苦瓜中葫蘆烷型三萜成分及其抗肝纖維化活性的研究

岳佳音,徐 靜,張曉書,趙余慶

1.沈陽醫學院藥學院，沈陽 110034；2.沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，沈陽 110016

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種急、慢性肝病共同的病理基礎，主要特征為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足且過度沉積［1］。肝纖維化進一步發展會演變為肝硬化甚至肝癌［2-3］，將嚴重影響患者的生活質量。在肝損傷期間，靜止的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）表型轉化成激活型并增殖，活化的HSC 是ECM 的主要來源細胞，因此抑制活化的HSC 增殖是治療肝纖維化的有效途徑。

苦瓜（Momordica charantiaL. ）系葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬植物苦瓜的未成熟果實［4］，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，在許多國家和地區均有入藥記載?，F代藥理學研究表明，苦瓜具有降血糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒等作用［5-7］。自20 世紀60年代起，國內外學者開始對苦瓜的化學成分進行研究，隨著分離手段和波譜技術的不斷進步，目前分離得到的成分主要有酚類、黃酮類、三萜類、蛋白質及多糖等［8］，其中葫蘆烷型三萜化合物被認為是苦瓜中主要的活性成分，有抗腫瘤、降血糖、抗炎等多種生物活性［9-12］。本課題組前期研究發現，苦瓜中的葫蘆烷型三萜類成分能較好地抑制活化HSC 的增殖［13］。酸水解處理苦瓜乙醇提取物不但能富集一種或幾種活性好的苷元，還可能發現更多活性好的新苷元［14］。為進一步從苦瓜中獲得更好的活性成分，本實驗對苦瓜乙醇提取物酸水解后的化學成分進行系統研究，從中分離并鑒定出10 個葫蘆烷型三萜化合物（結構見圖1），并用四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium， MTT）法對化合物1～7 進行大鼠活化的肝星狀細胞t-HSC/Cl-6 的抑制增殖活性進行測定，其中化合物1 和化合物2具有一定抑制t-HSC/Cl-6 增殖的作用。

圖1 化合物1～10 的結構Fig.1 Structures of compounds 1—10

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker ARX-400 型核磁共振波譜儀、Bruker-IFS-55 紅外光譜儀、Bruker MicrOTOF-Q 高分辨電噴霧質譜儀均購自德國Bruker 公司；MOS 450 AF/CD 旋光測定儀（法國BioLogic 公司）；LC3000 型半制備高效液相色譜儀（北京創新通恒科技有限公司）；UV2800AH 型紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；酶標儀（美國 Bio-Rad 公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；薄層硅膠GF254（青島海洋化工有限公司）；半制備色譜柱：YMCODS-A（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）；Sephedex HL-20 葡聚糖凝膠（瑞典GE-healthcare bio-sciences AB 公司）；MCI gel（75～150 μm，日本Mitsubishi 公司）。

1.2 試藥

氘代氯仿、氘代吡啶均購自北京市漢威士波譜公司；色譜級甲醇、乙腈均購自天津康科德科技有限公司；其余常規試劑均為分析純。DMEM 細胞培養基（HyClone 公司）；水飛薊素（silymarin，質量分數為98%、MTT、二甲基亞砜均購自美國Sigma 公司；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；大鼠肝纖維化細胞t-HSC/Cl-6 株（中國科學院細胞庫）?？喙细稍镲嬈?013年購自廣西柳州，由沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定為葫蘆科植物苦瓜Momordica charantiaL. 的干燥未成熟果實。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取苦瓜干燥未成熟果實飲片10 kg，用80 L 體積分數為70%的乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液濃縮至干，用水分散后，靜置冷卻，得到不溶于水的浸膏220 g。稱取浸膏100 g，用3 倍量甲醇溶解，得樣品溶液，加入100 mL 鹽酸水解，超聲30 min，靜置3 d，加大量水稀釋，離心，取沉淀于50 ℃干燥，稱定質量，得水解產物48 g。

將鹽酸水解產物（48 g）用硅膠柱進行層析分離，濕法裝入480 g 300～400 目硅膠，干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（50∶1、25∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1）。經薄層色譜法檢識，用體積分數為5%的香草醛溶液顯色，合并相同主斑點后得到6 個主要流份（Fr.A～Fr.F）。Fr.A 以石油醚為溶劑多次重結晶后，用半制備高效液相色譜純化（體積分數為89%的甲醇），得到化合物3（50.1 mg）。Fr.B 經硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1）梯度洗脫，得到7 個流份（Fr.B1～Fr.B7）。 Fr.B4 經Sephadex LH-20 凝膠柱層析（體積分數為100%的甲醇） 洗脫，再用反相半制備HPLC 純化（體積分數為83%的甲醇），得到化合物1（5.4 mg）和化合物2（4.6 mg）。Fr.C 經硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（100∶1、50∶1、20∶1、3∶1）梯度洗脫，得到8 個流份（Fr.C1～Fr.C8）。Fr.C5 經Sephadex LH-20 凝膠柱層析（體積分數為100%的甲醇）洗脫，再用HPLC 半制備高效液相色譜純化（體積分數為89%的甲醇），得到化合物4（9.0 mg）、化合物6（15.0 mg）、化合物10（6.5 mg）。Fr.D 以石油醚-乙酸乙酯（10∶1）等度洗脫，得到5 個流份（Fr.D1～Fr.D5）。Fr.D3 經反相半制備HPLC 純化（體積分數為89%的甲醇），得到化合物7（11.3 mg）。Fr.F 經MCI 柱色譜進一步分離，以甲醇-水為流動相梯度洗脫（30∶70、50∶50、70∶30、90∶10、100∶0），得到5 個流份（Fr.F1～Fr.F5）。Fr.F3經過反相半制備HPLC 純化（體積分數為89%的甲醇），分別得到化合物5（9.3 mg）、化合物8（23.8 mg）和化合物9（6.8 mg）。

2.2 結構鑒定

化合物3：白色無定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.03（1H，dd，J= 9.7，1.9 Hz，H-6），5.63（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），5.50（1H，m，H-23），δ5.39（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），3.50（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），1.19（3H，s，CH3-29），0.90（3H，s，CH3-21），0.88（3H，s，CH3-28），0.86（3H，s，CH3-30），0.85（3H，s，CH3-18）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.7（C-1），27.5（C-2），76.3（C-3），37.3（C-4），87.6（C-5），131.9（C-6），131.6（C-7），52.1（C-8），45.4（C-9），39.0（C-10），23.7（C-11），30.9（C-12），45.6（C-13），48.7（C-14），33.3（C-15），28.1（C-16），50.4（C-17），15.1（C-18），80.0（C-19），36.2（C-20），18.8（C-21），39.5（C-22），128.5（C-23），137.0（C-24），75.0（C-25），25.9（C-26），26.3（C-27），20.7（C-28），24.7（C-29），20.2（C-30），50.1（25-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為5β，19-epoxy-25-methoxycucurbita-6，23（E）-dien-3β-ol［17］。

化合物4：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH：5.83（1H，dd，J= 4.9 Hz，H-6），5.50（1H，m，H-23），5.38（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.34（3H，s，7-OCH3），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），0.89（3H，d，6.1 Hz，CH3-21），1.20，1.03，0.98，0.92，0.69（各3H，s，CH329，28，19，18，30-）。13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δC：21.2（C-1），28.7（C-2），76.9（C-3），41.9（C-4），146.9（C-5），121（C-6），77.3（C-7），48.1（C-8），34.1（C-9），38.8（C-10），32.7（C-11），30.2（C-12），46.2（C-13），48.0（C-14），34.8（C-15），27.7（C-16），50.1（C-17），15.6（C-18），28.9（C-19），36.3（C-20），18.9（C-21），39.6（C-2），128.6（C-23），136.9（C-24），75.0（C-25），26.2（C-26），25.9（C-27），27.9（C-28），25.5（C-29），18.1（C-30），56.4（7-OCH3），50.4（25-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為karavilagenin A［18］。

化合物5：白色無定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.11（1H，d，J= 15.8 Hz，H-24），6.03（2H，dd，J= 9.7，1.6 Hz，H-6），5.58（1H，m，H-23），5.63（2H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-5），4.85（2H，s，H-26），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.51（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），1.19（3H，s，CH3-28），0.89（6H，s，CH3-29，CH3-30），0.88（3H，s，CH3-18），0.86（3H，s，CH3-27）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.6（C-1），27.4（C-2），76.2（C-3），37.2（C-4），87.5（C-5），131.8（C-6），131.5（C-7），52.0（C-8），45.3（C-9），38.8（C-10），23.6（C-11），30.8（C-12），45.5（C-13），48.6（C-14），33.2（C-15），28.1（C-16），50.3（C-17），14.9（C-18），79.9（C-19），36.6（C-20），18.7（C-21），39.8（C-22），129.2（C-23），134.2（C-24），142.2（C-25），114.2（C-26），18.7（C-27），20.5（C-28），24.6（C-29），20.1（C-30）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為（23E）-5β，19-epoxycucurbita-6，23，25-triene-3β-ol［19］。

化合物6：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.14（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.97（2H，m，H-23，H-24），5.62（1H，dd，J= 9.7，2.9 Hz，H-7），1.56（3H，s，H-27），1.56（3H，s，H-26），1.39（3H，s，H-28），0.97（3H，d，J= 5.9 Hz，H-21），0.90（3H，s，H-29），0.82（3H，s，H-18），0.77（3H，s，H-30）。13CNMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：18.4（C-1），28.4（C-2），76.6（C-3），38.0（C-4），88.0（C-5），132.8（C-6），131.8（C-7），52.5（C-8），45.8（C-9），39.6（C-10），24.2（C-11），31.3（C-12），46.0（C-13），49.1（C-14），33.7（C-15），28.5（C-16），50.5（C-17），15.4（C-18），80.2（C-19），36.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.4（C-27），25.0（C-28），21.4（C-29），20.6（C-30）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為23E-5β，19-epoxy-cucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［20］。

化合物7：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.40（1H，dd，J=9.7，2.1 Hz，H-6），5.69（1H，dd，J= 9.7，3.3 Hz，H-7），5.62（1H，m，H-23），5.58（1H，br. s，H-24），3.23（3H，s，25-OCH3），1.49（3H，s，H-29），1.34（3H，s，H-26），1.34（3H，s，H-27），0.96（3H，d，J= 4.0 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-28），0.87（3H，s，H-30），0.83（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：19.5（C-1），28.0（C-2），75.2（C-3），38.1（C-4），85.1（C-5），133.5（C-6），133.0（C-7），45.3（C-8），51.4（C-9），41.1（C-10），22.4（C-11），30.5（C-12），45.7（C-13），48.7（C-14），33.8（C-15），28.1（C-16），50.8（C-17），15.0（C-18），182.3（C-19），36.7（C-20），19.2（C-21），40.2（C-22），128.7（C-23），138.1（C-24），75.3（C-25），26.5C-26），26.9（C-27），24.2（C-28），21.3（C-29），19.7（C-30），50.5（25-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為25-Omethylkaravilagein D［21］。

化合物8：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.25（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.66（1H，m，H-7），5.64（1H，m，H-24），5.54（1H，m，H-23），3.23（6H，s，7-OCH3，25-OCH3），1.51（3H，s，H-29），1.35（6H，s，H-26，H-27），1.17（3H，s，H-28），0.99（3H，d，J= 5.5 Hz，H-21），0.94（3H，s，H-18），0.83（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.0（C-1），30.2（C-2），76.0（C-3），42.3（C-4），148.1（C-5），121.4（C-6），76.1（C-7），46.2（C-8），50.6（C-9），37.1（C-10），23.0（C-11），29.7（C-12），46.3（C-13），48.3（C-14），35.4（C-15），28.0（C-16），50.6（C-17），15.4（C-18），207.6（C-19），36.7（C-20），19.3（C-21），40.1（C-22），128.8（C-23），138.1（C-24），75.2（C-25），26.5（C-26），26.9（C-27），27.7（C-28），26.6（C-29），18.6（C-30），56.3（7-OCH3），50.6（25-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為（23E）-3β-hydroxy-7β，25-dimethoxycucurbita-5，23-dien-19-al［22］。

化合物9：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：5.83（1H，d，J= 5.0 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），3.50（1H，m，H-3），3.43（1H，d，J=5.8 Hz，H-7），3.33（3H，s，7-OCH3），1.29（6H，s，H-26，H-27），1.20（3H，s，H-29），1.03（3H，s，H-28），0.97（3H，s，H-19），0.91（3H，s，H-18），0.88 （3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.69（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.2（C-1），29.6（C-2），76.5（C-3），42.4（C-4），148.5（C-5），120（C-6），78.0（C-7），49.3（C-8），34.8（C-9），39.8（C-10），33.3（C-11），30.8（C-12），46.7（C-13），48.7（C-14），35.4（C-15），28.3（C-16），50.1（C-17），16.0（C-18），30.6（C-19），37.1（C-20），19.4（C-21），40.0（C-22），124.7（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.3（C-27），28.8（C-28），26.7（C-29），18.5（C-30），56.6（7-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為karavilagenin B［18］。

化合物10：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.33（1H，dd，J= 9.7，2.1 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），5.50（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），4.57（1H，s，H-19），3.38（3H，s，19-OCH3），1.56（3H，s，H-26），1.56（3H，s，H-27），0.97（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），1.41，0.91，0.83，0.80（各3H，s，CH3-29，28，18，30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：17.5（C-1），28.2（C-2），76.7（C-3），37.9（C-4），85.7（C-5），134.0（C-6），130.9（C-7），50.2（C-8），49.7（C-9），38.6（C-10），22.3（C-11），31.3（C-12），45.7（C-13），48.6（C-14），34.0（C-15），28.4（C-16），50.7（C-17），15.5（C-18），115.3（C-19），37.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.0（C-26），31.0（C-27），24.8（C-28），21.0（C-29），20.5（C-30），57.6（19-OCH3）。以上波譜數據與相關文獻報道的一致，故鑒定其為（19S，23E）-5β，19-epoxy-19-methoxycucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［23］。

2.3 化合物體外抗肝纖維化活性的篩選

用 MTT 法測定單體化合物1～7 對t-HSC/Cl-6細胞增殖的抑制作用，選用水飛薊素作為陽性對照藥，將化合物配制成濃度為0、10、30、60、100 μmol·L-1的溶液進行實驗。

取對數生長期的大鼠肝纖維化細胞t-HSC/Cl-6 細胞，經胰酶消化后接種于96 微孔板上，于37 ℃下恒溫培養12 h 后，除去培養液，每孔加入不同濃度藥物10 μL，每組設3 個復孔。在37 ℃、體積分數為5% 的CO2下恒溫培養48 h 后，加入質量濃度為5 mg·mL-1的MTT 溶液10 μL，在37 ℃下恒溫培養4 h 后，小心吸棄孔內上清液，每微孔加入DMSO 100 μL，輕微振搖后放置15 min，使甲瓚結晶能夠充分被DMSO 溶解。將96 微孔板置于酶標儀上，在490 nm 波長處檢測各孔的吸光度（A）值。并計算IC50值，結果見表1。結果表明，化合物1 和化合物2 對t-HSC/Cl-6 細胞具有一定的抑制活性（IC50＜ 30.0 μmol·L-1）。

表1 化合物1～7 對t-HSC/Cl-6 細胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

表1 化合物1～7 對t-HSC/Cl-6 細胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

化合物1234 IC50/（μmol·L-1）25.9 ± 2.6 26.2 ± 2.8 79.5 ± 4.4 31.2 ± 2.0化合物567 silymarin IC50/（μmol·L-1）38.8 ± 5.7 137.1 ± 6.4 130.2 ± 5.4 195.5 ± 22.6

3 討論

本文對苦瓜未成熟果實酸水解后的化學成分及其抗肝纖維化活性進行了研究，得到了10 個葫蘆烷型三萜皂苷元，化合物1 和化合物2 為首次從該植物中分離得到?；钚院Y選發現化合物1 和化合物2 對t-HSC/Cl-6 細胞有明顯的增殖抑制活性，其余化合物也對t-HSC/Cl-6 細胞有不同程度的增殖抑制活性。就目前報道的從苦瓜中得到的葫蘆烷型化合物而言，根據其母核結構特點，可分為兩大類：第一類的主要特征是C-5 與C-19 位由一個氧連接形成呋喃環，且C-6 和C-7 之間形成雙鍵，再根據C-3、C-7 和C-19 位上的氧化程度加以區分；第二類的主要特征是C-5 和C-6 之間形成雙鍵，再根據C-19 位上的氧化程度不同加以區分。母核結構不同，構效關系也不同，比如化合物1～3、5～7，屬于第一類母核結構的化合物，分析結構與活性發現在該母核結構中，側鏈有2 個雙鍵形成共軛結構化合物的活性要優于側鏈僅有1 個雙鍵的化合物，表明共軛結構能夠增強葫蘆烷型化合物對t-HSC/Cl-6 細胞的增殖抑制活性。對構效關系更深入地研究將擴大葫蘆烷型化合物的結構多樣性，未來會進一步探討。