基于內標型花瓣狀間隙增強拉曼粒子的pH傳感

張銘中，關鵬程，林嘉盛，許珊珊，張凡利，張月皎，李志勇，李劍鋒，，，6*

（1．中國計量大學 光學與電子科技學院，浙江 杭州 310018；2．廈門大學 化學化工學院，福建 廈門 361005；3．廈門大學 材料學院，福建 廈門 361005；4．廈門大學第一附屬醫院，福建 廈門 361005；5．廈門大學 能源學院，福建 廈門 361005；6．嘉庚創新實驗室，福建 廈門 361005）

汗液檢測作為一項重要的生理監測方法，其應用前景十分廣闊。通過汗液中豐富的生理信息，能夠實現更有效的健康管理，不僅可提升監測效率，還提供了更舒適的監測方式［1］。同時，汗液檢測也在推動醫學和科學領域發展方面取得了顯著進步，為疾病診斷、預防以及人體生理機制的深入研究提供了有力支持。其中對于汗液pH值的檢測有助于評估身體的酸堿平衡，反映代謝健康和運動效果，同時可早期發現代謝性疾病風險，為個體化健康管理提供重要參考。因此，對汗液pH值無創檢測的研究越來越多，如采用電化學［2-3］、比色法［4］等對汗液進行檢測。但由于汗液的pH值變化較小，以上方法很難精準反應汗液pH值的變化趨勢或檢測成本較高。

表面增強拉曼散射（SERS）技術可通過表面增強效應顯著提升拉曼光譜的信號強度［5］，其高靈敏度和單分子級別的檢測能力，在汗液pH 值檢測方面具有巨大潛力［6］，通過結合納米材料和高靈敏度的光譜分析，能夠實現微小樣本中pH 值的準確測量［7］。SERS 的高度靈敏性使其能夠捕捉pH 值的微小變化，對于生物體內的生理過程和疾病狀態監測具有重要意義。此外，SERS 還具備快速［8］、非侵入性［9-10］和無標記［11］的優點，在實時汗液pH 值監測中有很大應用空間。Chung 等［6］采用熱塑性聚氨酯（TPU）靜電紡絲與金濺射涂層相結合的方法，制備出具有機械柔性的納米纖維SERS活性襯底，所研發的SERS 汗液pH 傳感器經pH 敏感分子活化后，展現出良好的分辨率，但該活性基底對汗液pH 檢測的線性情況欠佳，需要開發更加穩定可靠的參考峰來校正信號波動。Lu 等［12］用含有內標分子信號的SERS基底檢測汗液中的尿酸，得到了良好的線性響應曲線。

Zhang 等［13］報道了一種具有強“熱點”的花瓣狀間隙增強拉曼標簽（PGERT），這種花瓣狀殼層的間隙結構在638 nm 激光激發下的SERS增強因子可達5×109。除此之外，該粒子內部間隙與表面可以修飾具有不同作用的分子，有著極其廣泛的應用前景。對于汗液pH值檢測而言，良好的增強與穩定的信號校正均可提高信號的靈敏度與穩定性。

本文在文獻［13］的基礎上，以4-巰基苯甲氰（4-MBN）為內標，制備了一種內標型的PGERT。這種形貌的粒子，能夠吸附更多的pH 敏感分子4-巰基苯甲酸（4-MBA），獲得更強更穩定的拉曼信號，且內標分子提供了穩定可靠的參考峰來校正信號波動。首先，采用原位分析池建立pH值標準曲線，然后使用人工汗液作為樣本驗證標準曲線的準確性。接著以4-MBN 為標定特征峰，得到更為優越的校準曲線，以及更高的線性關系和測量精確度，這對于其在汗液pH傳感器標定、拉曼光譜儀校準等方面的應用非常有利，基于內標型PGERT 的拉曼分析方法能夠快速、準確地檢測汗液中的pH 值，其實際應用也得到了驗證［14-15］。此外，它還具有與其它技術相結合應用的潛力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

KQ5200DA 型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），UVmini-1280 紫外可見光譜儀（島津企業管理（中國）有限公司），GeminiSEM 500 掃描電子顯微鏡（SEM），JEM-1400 透射電子顯微鏡（TEM），XploRA PLUS 高性能全自動拉曼光譜儀（HORIBA），LSP-02-2A 注射泵（LongerPump），PHS-3C pH計（上海雷磁）。

人工汗液、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）（上海源葉生物科技有限公司），抗壞血酸（AA）、硼氫化鈉（NaBH4）（上海滬試環保試劑科技有限公司），氯金酸（HAuCl4·4H2O，國藥集團化學試劑有限公司），4-巰基苯甲氰、4-巰基苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），十二水合磷酸氫二鈉、四水合磷酸二氫鈉（西隴科學股份有限公司），超純水（18.2 MΩ，力康生物醫療科技控股有限公司）。

1.2 納米粒子的合成

1.2.1 合成金種子首先合成金種子溶液［13］：在10 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 μL 4.86 mmol/L 的氯金酸溶液，并劇烈超聲。在30 ℃條件下加入450 μL 0.02 mol/L 的NaBH4，超聲混勻后靜置1 h。

1.2.2 合成金納米球在15 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 μL 7 mmol/L 的氯金酸溶液和75 μL 0.04 mol/L的AA溶液，隨后添加100 μL稀釋10倍的金種子溶液，并在40 ℃條件下持續攪拌1 h，得到約40 nm大小的金納米球。

1.2.3 金納米球改性在得到的10 mL金納米球溶膠中加入500 μL 10 mmol/L的4-MBN 溶液，常溫下超聲處理20 min。之后使用0.05 mol/L CTAC 溶液進行洗滌，重復3次。最后，將經4-MBN 改性的金核重懸于5 mL 0.05 mol/L的CTAC溶液中。

1.2.4 生長花瓣狀殼層將1 mL 4-MBN 改性后的金核溶膠加入到16 mL 0.05 mol/L CTAC 溶液、480μL 0.04 mol/L 抗壞血酸和960 μL 5 mmol/L HAuCl4的混合生長液中，加入0.5 μL 10 mmol/L 的4-MBN溶液之后，劇烈超聲7 min，得到內部修飾了4-MBN 的花瓣狀間隙增強納米粒子溶液，用0.025 mol/L CTAC 溶液洗滌得到的溶液。取4 mL 按照上述方法合成的花瓣狀間隙增強納米粒子，加入500 μL 10 mmol/L 的4-MBA，超聲反應10 min。用超純水清洗兩次，并將溶液定容至原體積的1/5，得到外部修飾了4-MBA的花瓣狀間隙增強拉曼標簽。具體制備過程如圖1所示。

圖1 PGERT的制備過程Fig.1 The procedure of PGERT

最后取20 μL PGERT 溶膠滴加在5 mm×5 mm 的金片（單晶硅片上蒸鍍80 nm 厚度的金層）上烘干，制備成pH分析基底。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 SEM與TEM分析修飾有4-MBA的PGERT的SEM與TEM表征結果如圖2A所示。從圖中可以看到PGERT的外層形貌呈現出完整的花瓣狀結構，其粒徑約110 nm，且分散性較好?；ò隊顨咏Y構的PGERT具有豐富的孔隙結構、更多的熱點和更大的比表面積，有助于待測物的牢固吸附和富集，從而提升檢測靈敏度。

圖2 PGERT的SEM和TEM圖（A），金球修飾4-MBN前后的吸收光譜（B），PGERT修飾4-MBA前后的吸收光譜（C），分別修飾有4-MBA的PGERT與45 nm金球在相同濃度（1 nmol/L）下于1 710 cm-1處的SERS信號強度（D）Fig.2 The SEM & TEM image of PGERT（A），absorption spectra of gold nanoparticles before and after 4-MBN modification（B），absorption spectra of PGERT before and after 4-MBA modification（C），SERS signal intensity at 1 710 cm-1 of PGERT and 45 nm gold spheres modified with 4-MBA at 1 nmol/L（D）

2.1.2 PGERT 合成過程中的紫外-可見吸收光譜對粒子的吸收光譜進行了測試。修飾4-MBN 前金核的吸收光譜位于529 nm，將4-MBN 修飾到金球表面后，吸收光譜移至531 nm（圖2B）。4-MBN 作為內標的花瓣狀間隙增強納米粒子在約672 nm 處出現紫外吸收峰，經pH 敏感分子4-MBA 活化后，紫外吸收峰紅移至約675 nm（圖2C）［5］。同樣在1 nmol/L的濃度下，修飾有4-MBA的PGERT的SERS信號強度是修飾有4-MBA 的45 nm金球的122倍（圖2D），即使用修飾有4-MBA 的PGERT作為基底可以獲得更強的拉曼信號，有利于觀察4-MBA拉曼峰相對強度的變化，在一定程度上提高分析的靈敏度與準確性。

2.2 pH標準曲線的測定與人工汗液的實際檢測

2.2.1 原位測定pH 標準曲線為減少4-MBA 信號波動帶來的影響，采用原位分析池測定pH 標準曲線以提高穩定性，即使拉曼聚焦點在基底同一個位置保持不變，用注射泵注入不同pH值（pH 5.0~8.0）的標準磷酸緩沖液（PB），使用波長638 nm的激發光源采集信號，采集條件為10 s，2.6 mW，測試裝置如圖3A 所示。根據拉曼信號標定pH 值時，以受pH 值影響較小的拉曼峰為參考峰，通過pH 活性峰與參考峰積分之后的強度比（I積分（pH活性峰）/I積分（參考峰））的變化趨勢反應pH值的變化。

圖3 原位測試示意圖（A），修飾有4-MBA 的普通金球分析基底在不同pH 條件下的拉曼譜圖（B）及不同pH 值條件下，其在1 710 cm-1處拉曼信號的變化譜圖（C）以及I（1 710 cm-1）與I（1 080 cm-1）（D）和I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E）對pH值的擬合曲線Fig.3 Schematic of in-situ testing（A），Raman spectra of 4-MBA modified gold nanoparticles on a common gold substrate under different pH conditions（B），intensity of the 1 710 cm-1 Raman signal under different pH conditions（C），fitting curves of I（1 710 cm-1）/I （1 080 cm-1）（D） and I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E） to pH

實驗所涉及的拉曼峰歸屬如表 1 所示。在不同pH 值環境下，4-MBA 的羧基接受質子或釋放質子，主要反應在1 710 cm-1（羧酸鹽振動?（COO-）［16］）處的拉曼峰上。而來自于苯環呼吸的1 080 cm-1和1 590 cm-1處的拉曼峰受pH值的影響較小，以其為參考峰考察pH活性峰相對強度的變化［17］。

修飾有4-MBA的普通金球（45 nm）制備的pH分析基底在不同pH條件下的拉曼光譜圖如圖3B所示。其在1 710 cm-1處的拉曼峰強度隨著pH 值的升高而降低（圖3C）。將得到的數據代入I積分（pH 活性峰）/I積分（參考峰）中（參考峰分別為1 080 cm-1和1 590 cm-1處的峰），通過計算得到I（1 710 cm-1）與I（1 080 cm-1）積分的比值以及該比值與pH 值的擬合曲線，其相關系數r2=0.97（圖3D）。該結果的誤差棒較大，說明準確度較低。而以I（1 710 cm-1）/I（1 590 cm-1）積分的比值擬合分析曲線時，r2=0.95（圖3E）且誤差棒較大。因此，用普通金球作為分析基底時不能精準體現pH值的變化趨勢。

表1 含有內標分子的PGERT所涉及的拉曼峰歸屬Table 1 Assignment of Raman peaks associated with internal standard molecules in PGERT

對內標型花瓣狀間隙增強拉曼粒子構建的pH 分析基底進行考察。在含有內標分子的PGERT 中，以內標分子4-MBN 在2 234 cm-1處的拉曼峰（氰基的伸縮振動?（C≡N））作為參考峰。4-MBN 在環境中比4-MBA 更穩定，此外，4-MBN 在拉曼靜默區的拉曼峰減少了雜質影響的可能性。修飾有4-MBA 的PGERT 在不同pH 值條件下的拉曼光譜如圖4A 所示，隨著pH 值的升高，4-MBA 在1 710 cm-1處的拉曼活性峰相對2 234 cm-1處的參考峰強度明顯下降。隨著pH值的變化，1 710、2 234 cm-1處的拉曼峰強度如圖4B 所示，圖4C 為I（1 710 cm-1）/I（2 234 cm-1）積分的比值與pH 值的擬合曲線。結果顯示，含有內標的PGERT 得到了線性系數r2=0.99 的擬合曲線和誤差棒較小的擬合結果，說明含有內標的PGERT 在標準PB緩沖液中可以更準確地反應所處環境的pH值。

圖4 修飾有4-MBA的PGERT作為分析基底時在不同pH值條件下的拉曼譜圖（A），1 710、2 234 cm-1處的拉曼信號強度隨pH值的變化圖（B），I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1）對pH值的擬合曲線（C）Fig.4 Raman spectra of PGERT modified with 4-MBA under different pH conditions（A），intensity of the 1 710，2 234 cm-1 Raman signals under different pH conditions（B），fitting curve of I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1） to pH value（C）

含有內標的PGERT 的pH 標準曲線有更好的線性關系，歸因于其內部疏松多孔的“花瓣”間隙可以提供豐富的熱點［18］，并使更多的4-MBA 修飾其上，提供了更強且穩定的4-MBA 信號，從而可獲得更高的靈敏度。而以4-MBN 為內標分子，可提供相對穩定可靠的參考峰信號進行標準曲線校正，在外界條件變化時更具穩定性［19-20］。

2.2.2 汗液pH 值檢測人體汗液含有多種成分，包括電解質、氨基酸、脂質、乳酸等，這些成分可能對實際pH 值測定產生影響。人工汗液的成分與正常人體汗液相似度高達99.99%，本文以人工汗液為實際樣品考察所建基底的實用性。采用pH 計對4 份人工汗液進行測量，得到人工汗液的實際pH 值分別為5.06、5.63、6.58、7.06。

取1 μL 不同pH 值的人工汗液樣品滴在附著有內標型PGERT 的pH 分析基底上，使用638 nm 波長的激發光進行信號采集，將得到的數據代入到公式I積分（pH 活性峰）/I積分（參考峰）中，并代入擬合方程，得到的pH 值分別為4.95±0.26、5.37±0.06、6.20±0.02、6.80±0.07，與pH 計的測得值基本一致，結果如表2 所示?；趦葮诵突ò隊铋g隙納米拉曼標簽的傳感器僅需1 μL 即可實現人體汗液的高靈敏、可靠檢測，具有實際應用價值。

表2 pH計與內標型PGERT基底汗液測得值的比較Table 2 Comparison of sweat pH values measured by pH meter and internal standard PGERT substrate

3 結 論

本文以4-MBA 為pH 探針分子，引入4-MBN 分子作為內標，制備了一種含有內標的花瓣狀間隙拉曼納米標簽，并用于構建pH 分析基底，對其在汗液pH 傳感中的適用性進行了研究。結果表明，含有內標的PGERT 可以穩定地測試汗液的pH 值，能在pH 5.0~8.0 之內提供精確傳感（與實際pH 值的誤差最大僅為7.17%），僅需1 μL 汗液即可實現測量。該標簽在pH 值檢測方面表現優異，其快的響應速度和高的靈敏度使之在實時監測生物體液pH值變化中具備出色的能力，在醫學、運動生理學等領域具有潛在的應用價值。

含有內標的PGERT可以實現實時、連續的汗液分析，有助于個體的健康管理、運動調節和疾病監測，應用前景廣闊［21-22］。將此類花瓣狀間隙增強拉曼標簽與可穿戴式汗液檢測技術相結合（如水凝膠［2］、微流體芯片［23］、便攜式設備［24］和皮膚貼片［25］等），將為健康監測和醫學診斷領域帶來新的可能性，在汗液檢測和生物傳感器領域具有新的應用前景。