熱帶山地雨林[23]、熱帶紅樹林[20]、溫帶雨林[22]中木本植物葉內生真菌群落的常見類群。如本研究中最常見的類群Dothideomycetes，物種豐富度和序列數均最高，也是地球上其他植被類型中報道最廣泛、物種最豐富的類群。Dothideomycetes 具有多樣性的生態功能，通常能為宿主植物分解碳水化合物，對生態系統健康和碳循環有重要作用[26]；葉片通常會直接暴露于強太陽輻射之下，研究發現Dothideomycetes 類群中的真菌（如Capnodiales spp.）能產生黑色素，有利于提高真菌耐受紫外線輻射的能力[27 - 28]。相似地，本研究中第二常見的真菌類群Eurotiomycetes，也被報道為可黑色素化真菌，對于提高真菌紫外線耐受性有重要意義[27,29]。Sordariomycetes 真菌作為本研究的第三大類葉內生真菌，也是被高頻報道的葉內生真菌，且與纖維素和木質素降解密切相關[30]。

3.2 葉內生真菌群落組成的影響因子植物內生菌群落的構建中，決定群落組成和結構的因素可以分為兩大類：確定性和隨機性。確定性因素是直接影響植物內生菌群落物種組成與數量的生物與非生物環境因素。非生物確定性因素包括環境條件，如溫度，濕度和土壤養分，這些因素可以影響內生真菌的生長和存活[31 - 32]。生物確定性因素包括宿主植物身份[23, 25, 33]，以及宿主植物性狀，如植物組織化學成分，形態和物候期[7, 22, 33 - 34]，這些特征可以影響內生真菌的存在和活動。影響植物內生菌群落物種組成和數量的隨機因素，即隨機事件或過程的因素，包括偶然的定殖事件，擴散限制和生態漂移[35 - 36]。本研究結果表明，宿主身份對葉內生真菌的群落組成有顯著影響。在其他熱帶和亞熱帶葉內生真菌群落研究中，得到了相同的結果[23, 25, 33]。例如，在臺灣亞熱帶山地雨林中進行的一項研究表明，宿主身份能夠解釋葉內生菌群落物種組成的變異量達到42.0%[23]；在哥斯達黎加熱帶森林中，6 種常見附生鳳梨科植物的可培養葉內生菌群落物種組成具有顯著差異，葉內生菌群落物種組成變異的22.30%可以被宿主身份解釋[25]。在巴布亞新幾內亞雨林中，茜草科、桃金娘科等植物屬和種的身份解釋的可培養的葉內生真菌群落物種組成變異分別達到16.70%和32.10%[33]。因此，宿主身份是影響葉內生真菌群落組成的重要因素。

較多的報道表明葉性狀是葉內生真菌群落的重要影響因子[7, 22, 33 - 34]。在本研究中，葉性狀也是葉內生真菌群落構建的重要驅動因子。去除宿主身份的影響后，涉及的10 個葉性狀總體上可解釋真菌群落組成的變異量達21.3%。西雙版納熱帶植物園46 種榕屬植物的葉內生真菌群落試驗表明，比葉面積等11 個葉性狀解釋了32.90%的葉內生真菌群落組成的變異量，而比葉面積狀也是葉內生真菌群落構建的主要影響因素[7]。在巴拿馬熱帶雨林中，葉氮含量等6 種性狀可解釋其木本植物葉內生菌群落組成28.4%的變異量[34]。葉性狀對可培養的葉內生真菌群落也有相似的效應，如巴布亞新幾內亞低地雨林中的茜草科、桃金娘科等植物的比葉面積、葉氮含量等3 個性狀能解釋可培養的葉內生真菌群落物種組成變異量達11.2%～22.9%，其中葉氮含量與可培養的葉內生真菌群落組成有顯著的相關性[33]。智利溫帶雨林中優勢木本植物的可培養葉內生真菌群落研究也得到類似的結果[22]。

在尖峰嶺的熱帶山地雨林中，常見植物的葉鈣含量、比葉面積、葉氮含量和葉鉀含量是葉內生真菌群落構建的重要驅動因子。鈣是維持細胞壁和細胞膜結構的重要元素[37 - 38]，而細胞壁是微生物在葉片上定殖時必須克服的第一道物理保護屏障[39]，因此葉鈣含量的差異極可能影響葉片的防御作用，進而影響葉內生真菌的定殖和群落構建。比葉面積、葉氮含量、葉鉀含量與植物的光合速率密切相關[17, 18, 40]。其中，比葉面積反映資源在光合組織與結構特征間的分配策略。通常，比葉面積大的葉片傾向于更大的光合速率，而較低的比葉面積值意味著資源優先投入葉片的“防御”和長壽葉[17, 33]。因此，比葉面積大、氮、鉀含量高的葉片與具有相反特征的葉片可能會呈現出不同的內生真菌生長環境，從而導致內生真菌群落組成存在差異。由此可見，葉形態結構性狀及化學計量性狀均是葉內生真菌群落構建中的過濾器。

本研究采用高通量測序技術揭示了海南尖峰嶺熱帶山地雨林優勢類群的樟科和殼斗科植物的葉內生真菌群落物種多樣性及組成，并進一步揭示了確定性的生物因子，如宿主身份及葉計量化學性狀與解剖學性狀共同影響葉內生真菌群落物種組成，尤其是葉鈣含量、比葉面積、葉氮含量和葉鉀含量是尖峰嶺熱帶山地雨林內生真菌群落構建的重要驅動因子。葉內生真菌群落的構建，可能同時受到確定性和隨機性因素的影響。未來的研究需要進一步闡明這些因素的相對重要性，以及真菌-真菌和真菌-植物的互作如何影響葉內生真菌群落構建。