六味能消制劑中非法成分土大黃苷檢測方法的建立

祁曉玲,張 煒,楊鳳梅

青海省藥品檢驗檢測院，青海省中藏藥現代化研究重點實驗室，國家藥品監督管理局中藥（藏藥）質量控制重點實驗室，西寧810016

六味能消制劑分為丸劑、膠囊劑、片劑3 種劑型。其處方由藏木香、干姜、訶子、大黃、寒水石、堿花6 味藥材組成。其主要功效為助消化、消腫、理氣和胃，用于食物中毒癥、積食不化、胃痛、胸腹腫脹、大便干燥的治療，還可用于高脂血癥及肥胖癥的治療。大黃為該處方中重要的藥味之一，收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版一部，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim. ex Balf. 或藥用大黃Rheum officinaleBaill. 的干燥根和根莖；具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃的功效［1］。近年來，大黃藥材資源無法滿足日益增長的市場需求，使得市場中出現用同屬不同種其他植物的根部冒充大黃的現象，存在非藥用大黃代替大黃投料的情況，如藏邊大黃、河套大黃、華北大黃、天山大黃、信州大黃、土大黃等，這些品種《中國藥典》未收藏，不可作為大黃藥用。偽品大黃來源廣、價格低，雖與大黃為同科植物，但其含土大黃苷，結構為二苯乙烯苷類，幾乎無瀉下作用，甚至會引發不良反應，故不可代替大黃藥用［2］。為了全面評價六味能消丸（膠囊、片）的產品質量和現行標準的可行性，警示六味能消丸（膠囊、片）存在的安全風險，本研究建立了用薄層色譜法（ thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對六味能消制劑中土大黃苷成分進行初篩及用高效液相色譜法-串聯質譜法（HPLC-MS）對檢出土大黃苷的陽性樣品進行進一步確證的方法［3-7］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000-TSQ Quantum Ultra 型液質聯用儀（三重四極桿，美國THERMO 公司）；島津LC-20ATVP 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，日本島津公司）；SQP 型百分之一電子天平、SQP 型萬分之一電子天平、MSA225-1CE-DI 型十萬分之一電子天平（德國Sartrious 公司）；DT-1028-CH 型超聲波提取器（ 德國 BANDELIN 公司）；LINOMAT 5 型半自動點樣儀、TLC VISUALIZER薄層數碼成像儀（瑞士卡瑪公司）；硅膠G 板（德國默克公司）。

1.2 試藥

土大黃苷對照品（批號110794-201909，中國食品藥品檢定研究院，供檢查用，批號R05J9F65074，HPLC 測定質量分數≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，均購自德國默克公司；水為超純水（用Milli-Q 超純水機自制）；其他試劑均為分析純。六味能消丸（膠囊、片）均為市售樣品，涉及4 家企業，共101 批次。

2 方法與結果

2.1 TLC 法初步篩查

2.1.1 對照品溶液的制備 取土大黃苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 土大黃苷的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為300 W，頻率為35 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取濾液5 mL 備用，其余濾液揮干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 對照藥材溶液的制備 取大黃對照藥材0.5 g，按照2.1.2 項下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 取原料藥材，按處方制得缺大黃的六味能消丸（膠囊、片）陰性樣品。取1 g，按照2.1.2 項下供試品溶液制備方法制成大黃陰性溶液。

2.1.5 模擬制劑溶液的制備 取原料藥材，按處方、工藝制得六味能消丸（膠囊、片）模擬制劑樣品。取1 g，按照2.1.2 項下供試品溶液制備方法制成模擬制劑溶液。

2.1.6 色譜條件及結果 吸取上述制備的供試品溶液、陰性對照溶液、模擬制劑溶液、大黃藥材溶液、土大黃苷對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10∶3.5∶0.2∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈365 nm 處檢視。用以上方法檢驗發現，A 企業生產的共13 個批次六味能消丸中有12 個批次樣品在與土大黃苷對照品色譜相應位置上檢出相應的斑點。其余3 個企業的六味能消丸（膠囊、片）中均未檢出土大黃苷，且陰性樣品無干擾。見圖1。

圖1 六味能消制劑薄層色譜圖-365 nm（默克板，26 ℃，40%）Fig. 1 TLC chromatograms of Liuwei Nengxiao preparationsunder 365 nm（Merck，26 ℃，40%）

2.1.7 TLC 考察

2.1.7.1 展開劑的選擇 本實驗共考察了2 種展開劑，展開劑1 為甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸（30∶5∶5∶20∶0.1），展開劑2 為二氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10∶3.5∶0.2∶0.3），結果用展開劑1 斑點分離較差，相較而言，用第2 種展開劑斑點分離較好，且陰性樣品在與土大黃苷對照品相應的位置上無干擾，見圖2。故將展開劑2 作為本方法的展開劑。

圖2 展開劑的比較（26 ℃，40%）Fig.2 Comparison of developing solvents（26 ℃，40%）

2.1.7.2 點樣量的選擇 吸取土大黃苷對照品溶液（0.2 mg·mL-1），分別點樣1、2、5、8、10 μL，條帶寬度約為8 mm；吸取供試品溶液（批號2020030101），分別點樣1、2、5、8、10 μL，條帶寬度約為8 mm，結果表明，對照品和供試品點樣量均為10 μL，薄層斑點清晰，分離效果較好。見圖3。

圖3 供試品薄層色譜圖-365 nm（默克板，26 ℃，40%）Fig.3 TLC chromatograms of samples-under 365 nm(Merck，26 ℃，40%)

2.1.7.3 耐用性考察 分別用青島海洋化工廠、德國默克公司的硅膠G 薄層板進行實驗，結果顯示，不同廠家生產的硅膠G 薄層板斑點均顯現清晰。見圖4。

圖4 六味能消制劑薄層色譜圖-365 nm（青島海洋板，24 ℃，35%）Fig.4 TLC chromatograms of Liuwei Nengxiao preparations-under 365 nm (plate: Qingdao Ocean，24 ℃，35%)

2.1.7.4 檢測限 吸取土大黃苷對照品溶液（0.2 mg·mL-1），分別點樣1、2、5、8、10 μL（即0.2、0.4、1.0、1.6、2.0 μg），條帶寬度約為8 mm；吸取供試品溶液（批號2020030101），分別點樣1、2、5、8、10 μL（即0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg），按照2.1.6 項下條件檢視，以人眼可檢視到的最低斑點點樣量計［8］，得到土大黃苷的檢測限(limit of detection, LOD)為0.2 μg，見圖5。但由于人眼對于不同顏色的辨識存在一定差異，不同操作人員可能得出不同的結果，故在實際操作中，仍需用HPLC-MS 進行進一步確證。

圖5 LOD 薄層色譜圖-365 nm（默克板，26 ℃，40%）Fig.5 TLC chromatograms of LOD-under 365 nm(Merck，26 ℃，40%)

2.2 HPLC 法初步確認

2.2.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱Agilent Extend-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相為甲醇-水（30∶70）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為324 nm（將配制好的土大黃苷對照品溶液進行吸收波長掃描，結果土大黃苷在（324±2）nm 波長處有最大吸收，故選擇324 nm 為檢測波長）。見圖6。

圖6 土大黃苷的紫外吸收圖Fig.6 UV absorption spectrum of rhaponticin

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取土大黃苷對照品18.14 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得儲備液。精密量取儲備液3 mL，置于50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得（每1 mL 約含土大黃苷10.66 μg）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取2.1.2 項下供試品溶液的備用濾液，即得。

2.2.4 大黃藥材溶液的制備 取大黃對照藥材、各廠家提供的大黃1 g，按照2.1.3 項下對照藥材溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 陰性對照溶液的制備 取2.1.4 項下陰性對照溶液的備用濾液，即得。

2.2.6 模擬制劑溶液的制備 取2.1.5 項下模擬制劑溶液的備用濾液，即得。

2.2.7 提取溶劑的選擇 分別考察了2 種常用的提取溶劑甲醇、乙醇，取供試品（批號2020030101），按照2.1.2 項下溶液制備方法制備，注入高效液相色譜儀，結果顯示，用甲醇提取的供試品色譜峰峰面積為4 021 589，理論塔板數為8 474；用乙醇提取的供試品峰面積為1 845 996，理論塔板數為4 480，用甲醇提取的供試品色譜峰峰面積和理論塔板數均較高，故選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2.8 專屬性考察 按照2.2.1 項下色譜條件，分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測得陽性樣品中呈現與土大黃苷對照品保留時間一致的色譜峰，且陰性無干擾。見圖7 至圖10。再用二極管陣列檢測比較相應色譜峰在200～400 nm 波長范圍內的紫外-可見吸收光譜，測得土大黃苷對照品與陽性樣品吸收光譜在（324±2） nm 處均有最大吸收，由此可判斷二者為同一物質。見圖6、圖11。

圖7 土大黃苷對照品的HPLC 圖Fig.7 HPLC chromatogram of rhaponticin reference

圖8 大黃對照藥材的HPLC 圖Fig.8 HPLC chromatogram of Rheum palmatum

圖9 陰性樣品HPLC 圖Fig.9 HPLC chromatogram of negative sample

圖10 陽性樣品的HPLC 圖Fig.10 HPLC chromatogram of positive sample

圖11 陽性樣品的紫外吸收圖Fig.11 UV absorption spectrum of positive sample

2.2.9 線性考察 精密吸取不同質量濃度的土大黃苷對照品溶液（2.13、4.26、8.53、12.79、17.06、21.32 μg·mL-1）10 μL，分別在2.2.1項下色譜條件下測定，以土大黃苷對照品質量濃度為橫坐標（x，μg·mL-1），以峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，土大黃苷在2.13～21.32 μg·mL-1范圍內回歸方程為y=39 904x-747.42（r=0.999 9），表明線性關系良好。

2.2.10 LOD 取2.2.2 項下的土大黃苷對照品儲備液，逐步稀釋成85.33 ng·mL-1的對照品溶液。吸取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀，計算得信噪比為3∶1，確定85.33 ng·mL-1為儀器檢出限，故方法LOD 為4.266 μg·g-1。

2.2.11 精密度實驗 精密吸取2.2.2 項下的土大黃苷對照品（質量濃度約為10.66 μg·mL-1），按照2.2.1 項下色譜條件連續進樣5 次，測得土大黃苷保留時間的RSD 值為0.29%，峰面積的RSD 值為0.47%，結果表明精密度良好。

2.2.12 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按照2.2.1 項下色譜條件進樣測定峰面積，測得土大黃苷峰面積的RSD 值為0.31%，表明供試品中土大黃苷在24 h內穩定性良好。

2.2.13 重復性實驗 取同一份供試品，精密稱取6 份，按照2.1.2 項下方法制成供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件測定，測得土大黃苷含量平均值為0.039%，RSD 值為0.16%，表明實驗的重復性良好。

2.2.14 加樣回收實驗 取陰性樣品1.0 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入質量濃度為26.08 μg·mL-1的土大黃苷對照品溶液50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為35 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液作為供試品溶液，進樣10 μL，測定，計算回收率，結果表明本方法的準確度良好。見表1。

表1 土大黃苷的加樣回收率實驗結果 （n=6）Tab.1 Results of rhaponticin recovery test (n=6)

表2 六味能消制劑中土大黃苷的檢查結果Tab.2 Results of rhaponticin in Liuwei Nengxiao preparations

2.2.15 耐用性實驗 由于不同生產廠家的高效液相色譜儀和色譜柱存在性能上的差異，為考察方法的可行性及通用性，對供試品還進行了耐用性實驗：①用不同廠家生產的色譜柱；②在不同的儀器上測定。結果表明耐用性較好。見圖12、圖13。圖12、圖13 分別為Waters e2695-2998 型高效液相色譜儀、Waters X-Bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱所得色譜圖。

圖12 土大黃苷對照品的HPLC 圖Fig.12 HPLC chromatogram of rhaponticin reference

圖13 陽性樣品的HPLC 圖Fig.13 HPLC chromatogram of positive sample

2.2.16 樣品測定 取六味能消丸（膠囊、片）樣品適量，按照2.1.2 項下方法制成供試品溶液，用2.2.1項下色譜條件測定，結果在4 家企業共101 批次樣品中，A 企業生產的12 個批次樣品中檢出土大黃苷色譜峰，且紫外吸收光譜一致，呈陽性檢出，該結果與TLC 檢測結果一致。其余3 個企業樣品中均未檢出土大黃苷色譜峰。

2.3 HPLC-MS 方法驗證

2.3.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD AQ C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；以乙腈（A）-1 mL·L-1甲酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～6 min，20% A～44% A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃。

2.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（electrospray Ionization，ESI），離子源溫度為110 ℃；毛細管溫度為250 ℃；鞘氣流速為20 L·min-1；輔助氣流速為10 L·min-1；噴霧電壓為3 500 V；錐孔電壓為40 V；碰撞能量（collision energy，CE）為30 V；正離子掃描模式，掃描模式分為Full Scan（一級全掃描）和Product Scan（二級全掃描）；一級全掃描質量范圍m/z400～500，二級全掃描質量范圍m/z100～300。

2.3.3 對照品溶液的制備

同2.2.2 項下對照品溶液制備方法。

2.3.4 供試品溶液的制備

取2.1 項下TLC 和2.2 項下HPLC 法檢出土大黃苷的供試品溶液，即得。

2.3.5 陽性對照溶液的制備

取2.1 項下TLC 和2.2 項下HPLC 法未檢出土大黃苷的樣品1 g，加入0.2 mg·mL-1土大黃苷甲醇溶液2.5 mL，同2.1.2 項下供試品溶液的制備方法，取濾液，即得。

2.3.6 陰性對照溶液的制備

取2.1 項下TLC 和2.2 項下HPLC 法未檢出土大黃苷的供試品溶液，即得。

2.3.7 空白試劑溶液的制備

取甲醇作為空白試劑溶液。

2.3.8 測定條件

按照上述色譜及質譜條件，分別精密吸取上述溶液各5 μL，注入液質聯用儀，測定，即得。供試品溶液一級全掃描（full scan）和二級全掃描（product scan）總離子流圖中，不得出現與土大黃苷對照品保留時間相同的離子峰。若供試品總離子流圖中出現與土大黃苷對照品保留時間相同的離子峰，則核對供試品一、二級質譜圖是否與土大黃苷對照品一致，如完全一致，則判定檢出土大黃苷。

2.3.9 LC-MS/MS 分析

2.3.9.1 LC-MS/MS 裂解規律 按照上述色譜及質譜條件測定分析，土大黃苷對應的一級總離子流圖中檢出分子離子峰［M+H］+（m/z=421.2）及［M+Na］+（m/z=443.1），經對［M+H］+（m/z=421.1）準分子離子進行二級質譜子離子掃描，檢出碎片離子峰［M-glu+H］+（m/z=259.1）及m/z=227.0、199.1、181.1、135.0、107.1，其中m/z=259.1和m/z=199.1 豐度比較高，選定為定性離子對。

2.3.9.2 LC-MS/MS 測定結果 一級全掃描（full scan）：按上述方法測定，土大黃苷對照品一級全掃描總離子流圖中在保留時間為2.5 min 時檢出分子離子峰［M+H］+（m/z=421.2）；供試品溶液、陽性對照溶液均檢出與土大黃苷對照品保留時間相同的分子離子峰［M+H］+（m/z=421.2）；陰性對照溶液未檢出與土大黃苷對照品保留時間相同的離子峰。見圖14至圖18。

圖14 土大黃苷對照品的一級TIC 圖及質譜圖Fig.14 The full scan of TIC and mass spectra of rhaponticin reference

圖15 供試品（批號2020030101）的一級TIC 圖及質譜圖Fig.15 The full scan of TIC and mass spectra of sample (lot number 2020030101)

圖16 陽性對照溶液的一級TIC 圖及質譜圖Fig.16 The full scan of TIC and mass spectra of positive control

圖17 陰性對照溶液的一級TIC 圖Fig.17 The full scan of TIC and mass spectra of negative control

圖18 空白試劑溶液的一級TIC 圖Fig.18 The full scan of TIC and mass spectra of blank reagent

圖19 土大黃苷對照品的二級TIC 圖及質譜圖Fig.19 The product scan of TIC and mass spectra of rhaponticin reference

二級質譜（Product Scan）：對土大黃苷對照品、供試品、陽性對照溶液進行二級質譜分析，均檢出保留時間為2.5 min 的分子離子峰，且二級質譜碎片質量分數和豐度比基本一致，主要二級碎片離子均包括［M-glu+H］+（m/z=259.1）及m/z=227.0、199.1、181.1、135.0、107.1。見圖20 至圖22。

圖20 供試品（批號2020030101）的二級TIC 圖及質譜圖Fig.20 The product scan of TIC and mass spectra of a sample (lot number 2020030101)

圖21 陽性對照溶液的二級TIC 圖及質譜圖Fig.21 The product scan of TIC and mass spectra of positive control

圖22 土大黃苷對照品的定性離子掃描TIC 及質譜圖Fig.22 The MRM of TIC and mass spectra of rhaponticin reference

定性離子對選擇掃描（MRM）：對土大黃苷對照品、供試品、陽性對照溶液進行定性離子選擇掃描，分子離子峰m/z=421.2，二級質譜碎片離子m/z=259.1和m/z=199.1。結果均檢出保留時間為2.5 min 的分子離子峰，且選擇碎片離子豐度比基本一致。見圖23 至圖24。

圖23 供試品（批號2020030101）的定性離子掃描TIC 及質譜圖Fig.23 The MRM of TIC and mass spectra of a sample (lot number 2020030101)

圖24 陽性對照溶液的定性離子掃描TIC 及質譜圖Fig.24 The qualitative ion scan and mass spectra of positive control

2.3.9.3 液質聯用法驗證的結果 根據建立的液質聯用方法，12 個批次的供試品全部檢出與土大黃苷對照品保留時間相同的分子離子峰，一、二級質譜圖基本一致，碎片離子質量分數和豐度比基本一致；同時用定性離子對選擇掃描進一步驗證，也均檢出相應的分子離子峰，呈陽性檢出，結果與薄層色譜、液相色譜結果一致。

對此次六味能消制劑抽檢涉及的各廠家提供的大黃藥材用了相同的液質方法進行驗證，結果各廠家的大黃藥材中均未檢出與土大黃苷相應的離子峰。

3 討論

3.1 樣品檢測結果分析

用所建立的方法對4 個企業101 批次六味能消丸（膠囊、片）進行檢測，其中A 企業生產的12 批次六味能消丸中檢出土大黃苷。結果表明，部分企業在生產六味能消制劑過程中存在大黃藥材未按處方規范投料的問題，表明A 企業的大黃藥材質量可能存在嚴重問題。生產企業一方面可能由于價格等因素，為追求利益，降低生產成本而使用偽大黃投料；另一方面對藥材的質量重視不夠，未按《中國藥典》或企業內控標準對購進的大黃進行全檢，用含土大黃苷的非藥用大黃代替大黃投料。生產企業在投料中使用非藥用大黃投料，勢必將造成質量和安全風險，影響藥品療效。

3.2 意見與建議

由于現行六味能消丸（膠囊、片）標準中無針對大黃中土大黃苷的薄層鑒別或含量測定等檢驗項目，造成部分生產企業對大黃藥材質量不夠重視，故存在以次充好的可能性。因此，建議在現行六味能消丸（膠囊、片）的標準中增加土大黃苷檢查項，以保證該品種生產規范、質量可控，防止有問題的藥品流入市場。本研究建立的方法已申報國家藥品監督管理局，擬作為六味能消丸（膠囊、片）中土大黃苷檢查項補充檢驗方法。