三個豬種PPARγ2基因的多態性分析

孫奴奴,王美如

(運城學院 生命科學系,山西 運城 044000)

杜長大三元雜豬種是以杜洛克豬作為終端父本、長白豬和大約克豬作為終端母本培育而成的商品型豬種,具有生長速度快、適應性好、增重快、飼料報酬高、胴體性能好、瘦肉率高、肉色好等特點,近幾年占據著我國90%以上的商品豬市場[1]。晉汾白豬是一種以馬身豬、太湖豬(二花臉類群)等國內豬種與長白豬等國外豬種作為親本[2],經過雜交培育出優良豬種作為終端母本和以大白豬為父本培育出的國家級新型瘦肉型品種豬,具有產仔多、生長快、肉質品質好等優點,已經正式通過了國家畜禽遺傳資源委員會的審定,成為山西省首個國家級的豬新品種。新山西黑豬,亦稱山西瘦肉型豬新品系(SD-Ⅱ系),是在山西黑豬的基礎上,利用基因導入技術引入外國豬種血緣,經過10年的不斷選育而形成的新型山西地方豬種,具有生長速度快、產仔性能好、抗病力強、適應性廣、抗逆性強、瘦肉率高、肉質鮮美、經濟價值高等品種優勢,得到了行業和社會的廣泛關注和認可,具有良好的商業發展前景[3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一類基因轉錄子,屬于核激素受體超家族,1990年Issemann[4]等首先發現該受體并進行了命名。PPARs基因分PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三種亞型,編碼產物分別有468、441、479個氨基酸殘基。PPARs包含6個區域,從氨基端到羧基端依次為A/B、C、D,以及E/F,其中A/B區為調節區,通過MAPK介導一絲氨酸殘基磷酸化提高PPARα的受體-配體親和力,同時降低PPARγ的活性;C區是DNA結合域(DBD),PPAR通過此結構與DNA上的過氧化物酶體增殖物激活受體反應元件(PPRE)結合從而調節靶基因轉錄;D區是轉錄活性調節結構域,許多核內因子與此結構域結合后可影響PPARs的活性;E/F區是配體結合結構域(LBD),該結構域在轉錄激活過程中起關鍵作用。PPARα基因在心、肝、腎等代謝活躍器官表達量較高,在脂肪和軟骨中表達量較低;PPARβ/δ基因廣泛表達于多種器官和組織;而PPARγ基因主要表達于脂肪、血管內皮細胞和平滑肌細胞[5]。

人的PPARγ2基因編碼產物具有多種生物學功能,PPARγ2基因與糖尿病患者肥胖[6]、脂肪細胞分化和脂質代謝[7]、胰島素抵抗和糖尿病[8]等相關,有時對腫瘤有雙重作用[9]。近年來,在豬PPARγ2基因方面的研究也有了一定的進展。2012年,梁家充[10]等研究廣西巴馬小型豬PPARγ2基因第2外顯子與2型糖尿病易感性的關系,結果顯示PPARγ2基因第2外顯子19813A/G突變與廣西巴馬小型豬血清胰島素水平和糖耐受性降低有關,19813AG基因型個體T2DM易感性明顯高于19813AA基因型個體。2009年,王桂英[11]等采用PCR-SSCP方法對PPARγ2基因的部分序列進行多態性位點檢測,結果顯示,在5′調控區219 bp處和323 bp處以及exon6的147 bp處各發現1個A→G突變,且與豬產仔數相關。2013年,朱云[12]等利用PCR-RFLP方法對豬PPARγ2基因第一啟動子Bsrl位點進行多態性分析,結果顯示該位點出現A/G突變,形成b、Bb和B型三種基因型,且與肉質性狀相關聯。2016年,王順利[13]等利用PCR-SSCP方法檢測大河烏豬PPARγ2基因第2外顯子區的多態性,結果顯示該位點基因型均為純合AA型,并未發現多態性。

本研究以這三種豬為研究對象,采用PCR-RFLP方法對PPARγ2基因第一啟動子Bsr1位點多態性進行檢測與分析,為研究PPARγ2基因及其Bsr1位點多態性對脂肪相關性狀的影響提供基礎材料,對豬場養殖及優良的豬種選育等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用由運城新龍豐畜牧有限公司提供的33頭杜長大三元雜豬、23頭晉汾白豬及33頭新山西黑豬的耳組織作為實驗材料,分別放入1.5 mL滅菌后的離心管中,然后向放有組織的離心管中加入75%的無水乙醇,使耳組織被完全浸沒。將離心管進行標號,然后放入冰盒中帶回實驗室,放于-20℃冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑與儀器設備

基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCRmix、瓊脂糖、過硫酸銨、甘油、TEMED、甲醛等(購自北京華越洋生物工程有限公司);引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司);PCR擴增儀(Thermal cycler-2720)(上海賓智生物科技公司);數碼凝膠成像分析系統(Tanon-1600)(武漢愛斯佩科學儀器公司);DYCZ-28D雙板夾芯式垂直電泳儀,DYY-6C恒溫恒壓電泳儀(北京六一生物科技有限公司);TGL-16M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取及引物合成

使用基因組DNA提取試劑盒提取豬基因組DNA;引物參考朱云[12]的實驗進行設計(登錄號:AJ006757),并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.2 PCR及SSCP

以DNA為模板進行PCR擴增,10μL反應體系為:DNA(0.5μL),上游引物(0.2μL),下游引物(0.2μL),2×Taq PCR Master Mix(5μL),雙蒸水(4.1μL);PCR反應程序為:預變性95℃,5 min,94℃變性30 s,52.6℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環,72℃后延伸5 min;用限制性核酸內切酶(Bsr 1)酶切經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增成功的PCR產物,酶切反應體系總體積為15μL,其中PCR產物10μL,10×Buffer R1.5μL,雙蒸水3.5μL,Bsr 1酶0.1μL,將酶切反應體系混勻,于37℃下放置消化4 h,然后利用3%的瓊脂糖凝膠檢測,最后利用凝膠成像系統拍照并判別基因型。

1.3.3 數據的統計處理

基因型結果利用PopGen 32軟件進行群體遺傳學分析,并利用SAS 8.1統計軟件進行卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物檢測結果

2.1.1 杜長大三元雜豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

以杜長大三元雜豬的DNA為模板,PCR擴增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴增產物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳,結果如圖1所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴增結果。圖1 杜長大三元雜豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

如圖1所示,1—10泳道為擴增得到的杜長大三元雜豬PPARγ2基因目的條帶?？梢钥闯鯠NA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250 bp,符合預計的284 bp長度,目的基因擴增成功,DNA條帶明亮,未出現雜帶,可用于后續操作。

2.1.2 晉汾白豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

以晉汾白豬的DNA為模板,PCR擴增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴增產物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳,結果如圖2所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴增結果。圖2 晉汾白豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

如圖2所示,1—10泳道為擴增得到的晉汾白豬PPARγ2基因目的條帶,可以看出DNA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250 bp,符合預計的284 bp長度,目的基因擴增成功,DNA條帶明亮,未出現雜帶,可用于后續操作。

2.1.3 新山西黑豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

以新山西黑豬的DNA為模板,PCR擴增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴增產物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳,結果如圖3所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴增結果。圖3 新山西黑豬PPARγ2基因PCR擴增產物檢測結果

如圖3所示,1—10泳道為擴增得到的新山西黑豬PPARγ2基因目的條帶,可以看出DNA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250bp,符合預計的284 bp長度,目的基因擴增成功,DNA條帶明亮,未出現雜帶,可用于后續操作。

2.2 酶切產物檢測結果

2.2.1 杜長大三元雜豬PPARγ2基因酶切產物檢測結果

用限制性核酸內切酶(Bsr1)對杜長大三元雜豬PPARγ2基因擴增產物進行酶切,酶切檢測結果如圖4所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1、4、5為Bb型;2、3、7—10為BB型;6為bb型。圖4 杜長大三元雜豬PPARγ2基因Bsr1位點酶切產物檢測結果

從圖4可知,在杜長大三元雜豬中檢測到BB、bb、Bb三種基因型,表明PPARγ2基因Bsr1位點在杜長大三元雜豬中存在多態性。

2.2.2 晉汾白豬PPARγ2基因酶切產物檢測結果

用限制性核酸內切酶(Bsr1)對晉汾白豬PPARγ2基因擴增產物進行酶切,酶切檢測結果如圖5所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1—9、12為BB型;10—11、13為Bb型。圖5 晉汾白豬PPARγ2基因Bsr1位點酶切產物檢測結果

從圖5中可知,在晉汾白豬中檢測到BB、Bb兩種基因型,表明PPARγ2基因第一啟動子Bsr1位點在杜長大三元雜豬中存在多態性。

2.2.3 新山西黑豬PPARγ2基因酶切產物檢測結果

用限制性核酸內切酶(Bsr1)對新山西黑豬PPARγ2基因擴增產物進行酶切,酶切檢測結果如圖6所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1—10均為BB型。圖6 新山西黑豬PPARγ2基因Bsr1位點酶切產物檢測結果

從圖6中可以看出,在新山西黑豬中只檢測到一種基因型:BB,表明PPARγ2基因第一啟動子Bsr1位點在新山西黑豬中不存在多態性。

2.3 統計學分析

2.3.1 基因型和等位基因頻率分析

采用軟件PopGen32對杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬的PPARγ2基因Bsr1位點的酶切分型結果進行統計分析,得出表1所示結果:

表1 三種豬PPARγ2基因Bsr1位點基因型與等位基因頻率分析結果

由表1可知,杜長大三元雜豬中出現了BB、Bb、bb三種基因型,其中BB基因型頻率為0.6061,Bb基因型頻率為0.3636,bb基因型頻率為0.0303;晉汾白豬中出現了BB、Bb兩種基因型,其中BB基因型頻率為0.7826,Bb基因型頻率為0.2174;新山西黑豬中只出現了BB一種基因型,其基因型頻率為1.0000。結果顯示,三豬種的優勢基因型均為BB基因型,優勢等位基因均為B。

2.3.2 純合度、雜合度和香農指數分析

利用軟件PopGen32對杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三種豬進行群體遺傳學分析,得出表2所示結果:

表2 三種豬的群體遺傳學分析結果

由表2可知,杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬的純合度分別為0.6364、0.7826、1.0000,新山西黑豬的純合度高于杜長大三元雜豬、晉汾白豬,說明新山西黑豬的遺傳性能相較于晉汾白豬、杜長大三元雜豬更穩定。香農指數越高,表明多態性越豐富,杜長大三元雜豬的香農指數(0.5168)高于晉汾白豬的香農指數(0.3438),說明杜長大三元雜豬的遺傳多態性更豐富。杜長大三元雜豬和晉汾白豬的P值均大于0.05(P=0.672000>0.05,P=0.604479>0.05),說明PPARγ2基因Bsr1多態性位點在兩豬種中均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3.3PPARγ2基因Bsr1位點基因型分布差異性分析

利用軟件SAS 8.1檢測PPARγ2基因Bsr1位點的基因型分布在杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個豬種群體中是否有差異。結果如表3所示:

表3 PPARγ2基因Bsr1位點基因型分布差異性分析

由表3可知,P值為0.0025,P<0.01,表明PPARγ2基因Bsr1位點在杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個豬種群體中基因型分布差異極顯著。

3 討論與結論

根據朱云[12]等的研究可知,PPARγ2基因經PCR擴增得到的產物大小為284 bp,在第一啟動子區有1個Bsr1酶切位點,可產生173 bp和111 bp兩個片段。本實驗以33頭杜長大三元雜豬,23頭晉汾白豬,33頭新山西黑豬為研究對象,采用PCR-RFLP方法對PPARγ2基因第一啟動子Bsr1位點的多態性進行研究。結果顯示,PPARγ2基因Bsr1位點酶切后在杜長大三元雜豬中能檢測到三種基因型(BB、bb、Bb),在晉汾白豬中能檢測到兩種基因型(BB、Bb),在新山西黑豬中只能檢測到一種基因型(BB)。三豬種的優勢基因型均為BB基因型,優勢基因均為B等位基因。

應用PopGen32軟件對三豬種進行遺傳學分析,結果顯示,杜長大三元雜豬和晉汾白豬的P值均大于0.05,說明PPARγ2基因的第一啟動子Bsr1多態性位點在兩豬種中均符合Hardy-Weinberg平衡。應用SAS8.1軟件對三豬種進行卡方檢驗,結果顯示,PPARγ2基因Bsr1多態性位點的不同基因型在杜長大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個豬種群體中分布差異極顯著(P=0.0025<0.01)。朱云等[12]對山豬的研究結果表明,PPARγ2基因Bsr1位點出現突變,存在b、Bb、b三種基因型,且在不同豬種中此位點的基因型頻率不同,與本實驗結果基本一致。晉汾白豬、新山西黑豬中個別基因型不出現的原因可能有以下兩點:一是樣本數量太少,晉汾白豬23頭,不滿足統計分析樣本數量最低要求,可擴大樣本數量。新山西黑豬33頭,雖然已經滿足統計分析樣本數量最低要求,但樣本數量仍偏低;二是由于環境等原因使得PPARγ2基因在不同豬種中的遺傳穩定性存在差異。