小反芻獸疫及其診斷與防治的研究進展

王永剛，于恒智，程 瑋，孫芳芳，李曉佳，陶 青，孫 妍

（ 1. 中華人民共和國沈陽海關，遼寧 沈陽 110623 ； 2. 遼寧省農業經濟學校，遼寧 錦州 121007 ）

小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒引起的以腹瀉、口炎、發熱和肺炎為特征的一類傳染病，山羊發病比較嚴重，病死率可超過90%。小反芻獸疫的潛伏期為2～7 d，動物感染后還會出現大腸埃希氏菌、支原體等的混合感染[1]。截至目前，全世界有70 多個國家和地區發生過小反芻獸疫[1]。世界動物衛生組織規定小反芻獸疫為必須上報的動物疫病，我國將其列為一類傳染病。高死亡率和高發病的發病特點給小反芻獸疫的診斷及治療帶來巨大挑戰，根除小反芻獸疫已成為世界各國的共同目標。2015年，聯合國糧食及農業組織和世界動物衛生組織聯合發布了《小反芻獸疫全球控制和根除戰略》，旨在于2030年前在世界范圍內消滅小反芻獸疫[2]。本文綜述了小反芻獸疫病毒的病原學特征、流行病學、臨床癥狀，總結近年來小反芻獸疫的診斷及防治方法的研究進展，以期為相關疾病在臨床中的診斷治療提供參考。

1 小反芻獸疫病毒的病原學特征

小反芻獸疫病毒是副黏病毒科、麻疹病毒屬病毒，此毒屬還包括犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、海象瘟病毒。小反芻獸疫病毒基因組為單股負鏈無節段RNA，長15 948 bp。

1.1 小反芻獸疫病毒基因組結構

小反芻獸疫病毒編碼6個結構蛋白和2個非結構蛋白以及1個血清型、4個基因譜系。兩個非結構蛋白為C蛋白和V 蛋白（由P基因編碼）；6 個結構蛋白為磷蛋白（P 蛋白）、大蛋白（L蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）、融合蛋白（F蛋白）、血凝素蛋白（H蛋白）和基質蛋白（M蛋白）。4個基因譜系中的Ⅲ型流行于西亞、西非地區，Ⅰ型和Ⅱ型主要流行于西非部分地區，Ⅳ型流行于中東地區[3]。

1.2 小反芻獸疫病毒編碼蛋白功能

V 蛋白和C蛋白在結構功能上類似，與病毒逃避宿主免疫相關；H 蛋白和F 蛋白在小反芻獸疫病毒侵染的過程中起到黏附和侵入靶細胞的作用；L 蛋白和P 蛋白一起完成病毒的復制、轉錄、mRNA 帽子結構的功能；此外，M 蛋白是維持病毒顆粒穩定的蛋白，起到連接N蛋白與表面糖蛋白的作用；C 蛋白調控病毒RNA 合成，能夠使成熟病毒顆粒順利出芽。N 蛋白是分型蛋白[3]。C蛋白和V 蛋白比較保守，與病毒在宿主體內的復制和致病性具有一定關系[4]。Enchery 等[5]發現，不同小反芻獸疫病毒毒株之間存在一定的交叉保護。

1.3 小反芻獸疫病毒復制過程

小反芻獸疫病毒首先通過H 蛋白和N 蛋白與細胞表面受體結合，引起F 蛋白構象發生改變并釋放融合肽，使病毒包膜與細胞膜發生融合，之后釋放螺旋化的核衣殼到胞質中，從而開始病毒轉錄[6]。

2 小反芻獸疫的流行病學特征

2.1 傳染源

小反芻獸疫潛伏期通常為4～6 d，《陸生動物衛生法典》表述潛伏期最長為21 d，傳染源多為隱性感染動物或患病動物。

2.2 傳播方式

小反芻獸疫多通過與病羊直接接觸傳播，此外，接觸傳播（消化道和呼吸道）與被病毒污染的飼料飲水等發生間接接觸也會造成該病傳播。

2.3 流行情況

小反芻獸疫最早發現于西非，是WOAH 提供官方認證的7 種疫病之一[7]。目前，WOAH 認證的小反芻獸疫無疫國為57個，無疫區域1個。我國小反芻獸疫疫情流行分3個階段：2007—2010年，小反芻獸疫疫情傳播到我國西藏自治區；2013—2015年，新疆首次發現該疫病，隨后全國開始流行，涉及23 個省、自治區、直轄市[8]；2016 年至今呈散發狀態。2016—2022 年間，我國發生32 起小反芻獸疫疫病，大部分發生在新疆維吾爾自治區[9]。

3 小反芻獸疫的臨床癥狀

山羊的臨床癥狀比較典型，綿羊一般較輕。感染動物的臨床癥狀與牛瘟病牛類似。小反芻獸疫根據癥狀可分為溫和型、標準型和急性型。最明顯的病理變化為結膜炎和壞死性的口炎；皺胃病變較為明顯，表現為糜爛，有出血斑點；大腸，尤其是結腸直腸交界處會出現斑馬條紋或特征性出血，還可見脾臟腫大和腸系膜淋巴結水腫。

4 小反芻獸疫診斷方法的研究進展

小反芻獸疫是目前制約養羊業發展的主要因素之一。生產實際中，快速診斷對于該病的防控至關重要。小反芻獸疫實驗室常規檢測方法包括病毒中和試驗（VNT）[10]、瓊脂凝膠擴散試驗（AGID）[11]和對流免疫電泳試驗（CIE）、免疫熒光抗體檢測試驗（FAT）[12]、重組酶聚合酶擴增（RTRPA）、逆轉錄環介導等溫擴增（RT-LAMP）[13]、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）[14]、聚合酶鏈反應（PCR）[15]、化學發光免疫分析法（CLIA）[16]、膠體金免疫層析技術（GICA）和量子點免疫層析法（QD-LFMA）[17]。

4.1 VNT

VNT 是WOAH 建議的抗體檢測金標準，原理是使用已知病毒檢測待檢血清的中和抗體，此方法敏感性高、特異性強，但費時費力，不適合大規模檢測[18]。但許多新的檢測方法需要與之進行比較[19]。

4.2 AGID和CIE

AGID 和CIE 均為檢測病毒抗原的方法。AGID 是一種廉價、簡便、適用于野外或在實驗室內進行的小反芻獸疫病毒檢測技術，可檢查肛門排泄物、眼鼻口分泌物和病變組織，但存在時間長、靈敏度低等問題。CIE是檢測病毒抗原最快速的方法。與免疫層析法、ELISA 法、核酸法相比，CIE 和AGID 法的靈敏度較低。因此，CIE 和AGID 不是小反芻獸疫病毒感染早期快速檢測的最佳方法[9]。

4.3 FAT

該方法操作簡單快捷，但需要熒光顯微鏡觀察結果[9]。先用熒光物質在已知的抗原或抗體上做標記，利用抗原抗體反應原理，檢查組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織或細胞。

4.4 RPA

目前已建立了多種小反芻獸疫病毒的RPA檢測方法。如李園麗[20]創建以P 基因作為檢測對象，檢測低限為0.326 TCID50/mL 或14.98 拷貝數的小反芻獸疫病毒實時RT-RPA。Yang 等[21]開發的LFS RT-RPA 檢測方法能夠檢測小反芻獸疫病毒N基因。但RPA 臨床和現場測試尚不夠成熟[9]，仍有待進一步開發和研究。

4.5 RT-LAMP

RT-LAMP是能夠在恒溫條件下進行快速擴增核酸序列的技術，對小反芻獸疫病毒的M基因和N基因在原有的基礎上增加了逆轉錄酶以達到直接擴增的目的。范晴等[22]建立一種可視化多重熒光RT-LAMP方法用于檢測小反芻獸疫病毒和藍舌病病毒，該方法對小反芻獸疫病毒和藍舌病病毒高度特異，與口蹄疫病毒、鹿流行性出血熱病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反芻動物病毒均無交叉反應，檢測靈敏度為200 copies/μL，干擾性小，可同時檢測兩個不同濃度的模板。張忠湛[23]設計了一種用于檢測小反芻獸疫病毒的LAMP 反應體系并進行了優化，在62 ℃40 min 內即可完成擴增反應，可檢測到1.6 個TCID50小反芻獸疫病毒。LAMP 對PCR 的敏感性是常規RT-PCR 的10 倍以上，其敏感性與熒光RT-PCR 相當[21]，但該試驗引物設計復雜，穩定性不足，易出現假陽性[8]。

4.6 ELISA

小反芻獸疫病毒中最具抗原性的是核衣殼蛋白，常用于抗原檢測。Libeau 等[24]建立了基于小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的免疫捕獲ELISA，可以快速精確地鑒別小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒（RPV）兩種病原體。夾心ELISA也常用于進行病毒抗原檢測，靈敏度比Vero細胞分離病毒法高。孫潔等[25]制備了針對小反芻獸疫病毒全病毒特異性卵黃抗體，利用PPRV N 蛋白特異性單克隆抗體和PPRV IgY 為主要材料，建立了PPRV 雙夾心ELISA 檢測方法檢測小反芻獸疫病毒。該方法可以特異性檢出小反芻獸疫病毒而與其他病毒間無交叉?；谛》雌c獸疫病毒M、N 蛋白單克隆抗體的dot-ELISA 也常用于田間檢測，與夾心ELISA 相比，該法的特異性和靈敏性分別為91.0%和82.5%。

4.7 PCR

PCR 也是一種病毒核酸檢測方法。師亞玲等[26]建立快速特異的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，與藍舌病、口蹄疫、山羊痘、羊口瘡等常見牛羊病毒均無交叉反應，具有良好的特異性、較高的敏感性和穩定性，可用于小反芻獸疫的初步篩查。Balamurugan等[27]設計了針對高度保守基因-N、M 兩種基因的多重RT-PCR，該方法能夠快速鑒別 RPV 和小反芻獸疫病毒兩種病原體，避免了假陽性的結果。使用RT-PCR-ELISA 方法檢測小反芻獸疫病毒N 基因靈敏性更高，比常規的瓊脂糖電泳分析的RT-PCR方法高10 000倍。結果表明，這種方法在病毒濃度非常低的情況下也能準確地檢測出病毒，大大提高了檢測的靈敏度，可在早期發現病毒，從而為疾病的預防和治療提供寶貴的時間。此外，該方法還具有較高的穩定性，可廣泛應用于不同實驗室和地區；但該方法容易污染，過程復雜，不適于小反芻獸疫病毒的高通量檢測?？傊?，基于小反芻獸疫病毒N 基因的RT-PCR-ELISA 檢測方法是一種高效、特異、靈敏的病毒檢測技術，適用于小反芻獸疫病毒早期和晚期的檢測，可鑒別RPV和小反芻獸疫病毒兩種病原體，將有助于更好地防控小反芻獸疫病毒，保護畜牧業的發展和公共衛生安全。實時熒光RT-PCR 具有更高的靈敏度，如Batten 等[28]創建的基于N基因的實時熒光RT-PCR 可測出4 個譜系中的小反芻獸疫病毒株，其檢測位點為N基因的N末端。

4.8 CLIA

CLIA是一種結合化學發光反應與免疫反應的免疫分析方法，具有靈敏度高、操作簡便、分析簡單、快速等特點，廣泛應用于傳染病的診斷。但這種方法對測試人員和儀器設備的要求均較高，不能廣泛地應用于實際生產中[16]。

4.9 GICA和QD-LFMA

免疫層析是在免疫滲濾試驗基礎上建立的新型免疫分析法，為一種抗原檢測方法。小反芻獸疫病毒檢測中常見的是量子點及金標免疫層析技術。Chen 等[29]開發了可視化-化學發光雙讀的膠體金流動免疫層析，并在膠體金表面分別對其進行雙重標記，從而達到雙讀和放大的目的。Cheng 等[17]利用量子點作為標志物，構建了一種新型的基于量子點的免疫層析檢測新方法，該方法具有光譜范圍廣、熒光獨特、熒光強等優點，其檢測靈敏度較傳統膠體金免疫色譜法高了一個數量級，可以滿足大樣本人群的檢測需求，但是試劑價格偏高。

5 小反芻獸疫疫苗防控的研究進展

小反芻獸疫尚無有效的治療方法，防控方法主要為疫苗免疫。我國已將小反芻獸疫納入《2020年國家動物疫病強制免疫計劃》，提出在全國范圍內推廣小反芻獸疫疫苗。小反芻獸疫病毒屬麻疹病毒，小反芻獸疫病毒的疫苗的策略與其他麻疹病毒相同，可簡單地分為3類。

5.1 傳統疫苗

傳統疫苗包括小反芻獸疫病毒弱毒疫苗、牛瘟弱毒疫苗和小反芻獸疫病毒滅活疫苗，是應用最廣泛的疫苗，但無法將接種疫苗的動物與自然感染的動物區分開。接種牛瘟弱毒疫苗可獲得良好的免疫保護作用。小反芻獸疫病毒弱毒疫苗可對不同群株進行交叉免疫，且無不良反應，但耐熱性能較差。而小反芻獸疫滅活疫苗需要進行第二次免疫。

5.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗包括重組亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗和反向遺傳學技術重組苗。

5.2.1 重組亞單位疫苗

以致病蛋白為基礎構建的亞單位疫苗具有更高的安全性和更高的免疫保護能力，有望成為防治小反芻獸疫的理想疫苗[30]。目前，H 蛋白已被證明是最重要的免疫抗原[31]，以病毒為載體，研制出了一種能夠有效預防綿羊感染小反芻獸疫的新型DIVA 疫苗，但該疫苗不能長期產生高水平抗體，有效保護周期存在一定的缺陷。

5.2.2 活載體疫苗

活載體疫苗包括痘載體疫苗和腺病毒載體疫苗。痘病毒基因組容量大，可載入大片段的外源基因，被用于構建基因載體病毒疫苗。痘病毒載體疫苗沒有激活最佳的抗體反應，疫苗接種員存在安全風險。腺病毒載體疫苗能夠誘導T 細胞產生強烈免疫反應，常用的為人5 型腺病毒[32]。重組腺病毒載體疫苗是一種高免疫原性的疫苗，可以引起獲得性和先天的免疫反應，經常被用于區分接種后的動物和天然的動物[33]。

5.2.3 反向遺傳學技術重組苗

利用反向遺傳學技術，通過對病毒RNA 的結構進行改造，剔除抗原組分和增加標志基因，從而實現對小反芻獸疫病毒基因組的調控，為研制新型疫苗奠定基礎[34]。利用反向遺傳學方法構建的重組苗，其致病力退化的可能性較低，且不具有DIVA的功能，因而具有較高的安全性。采用反向遺傳技術進行疫苗研制存在的問題是，若將標記蛋白與病毒囊膜結合，也許會改變宿主嗜性和致病力[33]。

5.3 多聯苗

由于小反芻獸疫可與其他病毒發生并發感染，如口蹄疫病毒[35]、藍舌病病毒[36]和山羊痘病毒[37]等，因此可使用多聯苗誘導中和反應對抗多種小反芻動物疫病。多價苗的使用使疫苗接種更加便利，并且明顯降低了疫苗成本，但免疫效果較差。

6 結論

小反芻獸疫作為一種危害比較嚴重的傳染性動物疫病，已在非洲、歐洲及亞洲等70多個國家和地區發生，是目前制約養羊業發展的主要因素之一，給各國畜牧業發展均造成了一定的影響。在生產實踐中，高效的疫苗免疫和快速、準確、特異和靈敏的檢測技術可提高疾病的防治效果，控制小反芻獸疫的流行。世界動物衛生組織和聯合國糧食及農業組織聯合制定并實施了小反芻獸疫全球控制和根除策略，相信隨著科學技術不斷進步，小反芻獸疫的防控也將取得新進展。