氨基酸轉運蛋白介導植物免疫研究進展

郭 楠，瞿紅葉，高 菲，徐國華

（1 揚州大學園藝園林學院，江蘇揚州 225009；2 南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇南京 210095；3 作物遺傳與種質創新利用全國重點實驗室，江蘇南京 210095）

氮是植物各項生命活動所必需的大量營養元素，在植物生長發育以及抗病中扮演著十分關鍵的角色。土壤中的無機氮(銨態氮、硝態氮)和較小分子的有機氮(氨基酸、小肽) 是植物主要的氮素來源。由于病原菌也需要獲得氮素養分來維持自身生長和繁殖，因此氮素是植物-病原菌間相互作用的關鍵物質。前人已經總結對比了供銨或供硝處理對植物免疫的影響[1-2]，總體上來說，當活體營養型病原菌侵染植物時，外源添加硝態氮會降低植物的抗病性，而供銨能夠提高植物的抗病性。當植物感染半活體營養型或死體營養型病原菌時，植物抗病性受植物種類、無機氮形態和濃度等多種因素的影響[1]。此外，參與無機氮吸收轉運的轉運蛋白，如擬南芥硝酸鹽轉運蛋白nitrate transporter 2.1 (AtNRT2.1)和AtNRT2.2 及銨態氮轉運蛋白ammonium transporter 1.1 (AtAMT1.1) 等在植物抗病中也起到了重要作用[3-4]。

植物根系吸收的銨態氮和硝態氮主要分別在細胞質和質體中同化為氨基酸[5]。雖然根系吸收的硝態氮主要轉移到地上部被還原為銨進而同化為氨基酸，但對大多數植物而言，氨基酸是氮素從源到庫長距離運輸的主要形式[6]。氨基酸作為蛋白質合成的前體物質，對植物根、葉、花、種子發育尤為重要，因此氨基酸運輸系統是植物生長發育過程中的關鍵組成部分[7]。近年來，氨基酸及氨基酸轉運蛋白在植物免疫中的作用也引起研究人員的關注。本文重點聚焦氨基酸積累和運輸對植物免疫的影響，總結了氨基酸轉運蛋白在植物抗病中的作用，探討了氨基酸運輸分配調控植物-病原菌互作的機制。

1 氨基酸穩態在植物免疫中的作用

病原菌常常從植物中獲取氨基酸以滿足自身生長繁殖，病原菌和宿主植物間的氨基酸動態平衡直接影響了植物的抗病性[8]。當植物遭遇病原菌入侵時，病原菌在宿主植物的質外體中快速繁殖，此時，宿主植物一方面通過轉移營養物質來餓死病原菌，另一方面激活體內的防御反應，如大量積累活性氧，釋放信號提醒未遭到侵染的組織細胞，抑制病原菌的生長[9]。病原菌和宿主植物對氮營養的競爭是一個復雜的過程，病原菌能否成功入侵宿主，既取決于病原菌利用植物組織中的氮形態、氮轉運和氮代謝的能力，又與宿主細胞對其防御能力有關[10-11]。在防御過程中，植物約釋放出15% 同化后的氮營養，且主要是以氨基酸的形式[12]。有研究發現，硝酸鹽缺陷型褐孢霉(Cladiosporumfulvum)或稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)仍具有致病性[13-14]，而甲硫氨酸缺陷型稻瘟病菌和精氨酸缺陷型尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporium)則不具有致病性[15-16]，說明病原菌侵染植物過程中，病原菌的生長更依賴于宿主植物提供的氨基酸態氮，而非硝態氮。

病原菌的化學感受器能夠識別多種氨基酸，并將微生物引導至宿主植物營養充足的組織中，因此某些特定氨基酸穩態影響了植物和病原菌之間的共生關系[17]。植物能夠檢測其體內的氨基酸水平，并將氨基酸代謝、局部氨基酸濃度變化、氨基酸跨膜運輸等活動視為遭到病原菌入侵的表現[18]。通常感染病原菌的局部植物組織中氨基酸濃度升高，比如當獼猴桃感染丁香假單胞菌后(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)，被侵染葉片中精氨酸和谷氨酰胺含量出現持續性增加，碳氮代謝途徑均發生變化[19]。韌皮部桿菌侵染柑橘后導致柑橘出現黃龍病，黃龍病是生產上的毀滅性病害，又叫做“柑橘艾滋”?？共∧芰姷母涕夙g皮部汁液中色氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸含量明顯高于易感病植株[20]。脯氨酸作為一種自由基清除劑，能夠調節植物細胞氧化還原穩態，參與植物對生物脅迫的防御反應[21]。擬南芥感染丁香假單胞菌后(Pseudomonassyringaepv.tomato)，葉片中脯氨酸含量顯著增加[22]。同時病原菌，如假單胞桿菌屬細菌(Pseudomonas)，也常常進化為能夠高效利用植物感染組織中豐度高的氨基酸組分，而選擇性地丟失同化利用豐度較低的那類氨基酸的基因[23-24]，說明寄主植物組織中高濃度的氨基酸既是病原菌重要的養分來源，又是植物感染病原菌后的反應之一。

氨基酸合成和代謝在植物應對生物脅迫中同樣發揮著重要作用，半胱氨酸在細胞不同區室中的代謝能夠誘導不同的植物免疫反應，促進線粒體中半胱氨酸降解或抑制細胞質中半胱氨酸降解均能夠增強植物的抗病性。半胱氨酸脫硫酶能夠催化半胱氨酸脫硫生成丙氨酸和硫，在擬南芥中過量表達線粒體半胱氨酸脫硫酶(nitrogenfixations-like1,NFS1)后，植株體內抗性相關基因表達上調，轉基因植物對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性顯著增加[25]。相反，細胞質半胱氨酸脫硫酶(cytosolicdesulfhydrase1,DES1)突變后增強了植物的抗病性[26]。此外，有些氨基酸代謝或轉運相關蛋白功能缺失雖然改變植物細胞中的氨基酸穩態，但沒有激活植物免疫反應[27]。即使是在已經產生防御反應的植物體內，某些特定的氨基酸濃度也不會持續地表現出相同的變化，所以植物細胞中局部氨基酸水平變化可能是觸發免疫反應的關鍵。

外源添加游離氨基酸也能夠觸發植物免疫反應。谷氨酰胺處理水稻根系后，參與水稻抗病的轉錄因子基因，如dehydration-responsiveelementbindingprotein1A(DREB1A)、bHLH(basichelix-loophelix)、noapicalmeristemprotein5(NAC5)等表達上調[28]。谷氨酸處理水稻根系后，根系和葉片中與抗病相關的基因同樣被激活表達[29]。

氨基酸既是病原體的營養來源，又是植物體內氮的主要運輸形式。氨基酸轉運過程需要與特定受體結合，這些受體可能參與寄主植物與微生物相互作用時氨基酸運輸和信號傳導等過程。因此，了解氨基酸轉運、解析氨基酸轉運驅動植物-微生物間相互作用的分子機制至關重要。

2 氨基酸轉運蛋白在植物免疫中的作用

氨基酸在植物細胞內和細胞間跨膜運輸由定位在膜系統上的氨基酸轉運蛋白(AATs)負責[30]。植物中編碼氨基酸轉運蛋白的基因達一百多個，在植物進化過程中，由于基因復制，植物轉運蛋白家族成員的數量越來越多。不同植物氨基酸轉運蛋白的氨基酸序列較為保守，物種間同源基因之間的同源性可高達98%[31-32]。氨基酸轉運蛋白家族包括2 個亞家族，分別是氨基酸/生長素通透酶家族(amino acid transporter family, AAAP)和氨基酸-多胺-膽堿家族(amino acid polyamine organocation family，APC)[32]。此外多種酸進出轉運蛋白家族(usually multiple acids move in and out transporter family, UMAMIT)介導植物體內氨基酸的外排，在氨基酸轉運過程中也起到了重要作用[33]。迄今為止，在模式植物擬南芥中，約20%編碼氨基酸轉運蛋白的基因功能初步得到解析[27, 34]。

病原體以植物體內氨基酸為食，氨基酸在植物與病原體相互作用中發揮著重要作用。從節約能量的角度來說，病原體更傾向于直接獲取和代謝植物體內的氨基酸，因此病原體可以直接誘導或激活氨基酸轉運蛋白基因表達[34]。目前已報道的參與植物抗病的轉運蛋白主要有AAAP 亞家族中的氨基酸透性酶子家族(amino acid permeases, AAPs)和賴氨酸組氨酸轉運蛋白子家族(lysine and histidine transporters,LHTs)、APC 亞家族中的陽離子氨基酸轉運蛋白子家族(cationic amino acid transporters，CATs)以及UMAMITs 家族(表1)。

表1 氨基酸轉運蛋白在植物防御生物脅迫中的作用Table 1 Roles of amino acid transporters in plant immunity to pathogenic attack

2.1 氨基酸透性酶家族(AAPs)

植物中第一個被報道的氨基酸轉運蛋白就是AAPs家族基因編碼的[44]。AAPs參與植物氨基酸根系吸收、木質部裝載、韌皮部裝載、木質部和韌皮部間交換以及種子裝載等過程，影響植物根、莖、葉的生長發育[30]。擬南芥中有8 個AAP基因，在AAPs家族中，AtAAP1 和AtAAP5 負責根系氨基酸的吸收[45-46]。AtAAP2 在韌皮部表達，影響氨基酸從木質部進入到韌皮部。AtAAP2 功能缺失后，突變體植株韌皮部中的氨基酸以及庫中的氨基酸含量均顯著減少，導致種子中的蛋白質含量下降[47]。AtAAP6 定位在木質部薄壁細胞，影響了木質部和韌皮部間氨基酸的交換[48]。而AtAAP8 負責韌皮部裝載，并將氨基酸運至胚乳中，在種子發育過程中起到重要作用[49-50]。此外，AAPs 家族基因表達還受到病原菌侵染的誘導。胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)侵染擬南芥時，線蟲能夠將寄主植物的根細胞轉化為一個合胞體，合胞體是線蟲整個生命周期中唯一的營養來源。此時，植物在侵染部位周圍會進化出防御機制來干擾合胞體的形成。在這個過程中，除了AtAAP5和AtAAP7，其他6 個AtAAPs基因在合胞體中均被誘導表達。此外，AtAAP1、AtAAP2、AtAAP8突變體合胞體中氨基酸轉運紊亂，雌性線蟲的繁殖受到明顯抑制，說明氨基酸穩態對線蟲的生長發育起到至關重要的作用[35]。當根結線蟲(Meloidogyneincognita)侵染擬南芥植株時，AtAAP3和AtAAP6突變后，植株根中線蟲侵染程度顯著下降，線蟲繁殖受到抑制，突變體植株抗病性增強，說明由AAP3和AAP6介導的氨基酸轉運在線蟲侵染和繁殖過程中均起到重要作用[36]。

值得注意的是，當病原菌入侵時，植物根系不同細胞中氨基酸轉運蛋白呈現出不同的表達模式。近期一項研究發現，半活體營養型卵菌(Phytophthora parasitica)侵染擬南芥后，AtAAP3和AtAAP5在根系中柱組織表達上調，AtAAP6在根系皮層和中柱表達上調。而當半活體營養型病菌(Verticilliumlongisporum)侵染擬南芥后，擬南芥根系皮層中僅有AtAAP4表達受到誘導，而皮層細胞中AtAAP1和根表皮細胞中的AtAAP2的表達則受到抑制[51]?；铙w營養型卵菌(Pseudoperonosporacubensis)能夠引發黃瓜霜霉病，轉錄組結合QTL 精細定位挖掘出黃瓜CsAAP2A基因是感病的關鍵候選基因。CsAAP2A功能缺失后，突變體植株葉片氨基酸含量較野生型顯著下降，突變體抗病性增強。此外，敲除CsAAP2A在番茄中的同源基因SlAAP5A/SlAAP5B后，突變體植株的抗病性也增強了[37]，說明AAP家族基因在不同植物中均可以通過影響氨基酸轉運進而影響植物的抗病性，其功能具有一定的保守性。

AAPs是植物防御機制中的負調節因子，一方面AAPs高表達時降低植物的免疫反應，使植物處于易感病狀態；另一方面病原菌可能通過誘導AAPs基因的表達，改變植物體內游離氨基酸穩態，使感染病原菌的葉片中氨基酸含量增加，為病原菌提供充足的營養物質以滿足其生長需求。病原菌對植物氨基酸轉運蛋白的調控較為復雜，在后續研究中需要考慮到因局部細胞中基因表達差異而導致的氨基酸穩態出現的變化。

2.2 賴氨酸組氨酸轉運蛋白家族 (LHTs)

LHTs 家族因被報道轉運賴氨酸和組氨酸而得名，隨后的研究發現其與AAPs家族基因類似，底物具有非特異性，能夠轉運絕大多數的氨基酸[52-54]。擬南芥AtLHTs家族基因共有10 個，其中AtLHT1 是該家族中首個功能被解析的轉運蛋白[52]。AtLHT1 是一個高親和轉運蛋白，負責中性和酸性氨基酸的吸收轉運[53]。AtLHT1 參與植物根系氨基酸的吸收，并將氨基酸運輸至葉肉細胞中，功能缺失后導致擬南芥植株矮小，生物量下降，抗病性增強[38,53]。

大多數活體營養型病原體以植物組織質外體中的氨基酸為主要營養來源，當擬南芥感染活體營養型或半活體營養型病原體時，AtLHT1基因表達上調[38,51]。病原菌自身能夠通過改變植物基因表達來獲得其生長繁殖所需要的營養物質[55]。因此，當植物感染病原菌時，植物氨基酸轉運蛋白表達變化可能是病原菌和植物體內氨基酸穩態共同作用的結果。從植物的角度來說，AtLHT1基因表達上調后，氨基酸大量進入葉肉細胞中，導致被感染的葉片質外體中的氨基酸含量下降，病原菌可獲得的養分減少，最終達到餓死病原菌的目的。但是試驗結果與推測相反，AtLHT1 在植物免疫反應中是一個負調節因子，Atlht1突變體對細菌(Pseudomonassyringae)和真菌(Colletotrichumhigginsianum，Erysiphecichoracearum)的抗性是增強的[38]。研究人員推測當病原菌侵染擬南芥時，AtLHT1功能缺失導致擬南芥細胞中谷氨酰胺含量下降，影響細胞氧化還原穩態，細胞中活性氧大量積累，誘導細胞程序性死亡。同時植物葉片中參與水楊酸介導的免疫反應途徑的關鍵基因PR1(pathogenesis-relatedprotein1)表達上調，組織中水楊酸含量增加，從而觸發防御機制，導致突變體植株表現出較強的抗病性(圖1)[38]。在感染過程中觀察到AtLHT1表達量增加，這個病原菌觸發AtLHT1表達的響應過程被推測為植物抑制水楊酸介導的免疫途徑[38]。

死體營養型生物感染植物后，是從死的寄主組織中獲取養分。根據寄生的特性又分為兩種情況：一種像活體營養生物一樣，侵染活的細胞和組織，但寄主組織死亡后，能繼續生長、繁殖；另一種是在侵入前先分泌酶或毒素殺死寄主組織，然后進人其中腐生[56]。植物抵御死體營養型病原體主要是通過乙烯/茉莉酸(ET/JA)途徑[57-58]。研究發現，草莓果實感染死體營養型真菌(Botrytiscinerea)后，LHT1同源基因表達上調[59]。值得注意的是，擬南芥Atlht1突變體對死體營養型病原菌(Sclerotiniasclerotiorum)的防御能力與野生型相比沒有差異[38]。AtLHT1 除了能夠轉運氨基酸，還可以轉運乙烯合成的前體物質1-氨基環丙烷羧酸(ACC)[60]。當死體營養型病原菌感染寄主植物時，LHT1基因表達上調，植物激活免疫反應，通過影響植物體內ACC 水平，激活乙烯介導的抗病途徑，從而激活了植物感染死體營養型病原菌后的免疫反應(圖1)。

近幾年，水稻、楊樹、人參等植物LHTs家族基因的功能也已陸續被報道[54,61-62]。其中，單子葉模式植物水稻OsLHT1 不僅直接負責根系對氨基酸的吸收，參與氨基酸從根系往地上部轉運以及葉片往穗中的轉運過程，影響水稻的生長發育和產量，而且介導水稻對稻瘟病的抗性[39,54,63]。當稻瘟病病原菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻葉片時，OsLHT1基因表達上調，葉片中氨基酸濃度下降，植物通過降低葉片中氨基酸水平觸發植物防御反應。當OsLHT1功能缺失后，突變體植株體內氨基酸轉運和黃酮類物質代謝紊亂，活性氧大量積累，同時水楊酸和茉莉酸介導的植物防御反應均被激活，葉片中水楊酸和茉莉酸含量增加，突變體植株表現出較強的抗病性[39]。有意思的是，Oslht1突變體葉片中水楊酸和茉莉酸含量變化趨勢是不同的。當水稻未感染稻瘟病時，Oslht1突變體葉片中水楊酸和茉莉酸含量均顯著高于野生型，而當寄主植物感染稻瘟病8 h 后，突變體葉片中水楊酸的含量仍然很高，但茉莉酸含量顯著下降，甚至低于野生型，說明OsLHT1 介導水稻抗病性是水楊酸和茉莉酸途徑的共同作用。在稻瘟病原菌入侵前，與野生型相比，Oslht1突變體葉片中的活性氧、水楊酸、茉莉酸含量均顯著提高，而當病原菌入侵時，其感染過程將被抑制，因此該突變體植株表現出較強的抗病性(圖1)[39]?；诖?，我們推測水稻OsLHT1 可能同樣影響了水稻其他的生物和非生物脅迫過程。與AAP 家族基因類似，植物LHT1 也作為抗病的負調控因子，通過影響水楊酸、茉莉酸途徑影響植物免疫反應。

2.3 陽離子氨基酸轉運蛋白家族(CATs)

擬南芥AtCAT1 是一個高親和氨基酸轉運蛋白，負責植物細胞中堿性氨基酸的運輸，同時參與植物抗病。過量表達AtCAT1導致擬南芥生物量下降，但花期提前。當擬南芥感染半活體營養型病原菌丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)后，AtCAT1基因表達上調。與野生型相比，AtCAT1過表達轉基因植株葉片中病程相關基因(PR1)表達量增加，水楊酸含量也顯著提高，說明AtCAT1 通過影響植物體內水楊酸代謝通路進而影響植物的抗病性，且AtCAT1 在植物免疫反應中是一個正調控因子[40]?？紤]到AtCAT1表達對病原菌侵染的反應較為迅速，它可能參與了植物的系統性抗性。

2.4 多種酸進出轉運蛋白家族(UMAMITs)

UMAMITs 家族屬于Nodulin-like 基因家族，早期研究認為UMAMITs 只在豆科等結瘤植物中存在，隨后有研究發現在非結瘤植物基因組中也存在該基因家族的同源基因，且多個UMAMITs 被報道具有轉運氨基酸的功能。擬南芥AtUMAMITs 作為一個氨基酸外排的轉運體，主要參與植物體內氨基酸從韌皮部到種子的運輸[65-67]。AtUMAMIT14 負責將根系韌皮部中的氨基酸外排到其他組織，在根系分泌氨基酸的過程中發揮著重要作用[67]。此外，AtUMAMIT14 是植物抗病的正調控因子，AtUMAMIT14過量表達改變了植物體內氨基酸穩態，通過影響水楊酸代謝途徑，增強了擬南芥對卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis) 的抗性[41]。WAT1基因是紫花苜蓿Nodulin21的同源基因，后被鑒定為UMAMITs 家族基因[68]。WAT1 參與植物次生細胞壁沉積過程[42-43]。由細菌或真菌特異性侵染植物的維管系統導致植物出現維管束病害，從而影響植物生長發育。常見的維管束病害主要有由Xanthomonasoryzaepv.oryzae引起的水稻白葉枯病，由Xanthomonascampestrispv.campestris引起的十字花科黑腐病、Ralstoniasolanacearum引起的青枯病，由Verticilliumdahliae引起的棉花黃萎病等。擬南芥和番茄wat1突變體植株對多種維管束病原菌均表現出較強的抗性(表1)[42-43]。

3 總結和展望

氮素營養狀況介導植物對病原體的防御機制十分復雜，受多種因素影響，如土壤氮庫的組分、土壤氮的生物有效性、植物吸收利用氮的能力、病原菌的侵染特征、以及植物-病原菌間的相互作用等。在復雜的生長環境中，植物需要整合土壤和氣候環境信息和自身氮營養狀態，在病原菌初次侵染時，能夠觸發適當的免疫反應。氨基酸是植物初級代謝中蛋白質、能量和氮代謝的核心組分，它們是植物-微生物相互作用中具有特定功能的代謝物的前體，但其參與植物抗病的生理生化過程以及分子調控網絡還有待深入解析。

本文總結了氨基酸轉運蛋白家族基因在植物免疫反應和抗病中的作用，分析了其響應和調控機制。未來研究需要重點解析：1) 哪些氨基酸是植物防御機制的關鍵營養或信號物質；2) 病原菌侵染植物后，植物體內氨基酸信號的傳導過程；3) 植物氨基酸轉運蛋白如何識別病原菌；4) 植物氨基酸轉運蛋白如何調節植物和病原菌間的營養競爭和資源分配；5) 氨基酸轉運蛋白如何調控水楊酸/茉莉酸途徑參與植物抗??；6) 植物-微生物間基因是否存在串擾等一系列問題。此外，目前已有的研究多集中在模式植物擬南芥中，而重要農作物的研究遠遠落后于模式植物，未來需要考慮如何將研究過渡到農作物中，使理論研究和生產實踐更好地相結合。

雖然植物氨基酸轉運蛋白突變體或過表達植株具有較強的抗病能力，但是這些轉基因或基因編輯的植株矮小，生長受到抑制。在植物中，高產、優質、抗病往往是“不可能三角”，植物免疫反應中組織細胞中激素的協同或拮抗作用往往對其生長發育產生負面影響[69]。而這三者間的平衡既取決于植物內在的調控機制，也取決于外部的環境條件?；诂F有的研究結果，我們可以推斷氨基酸是偶聯植物營養和植物免疫的關鍵物質，探索植物氨基酸運輸機制及其在植物-微生物相互作用中的調控，將是連接植物初生代謝和生物脅迫信號傳導的核心。通過解析介導植物抗病的關鍵氨基酸轉運蛋白，挖掘優良的等位基因，利用基因編輯定向改良植物，或者通過分子設計育種，定向聚合控制產量、品質和抗病的優異單倍型，以期最大程度避免“不可能三角”的負面影響，可以為培育兼顧高產、優質和抗病的理想品種提供理論指導。