恒溫和變溫模式下不同施肥黃壤有機碳礦化特征及其影響因素

朱鑫宇，盧 韋，李 渝，肖 瓊，王 妍，鄔 磊*，張文菊

（1 青島農業大學資源與環境學院，山東青島 266000；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所 /北方干旱半干旱耕地高效利用全國重點實驗室 / 農業農村部耕地質量監測與評價重點實驗室，北京 100081；3 農業農村部貴州耕地保育與農業環境科學觀測實驗站，貴州貴陽 550006）

土壤有機碳 (SOC) 庫是陸地生態系統中最大的碳庫[1]，也是全球碳循環的重要組成部分，與土壤肥力和全球氣候變化密切相關[2-3]。SOC 礦化與土壤養分元素釋放和溫室氣體排放密切相關，其CO2釋放速率也是反映土壤質量狀況的重要指標[2,4]。SOC 礦化受其化學結構、養分有效性、微生物活性、土壤溫度、濕度和質地等多種因素的影響。施肥是調控農田土壤肥力的主要措施，顯著影響土壤團聚體結構、SOC 含量、養分有效性和微生物活性等土壤物理化學及生物學性質，從而影響SOC 礦化過程[5]。目前國內外學者在施肥對SOC 礦化的影響方面開展了大量研究工作。苗淑杰等[6]認為，單施化肥、有機肥和有機無機肥配施均顯著提高黑土SOC 的礦化速率，李夢雅等[7]和張旭博等[8]在紅壤上的研究結果也發現了類似的規律，長期施用有機肥或者有機無機肥配施通過提高微生物的活性促進 SOC 礦化，釋放的CO2量較施用化肥處理明顯提高。

溫度也是影響SOC 礦化的重要環境因素之一[9]。通常認為，SOC 礦化速率隨溫度升高而提高[10-11]。也有研究表明在較低的溫度范圍內，溫度升高顯著促進SOC 礦化，在較高的溫度范圍內，溫度升高對SOC 礦化的促進作用有限[12]。在農田、草地和森林等生態系統中，溫度隨著晝夜更替周期性變化。然而，目前大部分研究主要是基于恒溫室內培養實驗分析溫度對SOC 礦化的影響，關于溫度周期性變化如何影響SOC 礦化特征存在很大的不確定性[10]。部分研究結果表明，恒溫和變溫模式對不同施肥土壤SOC 礦化的影響程度不同[13]。有研究發現，在恒溫模式下不施肥與有機無機肥配施處理的SOC 累積礦化量無顯著差異，但是變溫模式下不施肥處理SOC 累積礦化量顯著高于有機無機肥配施處理[14]。因此，比較分析長期施肥下SOC 礦化對恒溫和周期性變溫的響應，對于深入理解農田土壤碳周轉和肥力提升具有重要意義。

本研究通過采集貴州省農業科學院內旱作黃壤長期定位施肥試驗的不同施肥處理土壤樣品，采用室內控制實驗研究不同長期施肥處理SOC 礦化對溫度模式(恒溫vs 變溫)的響應及其主要控制因素，以期為深入理解農田SOC 礦化特征和優化農田碳管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品采集

供試土壤樣品采自貴州省貴陽市花溪區貴州省農業科學院內的長期定位施肥試驗田 (106°07′E，26°11′N)。試驗地隸屬貴州省農業科學院土壤肥料研究所，年均溫15.3℃，年平均日照時數1354 h，全年無霜期270 天，年降雨量1100～1200 mm。試驗地1995 年建成，土壤類型為旱地黃壤，成土母質為三疊系灰巖和砂頁巖殘積物，種植模式為單季玉米。玉米于4 月中旬播種，8 月中下旬收獲，玉米秸稈及根茬直接還田，其余時間休閑。本研究依托長期定位試驗，采集4 個施肥處理的耕層土壤樣品：不施肥 (CK)、單施化肥 (NPK)、單施有機肥 (M)和有機無機肥配施 (NPKM)。NPK 處理為施用常量化肥氮磷鉀，M 處理為施用常量有機肥，NPKM 為施用常量有機肥+常量氮磷鉀。供試化肥主要為尿素(含N 46%)、過磷酸鈣(P2O516%)、氯化鉀(K2O 60%)，每年施用量為N 165 kg/hm2、P2O582.5 kg/hm2、K2O 82.5 kg/hm2。有機肥為新鮮牛糞(含水量67.0%，C 10.4%、N 2.70 g/kg、P2O51.30 g/kg、K2O 6.00 g/kg)，施用量為30.5 t/hm2。肥料全部在玉米季施用，播種前磷鉀肥或有機肥作基肥一次性施入，氮肥在玉米生長季作為基肥施用量N 89.0 kg/hm2，玉米苗期追施N 32.0 kg/hm2，喇叭口期追施N 44.0 kg/hm2。試驗初始土壤基本理化性質為：有機碳25.75 g/kg，全氮2.03 g/kg，堿解氮167.1 mg/kg，全磷2.39 g/kg，有效磷17.0 mg/kg，全鉀 15.8 g/kg，速效鉀 110 mg/kg。2017 年8 月下旬玉米收獲后，在樣地內沿“S”形多點采集耕層 (0—20 cm)土壤樣品并均勻混合，去除土壤樣品中的根系及可見有機物殘體，于室內自然風干后，過8 mm 篩，用于土壤理化指標測定及礦化培養試驗。

1.2 試驗方法

稱取30.0 g 各施肥處理的風干土壤樣品于500 mL玻璃培養瓶中，調節土壤含水率至60% 田間持水量，放入15℃的避光培養箱中進行7 天預培養。預培養結束后，在每個培養瓶內放入一個盛有10 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液的小型玻璃杯，用于吸收SOC礦化釋放的CO2，然后快速加蓋密封。設置2 種培養溫度模式：恒溫15℃培養 (CT) 和周期性變溫 (VT，按照10℃→15℃→20℃→15℃→10℃的順序勻速變溫，每6 h 變化5℃，24 h 為一個循環周期) 培養。將裝有土壤樣品和NaOH 溶液的玻璃培養瓶分別放入溫度設置不同 (CT、VT) 的培養箱中進行避光培養。每個施肥處理下設置4 個重復，每個培養溫度下設2 組空白對照(僅裝有NaOH 溶液的玻璃培養瓶)，在培養的第1、2、3、4、8、16、24 和32 天更換新的堿液玻璃杯。吸收CO2的堿液玻璃杯快速密封，然后用去離子水稀釋5 倍，用封口膜封住瓶口，上總有機碳(TOC)自動分析儀 (Phoenix 8000) 測定，根據TOC 儀器的測定值計算出CO2的釋放量。整個培養過程中保證土壤含水量維持在60%田間持水量。

土壤有機碳礦化速率計算公式[15]為:

式中：CO2-C 為培養期間SOC 礦化速率[C mg/(kg·d)]；V0 為空白標定時消耗的標準鹽酸的體積(mL) ；V為樣品滴定時消耗的標準鹽酸的體積 (mL) ；CHCl為樣品滴定時消耗的標準鹽酸的濃度 (mol/L) ；m為干土重 (g) ；t為更換堿液時間間隔。

變溫相對于恒溫模式下CO2累積排放量的變化率：

式中：ΔC 為變溫相對于恒溫模式下CO2累積排放量的變化率 (%)，下文中用ΔCO2表示；CVT、CCT分別為變溫和恒溫培養下CO2累積排放量 (C mg/kg)。

1.3 測定指標與方法

土壤pH 采用pH 計測定，水土質量比為2.5∶1；土壤有機碳 (SOC) 采用重鉻酸鉀氧化法測定；全氮(TN) 采用半微量凱氏定氮法測定；全磷 (TP) 采用堿熔—鉬銻抗比色法測定；有效磷 (AP) 采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法測定；采用濕篩法將采集的土壤樣品分為大團聚體(250～2000 μm)、微團聚體(53～250 μm)和粉粘粒(＜53 μm)組分；土壤微生物生物量碳氮 (MBC 和MBN) 采用氯仿熏蒸—硫酸鉀浸提法測定[16]；易氧化有機碳 (EOC) 采用高錳酸鉀浸提—分光光度計法測定[17]；β 葡萄糖苷酶(βglucosidase, BG)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)、氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)、亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase.LAP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, AP)采用96 孔深孔板法測定[18]，利用4-甲基傘型酮-β-D-葡萄糖苷酶 (4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside) 做BG 底物，纖維二糖苷(4-methylumbelliferyl β-Dcellobioside)做CBH 底物，4-甲基傘型酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-Dglucosaminide)做NAG 底物，L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽(L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride)做LAP 底物，4-甲基傘型酮磷酸鹽(4-methylumbelliferyl phosphate)做AP 底物，操作步驟如下：測定土壤pH，用于調節緩沖液pH，稱取1.00 g 鮮土加入125 mL 50.0 mmol/L 的醋酸鈉緩沖溶液, 在樣品孔中加入200 μL 土壤懸液和50.0 μL的相應底物, 在標準物質孔中加入50.0 μL 濃度為10.0 μmol/L 的標準物質和200 μL 的醋酸鈉緩沖液，每個樣品6 個重復。在黑暗避光條件下, 放置在相應培養溫度的恒溫培養箱中，孔板放入25℃黑暗條件下培養4 h，為了終止反應，在每個孔中加入10 μL 1 mol/L 的NaOH 溶液，反應1 min 后使用酶標儀測定熒光值。利用多功能酶標儀 (Synergy H4, Bio Tek)在365 nm 處進行熒光激發，450 nm 處熒光檢測。

土壤酶活性[A, nmol/(g·h)] 計算公式為:

式中：F為樣品凈熒光值，即樣品孔熒光值減去空白板的熒光值；V為醋酸鈉緩沖液的體積 (mL)，即250 mL；E為標準物質的熒光值；N為微孔板中標準物質的量(nmol)，即0.50 nmol；Vb為每個微孔板土壤懸浮液的體積 (mL)，即0.20 mL。

平均重量直徑(MWD)計算公式為[19]

1.4 數據處理

對數據進行正態性檢驗，采用Origin 繪圖，采用SPSS 25.0 進行雙因素方差分析 (P＜0.05)，并用LSD 多重比較檢驗方法進行均值比較。

2 結果與分析

2.1 施肥對土壤物理化學及生物學性質的影響

表1 顯示，長期施用有機肥(M 和NPKM 處理)相較于CK 和NPK 處理顯著提高了土壤pH。與CK處理相比，NPK 處理的SOC 含量顯著降低了3.4 g/kg，M 處理和NPKM 處理的SOC 含量分別顯著提高了38.9%和32.0%。NPKM 處理的全氮含量和全磷含量分別顯著提高32.0%和96.0%，對于EOC 含量, 長期施用有機肥(M 和NPKM 處理)顯著高于CK 和NPK處理，NPK 處理相對于CK 處理顯著提高了49.2%。與NPK 處理相比，NPKM 處理顯著降低了＜0.053 mm團聚體含量，增加了0.053～0.25 mm 團聚體含量，不施肥處理(CK) 和長期施用有機肥(M 和NPKM處理)顯著提高了土壤平均重量直徑20.2%～26.6%。

表1 土壤基本理化性狀Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

從圖1 可以看出，CK 與NPK 處理MBC、MBN和qSMBC 含量無顯著差異，M 和NPKM 處理的MBC 和MBN 含量均顯著高于CK 和NPK 處理，分別提高了1.62～2.32 和2.04～3.17 倍，NPKM 的MBN 含量也顯著高于M 處理。相對于CK 和NPK處理的qSMBC 含量，M 處理提高不顯著，NPK 處理提高顯著。相對于CK、NPK 和M 處理，NPKM處理的BG、CBH、NAG、LAP 和AP 活性分別顯著提高了319%～712%、423%～2061%、224%～598%、330%～523%和401%～549%，CK、NPK和M 處理間的CBH、NAG、LAP 和AP 活性無明顯差異。

圖1 不同施肥處理土壤生物學性質Fig.1 Soil biological properties as affected by fertilization modes

2.2 施肥和溫度模式對土壤有機碳礦化的影響

在32 天培養期間，各處理在恒溫和變溫模式下的土壤有機碳礦化速率呈現相同的變化規律，在培養0—10 天快速下降，之后趨于平穩(圖2)。CK 和NPK 處理變溫培養條件下SOC 礦化速率始終高于恒溫培養(圖2)。有機肥處理 (M 和NPKM) 恒溫和變溫條件下SOC 礦化速率沒有顯著差異。施肥和溫度均對CO2累積排放量產生顯著影響，但二者不存在交互作用(圖3)。恒溫培養條件下，CK、NPK、M和NPKM 處理SOC 累積礦化量分別為 201、175、262 和228 mg/kg，相較于CK 的SOC 累積礦化量，M 和NPKM 處理顯著增加了30.6% 和13.3%，而NPK 處理顯著降低了12.7%。變溫培養條件下，M 處理SOC 累積礦化量較CK 顯著增加了30.0%，NPK 和NPKM 處理間以及與CK 相比均無顯著差異(圖3)。與恒溫培養相比，變溫培養下CK 和NPK 處理SOC 累積礦化量分別增加16.2% 和25.6%，而M 和NPKM 處理在恒溫和變溫培養下的CO2累積排放量差異不顯著 (圖3)。

圖2 不同施肥處理土壤有機碳礦化速率Fig.2 Soil organic carbon mineralization rates under different fertilization modes

圖3 不同施肥處理的土壤有機碳累積礦化量Fig.3 Cumulative soil organic carbon mineralization under different fertilization modes

2.3 土壤有機碳礦化的影響因素分析

相關分析結果(圖4)表明，恒溫培養下土壤CO2累積排放量與化學性質(土壤有機碳、全氮、速效氮、速效磷、C : N、易氧化態有機碳)和微生物性質(MBC、MBN、qSMBC) 存在顯著的正相關，在變溫培養條件下，CO2累積排放量與土壤化學性質顯著正相關。變溫相對于恒溫模式下CO2累積排放量的變化率(ΔCO2)與土壤微生物性質和酶 (BG、CBH、NAG、LAP 和AP) 活性顯著負相關。

圖4 恒溫和變溫模式下CO2 累積排放量及其變化率與土壤化學性狀、生物學性狀間的相關性Fig.4 Correlation between cumulative CO2 emission and soil chemical and biological properties under constant and variable temperature conditions

恒溫和變溫培養下的CO2累積排放量均與土壤pH、有機碳、全氮和C : N 呈現顯著線性正相關關系(圖5)，恒溫培養的CO2累積排放量也與MBC、MBN 顯著正相關。ΔCO2與MBC、MBN、qSMBC、BG、CBH、NAG、LAP 和AP 呈顯著負相關關系(圖6)。

圖5 恒溫和變溫模式下CO2 累積排放與主要土壤化學及生物學性質的關系Fig.5 Relationship between cumulative CO2 emissions and main soil chemical and biological properties under constant and variable temperature conditions

圖6 CO2 累積排放量變化率(ΔCO2)與土壤生物學性質的關系Fig.6 Relationship between the change rate of cumulative CO2 emission (ΔCO2) and soil biological properties

3 討論

3.1 施肥對土壤有機碳礦化的影響

土壤有機碳礦化是陸地生態系統碳循環的重要組成部分，施肥作為主要的農田管理措施，其通過改變土壤物理化學及生物學性質來影響土壤有機碳礦化過程[20]。本研究結果表明，與不施肥處理相比，長期施用化肥 (NPK)使SOC 含量降低了15.0%，這與吳萌等[21]和苗淑杰等[6]研究結果相反，但與郭振等[22]、喬云發等[23]和李渝等[24]的研究結果相一致，這可能是因為長期施用化肥不利于土壤大團聚體的形成，使得團聚體對有機碳的物理保護能力降低[6]。本研究也發現NPK 處理的團聚體平均重量直徑顯著低于CK 處理(表1)，證實了長期施用化肥降低了土壤團聚體穩定性。NPK 處理EOC 含量較高，進一步證實了該部分碳不穩定，容易礦化損失，使得該處理有機碳含量降低[25]。本研究中，長期施用有機肥處理的SOC 礦化速率和累積礦化量顯著高于CK 和NPK處理，這與郭振等[22]、劉金煒等[14]研究結果一致。一方面，施用有機肥增加了SOC 含量和氮磷等養分有效性，為土壤微生物呼吸提供了充足的底物和營養物質[22,26]；另一方面，有機肥的施用提高了土壤pH(7.04～7.25)，緩解了土壤酸化，促進了微生物活性和生長繁殖[27]。且施加有機肥處理的MBC、MBN 含量顯著高于不施有機肥處理，這與恒溫短期培養下MBC、MBN 含量增加CO2累計礦化量隨之增加的結果一致。李英臣等[28]研究了不同氮施入水平對濕地草甸沼澤SOC 礦化的影響，發現隨培養時間的增加，有效碳源成為微生物活動的限制因素，土壤微生物活性降低，從而降低了SOC 的礦化速率，減少了SOC的累積礦化量。這與本試驗中隨著C/N 的增加CO2累積排放量隨之增加的結果相一致。于冰等[29]基于祁陽紅壤的研究發現，SOC 礦化與細菌和真菌種群豐度和多樣性顯著正相關，且土壤胞外酶活性與細菌豐度和真菌多樣性也顯著正相關，不同施肥處理間微生物種群多樣性差異也可能是造成此結果的原因。

3.2 溫度模式對土壤有機碳礦化的影響

在本研究整個培養時期(短期)內，變溫模式與恒溫模式的積溫相同，CK 和NPK 處理在變溫培養下SOC 累積礦化量顯著高于恒溫模式 (P＜0.01)，說明溫度模式是影響SOC 礦化過程的重要因素。本研究結果也表明，在恒溫模式下研究SOC 礦化特征可能會低估自然條件下的SOC 礦化潛勢。因此，闡明不同溫度模式對SOC 礦化的影響，對準確評估自然條件下SOC 周轉過程具有重要意義。M 和NPKM處理在恒溫和變溫模式下的SOC 累積礦化量無顯著差異，說明施用有機肥有助于調控溫度周期性變化對SOC 礦化的影響。也有研究表明溫度模式的變化顯著影響SOC 礦化[30-31]，本試驗中CO2在兩種溫度模式下變化率與土壤中MBC 含量呈負相關關系，即隨著MBC 含量的增加，ΔCO2逐漸降低，究其原因可能是，施用有機肥增加了土壤中可供微生物利用的碳源和營養元素，提高了土壤中MBC 含量和MBN 含量[7]，促進了微生物的生長繁殖，且M 和NPKM 處理土壤中可用于礦化的活性有機碳的含量較多，其土壤微生物分解SOC 的速率要高于其他處理，使得溫度對施用有機肥處理的碳礦化的影響較小。同時兩種溫度模式下由于微生物群落結構可能存在不同或微生物的活性有一定的差異，pH 在微生物的生長繁殖中起到了調節作用，施用有機肥處理的pH 顯著提高，趨于中性，同時最適溫度與恒定溫度相同的微生物會被選擇出來，形成恒定溫度下特定具有優勢的群落結構[31]，相比之下，變溫模式中，因為日溫度變化范圍內存在許多種群的最適溫度，因此可能會形成多樣化的微生物群落共存[32]，從而導致變溫模式下物種的多樣化群落。施用有機肥處理的微生物群落適應性強，能夠抵御溫度周期性變化的干擾，降低了溫度變化對有機碳礦化的影響，在本研究中，不同土壤化學性質與恒溫和變溫模式下CO2累積排放量顯著相關，這可能由于溫度變化使土壤的一些性質(比如微生物、pH、土壤結構等)發生改變[14,33]，從而使土壤中的有機碳更易被分解，但施有機肥處理在增加SOC 含量的同時也促進團聚體結構的形成，而顆粒有機碳受到團聚體的包裹作用從而避免被微生物降解[34]，兩因素共同作用下，導致施有機肥處理降低了溫度變化對SOC 礦化的影響。

4 結論

有機碳累積礦化量在恒溫和變溫條件下，均與土壤pH、有機碳和全氮含量正相關，只在恒溫條件下與微生物生物量碳氮含量呈正相關。長期單施有機肥以及有機無機肥配施提高了黃壤pH 和SOC 含量，同時也提高了微生物生物量和酶活性，土壤SOC 累積礦化量在恒溫或者變溫條件下無顯著差異，但均顯著高于單施化肥土壤。長期不施肥或者單施化肥土壤在變溫條件下的有機碳累積礦化量顯著高于恒溫條件下，說明施用有機肥緩解了溫度周期性變化對SOC 礦化的促進作用。