胰島素-葡萄糖信號通路調控哺乳動物卵泡發育的機制

王若桐，劉春潔

（ 塔里木大學動物科學與技術學院 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ）

大量研究證實，葡萄糖存在于人類[1]、獼猴[2]、水牛[3]、綿羊[4]、牛[5]、豬[6]、駱駝[7]和馬[8]的卵泡液中，主要作為顆粒細胞生長所需的能量。葡萄糖在卵泡液中的含量低于血清，不同種動物的卵泡液、血清中葡萄糖的含量也各不相同。有研究發現，直徑大的卵泡中葡萄糖含量顯著高于直徑小的卵泡，且排卵前卵泡中葡萄糖的含量達到最高[4,9-10]，表明在同一生理條件下，不同卵泡在不同發育階段所需能量也存在差異。胰島素與胰島素受體（IR）的結合導致一系列細胞內信號傳導事件，可調節多種生物過程，如葡萄糖和脂質代謝、基因表達、蛋白質合成以及細胞生長、分裂和存活。

卵泡液是卵母細胞賴以生長成熟的微環境，其中的胰島素樣生長因子（IGF）對卵母細胞的發育、成熟、排出以及受精后胚胎的形成具有重要的影響。葡萄糖受到胰島素信號、腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）和己糖胺途徑等胞內多重機制感應，是機體代謝最基本的能量底物。己糖胺合成途徑被認為是能量狀態的“傳感器”，用于調節相關基因表達，進而調節卵泡的發育功能[11]。本文綜述了胰島素-葡萄糖信號通路在哺乳動物卵泡發育過程中的調控機制，以期為哺乳動物繁殖領域的相關研究提供參考。

1 葡萄糖調節卵泡代謝機制

正常卵泡發育過程中所需的能量主要依靠顆粒細胞，并通過其細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白（GLUT）攝取周圍組織中的葡萄糖完成[12]。葡萄糖在哺乳動物卵母細胞中的主要代謝方式是糖酵解、戊糖磷酸化（PPP）和三羧酸循環，其在卵母細胞代謝中對體外卵母細胞成熟、受精以及后續胚胎發育潛能[13-17]均具有顯著影響。卵泡液中的乳酸含量隨著卵泡直徑和卵泡液增加而逐漸增加；葡萄糖的含量則與卵泡直徑呈負相關，一般卵泡直徑越大，葡萄糖含量越低。發育中的卵泡具有很高的糖酵解活性。有研究結果顯示，使用高濃度的葡萄糖、丙酮酸和乳酸聯合培養顆粒細胞可顯著提高其增殖能力[18]。

高濃度葡萄糖能夠抑制卵母細胞體外成熟，因此PPP或糖酵解在小鼠卵母細胞減數分裂中至關重要。但也有研究發現，奶牛、山羊和綿羊的卵泡中葡萄糖含量隨著卵泡直徑增加呈上升趨勢[19]。卵母細胞無法直接利用糖酵解供能，而顆粒細胞從原始卵泡開始即表現出較強的糖酵解活性[20]。此外，顆粒細胞中磷酸果糖激酶（PFK）及乳酸脫氫酶（LDH）的表達顯著高于其在卵母細胞中的表達，并且PFK 和LDH 在竇卵泡中的表達最強，其糖酵解產生的丙酮酸和乳酸可作為卵母細胞的主要能量來源[21]。

2 胰島素調節體內外卵泡機制

IGF-1與受體結合后可促進顆粒細胞增殖和雌激素合成，并促進卵泡進一步發育。IGF-1具有增強促性腺激素促進卵泡發育的作用，可刺激雌激素合成增加以及氨基酸積蓄，同時還能夠誘使未成熟的卵母細胞自發成熟并進行良好的分裂。已有研究表明，在卵巢的顆粒細胞區，IGF-1與促卵泡生成素（FSH）可相互促進對方受體表達，從而增強相互的生物效應，為卵泡發育提供更多能量。IGF-1與促性腺激素（LH）具有協同作用，可誘導卵泡內膜細胞LH受體表達，同時促進卵泡內膜細胞增殖。IGF-1滅活可導致卵泡的生長和發育停滯，使用促性腺激素也無法使卵泡繼續發育[22]。

胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）分子量最小的是胰島素樣生長因子結合蛋白4（IGFBP-4），在所有生物體內均以糖基化和非糖基化等兩種形式存在。體外試驗結果顯示，IGFBP-4抑制了IGF-I與純化的IGF-1 R結合，作為IGF 的高效抑制劑對卵巢生理功能具有重要影響。在雄激素優勢卵泡和生長停滯卵泡的卵泡液中IGFBP-4的水平均較高[23]，但在人體內IGFBP-4能夠抑制卵巢類固醇生成。有研究指出，IGFBP-4通過抑制卵巢IGF的功能進而抑制卵泡發育；胰島素可影響卵泡在體內的發育[24]。盡管大多數體內研究數據驗證了這一結果，但體內和體外的研究結果仍存在一些差異，主要區別是：顆粒細胞可能通過刺激雌二醇（E2）產生體外胰島素，而體內胰島素卻能夠抑制卵巢內E2分泌。有研究通過幼齡大鼠卵巢的灌注試驗表明胰島素能夠促進細胞有絲分裂并且抑制E2的分泌。注射葡萄糖或生糖飲食均可提高血清中葡萄糖含量，增加卵泡數目和刺激胰島素分泌，而降低卵泡內E2的含量和細胞色素P45019a1（CYP19a1）的轉錄水平[25-27]。有研究通過建立綿羊自體移植模型發現體內灌注胰島素能夠增加外周血中葡萄糖的含量，無法促進卵泡內類固醇生成；灌注葡萄糖時，卵泡內類固醇被抑制。體內胰島素、類固醇生成需要攝取葡萄糖，并降低促分裂原活化蛋白激酶（Akt/ERK）和腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平。葡萄糖能夠刺激產后奶牛胰島素分泌，促進卵泡發育和卵巢周期恢復，但不利于胚胎存活[21,28]。此外，葡萄糖能夠刺激底物與FSH 或LH 受體結合，進而誘導孕激素（P4）和E2分泌，同時也能夠誘導類固醇的生成[29]。

在大多數體外培養的顆粒細胞和膜細胞的應答機制中，胰島素能夠刺激細胞增殖和類固醇生成。但也有研究發現，顆粒細胞中高濃度胰島素不能刺激類固醇生成，是由于高濃度胰島素刺激P4和雄激素分泌的能力高于對E2的刺激。胰島素還可直接刺激顆粒細胞增殖、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、葡萄糖轉運、游離脂肪酸積累，并能夠促進LH誘導低密度脂蛋白受體表達。胰島素通過誘導人類和動物膜細胞刺激雄激素分泌，為顆粒細胞E2合成提供底物[30-31]。在大鼠膜細胞中，胰島素不但能夠刺激細胞增殖，還可通過誘導細胞周期激酶4（CDK4）蛋白調節細胞周期。細胞周期蛋白D3 和增殖細胞核抗原（PCNA）均被雷帕霉素（mTOR）阻斷，表明激活的胰島素參與雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）信號通路的調控[32]。高濃度胰島素能夠刺激體外卵母細胞的分裂和成熟[33]，但體內長期存在高濃度胰島素會對卵母細胞發育造成負調控。此外，在一項牛的研究中證實，高胰島素血癥與卵母細胞質量受損程度相關。排卵前卵泡中胰島素的含量高于次級卵泡，由此推測卵泡中適量的胰島素能夠促進體內卵母細胞成熟，胰島素濃度過高則對卵母細胞發育具有負影響。

3 胰島素-葡萄糖信號通路調控卵泡代謝機制

3.1 Akt信號通路

目前已鑒定哺乳動物中至少存在11 個胰島素受體底物（IRS），包括胰島素受體底物Shc等。人體中檢測到額外的兩個IRS對接蛋白4和5涉及胰島素信號，但不參與激活磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）。肌肉和脂肪組織中的IRS-1是刺激葡萄糖轉運的底物，而肝臟中的IRS-1 和IRS-2 對胰島素信號轉導和葡萄糖代謝具有互補作用。細胞內IR的主要信號轉導途徑是PI3K/Akt 和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）[34]。PI3K 途徑的生物學效應可能是通過磷脂磷酸酶負調控三磷酸化的脂酰磷酸肌醇PIP3水平，去磷酸化而失活，之后活化3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1），進一步促使蛋白激酶B（Akt/PKB）發生磷酸化。綜上所述，哺乳動物胰島素通過IR或IRS誘導PI3K/Akt和MAPK轉導途徑，進而發揮其對細胞的調控作用。

Akt 包含3 種由基因單獨編碼的異構體，也是胰島素信號通路的一個關鍵分支點。激活的Akt 直接發生磷酸化，同時伴隨結節性硬化癥復合物2（TSC2）和糖原合成酶激酶-3（GSK3）失活，激活凋亡抑制因子（Bcl-2）相關死亡促進者和叉頭型轉錄因子O1（FOXO1）。John等[35]研究表明，PI3K/AKT/FOXO3信號與卵巢功能密切相關。在卵泡發育過程中，PI3K/AKT 的激活導致叉頭型轉錄因子O3（FOXO3）磷酸化和核輸出，從而觸發原始卵泡激活。在原始卵泡發育過程中，FOXO3為非磷酸化并定位于細胞核，抑制原始卵泡激活。Li等[36]研究表明，卵母細胞中的組成型活性FOXO3能夠提高小鼠卵巢的生殖能力。

哺乳動物的靶標雷帕霉素（mTOR）包括mTOR復合物-1（mTORC1）和mTOR復合物-2（mTORC2），是結構和功能均不同的蛋白復合體。FOXO1發生磷酸化后直接負調控轉錄因子的活性和上游因子TSC2，參與mTORC1合成。研究發現，mTOR 與調控mTOR 相關蛋白顯著相關，也是調控細胞生長、增殖和mRNA 轉運的關鍵因子；其次，mTOR 與雷帕霉素不敏感mTOR 伴侶還具有促進肌動蛋白細胞骨架重排、細胞存活及細胞循環進程等功能。真核起始因子4E結合蛋白質1（4E-BP1）和p70核糖體S6激酶1（S6K1）的主要功能是調控蛋白質合成，是mTORC1下游的兩個最佳靶標。Akt 對胰島素的應答機制導致FOXO1從核中移出并發生磷酸化，從而阻止其在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）作用下發生轉錄。此外，Akt 也可通過磷酸化抑制劑發揮抗細胞凋亡作用。有研究指出，抑制PI3K/Akt 通路幾乎能夠阻止哺乳動物體內所有關于胰島素的代謝活動，包括刺激葡萄糖轉運、糖原合成和脂質合成等[36]。

Das 等[37]試驗結果顯示，胰島素可間接增加促性腺激素受體或LH 受體的數量。胰島素可與FSH 協同作用，促進卵巢卵泡膜間質細胞的分化和增殖。此外，Saltiel 等[33]研究表明，胰島素也可刺激培養顆粒細胞和卵泡膜細胞的類固醇生成和細胞增殖。研究發現，胰島素可調節人類卵巢雄激素產生，提供了培養人卵泡膜細胞分泌雄激素的證據。上述研究表明，胰島素在早期卵泡的形成中起到促進卵泡生長發育的間接作用。然而，Pitetti等[38]研究表明，胰島素受體可能并非卵母細胞生長必需，因為胰島素受體缺失并不影響卵母細胞發育或正常的發情周期。

3.2 GLUT促使葡萄糖的攝取

目前已報道了哺乳動物中的13 種葡萄糖轉運體（GLUT），其中葡萄糖轉運蛋白1（GLUTs 1）和葡萄糖轉運蛋白4（GLUTs 4）在綿羊卵泡中均有表達；GLUTs 1、葡萄糖轉運蛋白3（GLUTs 3）及GLUTs 4 的mRNAs 在牛黃體期的卵泡中表達[39]；GLUTs 1、GLUTs 3 和GLUTs 4 的mRNAs 在大鼠卵巢中表達。有研究發現，GLUTs 1、GLUTs 3、葡萄糖轉運蛋白5（GLUTs 5）、葡萄糖轉運蛋白8（GLUTs 8）的mRNAs 呈結構性表達。而多囊卵巢綜合征患者的顆粒細胞中不表達葡萄糖轉運蛋白2（GLUT 2）和葡萄糖轉運蛋白7（GLUT 7）的mRNAs。GLUTs 4 的mRNAs 優先在肌肉和脂肪組織中表達，還能夠刺激胰島素誘導葡萄糖攝取的信號應答機制[40]。研究發現，胰島素衍生的信號通路也可調控GLUTs 4 轉錄水平，包括PI3K、PDK1/2和非典型蛋白激酶C（PKC）的激活，推測可能是通過卵泡內的因子（E2、IGF-1 和白細胞介素-1β、FSH 等）刺激GLUTs 的表達，進而調控卵泡發育，導致卵泡成熟和排卵[40]。也有研究發現，牛卵泡液中葡萄糖含量與顆粒細胞中GLUTs 1 和GLUTs 3 的mRNA 表達量呈顯著負相關。上述研究表明，卵泡中激素能夠誘導葡萄糖攝取。GLUTs在卵母細胞中處于非功能性狀態，卵母細胞通過卵丘細胞的空隙連接誘導GLUT轉運，促使葡萄糖攝取[40]。

次級卵母細胞轉化為成熟卵母細胞過程中涉及多個胰島素信號下游靶基因的調控，胰島素可誘導Atk 發生磷酸化，進而調控絲氨酸/蘇氨酸激酶。小鼠卵母細胞中，顆粒細胞中轉錄因子可溶性試劑盒配體（KL）調控PI3k/Akt信號途徑，由于Akt1介導在絲氨酸21中的GSK3α或在絲氨酸9 中的GSK3β，進而導致GSK3 的激活。牛卵巢中，GSK3 定位于顆粒細胞和卵母細胞胞質中，表達于整個卵泡中。GSK3 激酶位于卵母細胞中期-Ⅱ（MⅡ）與第一極體之間的區域。而使用特異性抑制劑影響GSK3β從MⅠ到MⅡ過渡調控功能，可能是由于Aurora A 激酶參與GSK3β激活[41]。

FOXO蛋白作為核轉錄因子并介導胰島素或IGF-1在其不同途徑中的關鍵功能存在的抑制作用[42]。作為對增加的胰島素或IGF-1 信號的響應，FOXO 蛋白經歷胰島素介導的磷酸化和從細胞核到細胞質的易位，導致靶基因表達抑制[41-43]。FOXO3 也是IκB 激酶的直接靶點，IκB 對FOXO3 的磷酸化可調節幾種細胞因子的依賴性途徑[44]。FOXO1 和FOXO3a 也可調控卵泡生成[45]。FOXO3a 在早期初級卵泡的卵母細胞核中表達，在原始卵泡的卵母細胞和生長卵泡中的表達呈顯著性下調[46-47]。哺乳動物中FSH-非依賴性卵泡主要介導FOXO3a，進而負調控早期卵泡活性和卵泡發育，實際是抑制原始卵泡生長和控制原始卵泡的存活率。小鼠敲除試驗已證實，FOXO3a 并非由于GSK3作用于FSH-非依賴性激素促使卵泡的生長和發育，但FOXO3a失活后卻使卵泡生殖能力迅速下降，增加閉鎖卵泡數量及原始卵泡池的損耗。小鼠卵母細胞中FOXO1 mRNA的表達量不同發揮功能不同，但在沒有足夠數量代替FOXO3a的情況下不表達[35,48]。FOXO1和FOXO3a作為胰島素激活AKT的靶基因調控哺乳動物卵泡生長或閉鎖，促使哺乳動物卵泡形態和生理發生功能性變化。

4 結論

胰島素介導葡萄糖攝取對于哺乳動物生產（奶牛、小反芻動物和豬）以及一些人類生殖醫學領域的相關研究均具有極其重要的影響。卵泡功能受胰島素和胰島素-葡萄糖系統直接或間接調控。因此，在顆粒細胞中，胰島素信號通過Akt1、FOXO1 和FOXO3 傳導，能夠增強類固醇生成和卵巢發育。Akt1 增強胰島素通過己糖胺途徑刺激葡萄糖轉運，卻抑制類固醇生成。膜細胞研究中證實胰島素信號通過Akt1能刺激磷酸二酯酶（PDE）抑制cAMP降解，并因此增強雄激素生成，胰島素在Akt1/FOXO1 作用下可刺激類固醇生成，通過mTOR或ERK途徑能夠促進細胞增殖和蛋白質合成，并抑制細胞凋亡。

卵泡發生是一個動態過程。大量試驗揭示，胰島素/FOXO1 途徑似乎對卵泡階段性發育具有特異性效應：小卵泡能夠刺激顆粒細胞增殖；中等大小的腔卵泡能夠刺激類固醇生成；排卵時閉鎖的卵泡受到刺激。但目前關于調控階段性、特定效應的報道相對罕見，因而針對FOXO1調控機制有待進一步研究和完善。本文綜述了胰島素-葡萄糖信號通路在哺乳動物卵泡發育過程中的調控機制，挖掘胰島素-葡萄糖信號途徑影響哺乳動物卵泡發育重要信息，以期為哺乳動物繁殖領域的相關研究提供一定參考。